釀酒酵母菌誘導(dǎo)SBD-1mRNA表達(dá)的研究

金 鑫 ， 張 曼 ， 田巧珍 ， 劉 驕 ， 王云鶴 ， 楊銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ，內(nèi)蒙古呼和浩特010018 )

釀酒酵母菌誘導(dǎo)SBD-1mRNA表達(dá)的研究

金 鑫 ， 張 曼 ， 田巧珍 ， 劉 驕 ， 王云鶴 ， 楊銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ，內(nèi)蒙古呼和浩特010018 )

為了探索益生性釀酒酵母菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1, SBD-1)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。建立綿羊瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系作為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用不同濃度釀酒酵母菌?duì)體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞刺激2 h后分別進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)研究接受刺激后瘤胃上皮細(xì)胞中SBD-1 mRNA表達(dá)的差異。結(jié)果表明，在各時(shí)間組內(nèi)，SBD-1 mRNA的表達(dá)量隨著菌液濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)菌液濃度為5.2 × 107CFU/mL時(shí)表達(dá)量均達(dá)到最大，并與對(duì)照組和其他濃度組相比差異極顯著(P﹤0.01)。當(dāng)菌液濃度一定時(shí)，SBD-1 mRNA的表達(dá)量先是隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢(shì)。因此，當(dāng)濃度為5.2 × 107CFU/mL的菌液誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞12 h時(shí)，SBD-1基因的表達(dá)量達(dá)到最高，且與此濃度下其他時(shí)間組的表達(dá)量相比差異極顯著(P﹤0.01)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，釀酒酵母菌能夠誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1的表達(dá)，且濃度為5.2 × 107CFU/mL的菌液誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞12 h時(shí)，SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高。

β-防御素-1 ； 瘤胃上皮細(xì)胞 ； 釀酒酵母菌 ； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR ； 綿羊

防御素是一種存在于生物界中具有廣譜抗微生物活性的陽(yáng)離子內(nèi)源性抗菌肽[1]。β-防御素作為防御素家族中的一大成員，廣泛存在于哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)體內(nèi)[2-3]，主要由各器官上皮細(xì)胞產(chǎn)生[4]。在綿羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有兩種β-防御素存在，即 SBD-1、SBD-2[5]，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)顯示，SBD-2 mRNA只表達(dá)于舌和遠(yuǎn)端回腸，而SBD-1 mRNA在氣管和整個(gè)消化道都有表達(dá)，并且在瘤胃中表達(dá)量較多[6-7]。由此提示，β-防御素是綿羊瘤胃天然免疫的重要組成部分。

益生菌作為一種重要的綠色飼料添加劑，已廣泛用于畜禽飼料中以提高動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能[8]。農(nóng)業(yè)部2013年修訂的《飼料添加劑品種目錄》中新增加了4個(gè)品種，其中3個(gè)與益生性釀酒酵母菌有關(guān)(釀酒酵母培養(yǎng)物、釀酒酵母提取物、釀酒酵母細(xì)胞壁)[9]，益生菌粘附并定植于腸道上皮細(xì)胞是其發(fā)揮益生作用的前提，上皮細(xì)胞是益生菌發(fā)揮益生作用的重要扮演者[10]。而釀酒酵母菌與瘤胃上皮細(xì)胞相互作用過(guò)程中抗菌肽的表達(dá)變化尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此本試驗(yàn)采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)釀酒酵母菌對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1 mRNA表達(dá)的影響。為從益生菌與上皮細(xì)胞抗菌肽表達(dá)關(guān)系的新角度解析防御素發(fā)揮非特異性免疫的新途徑和機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自呼和浩特市北亞屠宰場(chǎng)健康狀況良好的綿羊，試驗(yàn)所用釀酒酵母菌菌株，購(gòu)自中國(guó)微生物菌種網(wǎng)(編號(hào)：CGMCC2.161)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 試驗(yàn)在借鑒前人[11-13]培養(yǎng)RECs經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)綿羊RECs的培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)。將瘤胃組織用0.25% 胰酶在37 ℃溫箱中進(jìn)行不同時(shí)間的連續(xù)消化，并將所得細(xì)胞于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。大約96 h后，培養(yǎng)的上皮細(xì)胞已貼壁，此時(shí)更換新的完全培養(yǎng)基，之后每?jī)商鞊Q液1次。當(dāng)原代細(xì)胞數(shù)量長(zhǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶的80%～90%以上時(shí)，便可將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳于12孔板用于后續(xù)的細(xì)胞誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2 釀酒酵母菌對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)試驗(yàn) 將傳代細(xì)胞用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行24 h饑餓處理后，用無(wú)雙抗的PBS洗滌3次，然后向細(xì)胞板中每孔加入900 μL 的無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基，并分別加入100 μL濃度為5.2×108、5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU/mL的釀酒酵母菌液作為試驗(yàn)組和DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，置37 ℃溫箱刺激2 h。分別刺激2 h后，吸去培養(yǎng)基，用含兩性霉素B的PBS洗滌3次，重新加入含兩性霉素B、無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基以殺死殘存的活菌，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2、4、8、12、24 h后分別提取各組總RNA。

1.2.3 RT-qPCR 根據(jù)GenBank公布的SBD-1基因和管家基因β-Actin序列用DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列

以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。每個(gè)樣品的SBD-1基因和β-Actin基因分別做5個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線的Ct值計(jì)算SBD-1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 SBD-1 mRNA表達(dá)水平的計(jì)算 試驗(yàn)在同一批次細(xì)胞內(nèi)重復(fù)5次，將RT-qPCR得到的SBD-1基因和β-Actin基因的Ct值，根據(jù)公式2-ΔCt[14]求出添加不同濃度釀酒酵母菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-1基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(SBD-1)-Ct(β-Actin)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 傳代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，4 d后細(xì)胞即有90%以上聚集生長(zhǎng)，長(zhǎng)成漩渦狀排列的致密單層細(xì)胞集落，同時(shí)細(xì)胞界限較為清晰，胞漿呈顆粒狀，核圓而大(如圖1)。

圖1 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

2.2 釀酒酵母菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 數(shù)據(jù)處理后經(jīng)SAS9.2軟件分析，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)用不同濃度的菌液分別刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞 2 h后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2、4、8、12、24 h，在各誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間組內(nèi)隨著菌液刺激濃度的增加SBD-1 mRNA的表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)菌液刺激濃度為5.2×107CFU/mL時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，并與對(duì)照組和其他濃度組相比差異均極顯著(P<0.01)。當(dāng)刺激菌液濃度為5.2×104CFU/mL、誘導(dǎo)培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞4 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最大，極顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)2、24 h組(P<0.01)，但與誘導(dǎo)培養(yǎng)8、12 h組相比差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)菌液刺激濃度為5.2×105、5.2×106、5.2×107、5.2×108CFU/mL時(shí)，SBD-1 mRNA的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最大，之后呈下降趨勢(shì)。因此，當(dāng)刺激濃度為5.2×107CFU/mL的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞12 h時(shí)，SBD-1基因的表達(dá)量達(dá)到最高，且與此濃度下其他誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間組的表達(dá)量相比差異均極顯著(P<0.01)。

圖2 釀酒酵母菌對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1 mRNA表達(dá)的時(shí)間和濃度依賴(lài)關(guān)系**：P < 0.01，與空白組比較

3 討論

為了揭示益生菌濃度、刺激時(shí)間、防御素表達(dá)量三者之間的關(guān)系，本試驗(yàn)從mRNA水平對(duì)SBD-1基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1的表達(dá)作用存在劑量—時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，但濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)使SBD-1 基因表達(dá)效果降低，當(dāng)菌液濃度為5.2×107CFU/mL誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞12 h時(shí)SBD-1基因的表達(dá)量達(dá)到最高。2008年Schlee等[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同的益生乳酸菌株與人β-防御素-2(HBD-2)的表達(dá)量存在劑量—時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，HBD-2 mRNA表達(dá)量隨著不同益生菌液劑量增大而增加，且刺激6 h后達(dá)到峰值。2012年黎觀紅等[16]發(fā)現(xiàn)用菌液濃度為2×106CFU/mL的鼠李糖乳酸桿菌LGA對(duì)體外培養(yǎng)的雞小腸上皮細(xì)胞刺激12 h，表達(dá)量達(dá)到峰值。本試驗(yàn)結(jié)果與以上兩人的研究結(jié)果基本相同，但當(dāng)抗菌肽達(dá)到最高表達(dá)量時(shí)所用的菌液濃度和刺激時(shí)間卻存在差異，這可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物種屬間存在差異和不同菌體具有不同的有效刺激成分有關(guān)。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果可以推斷，益生性釀酒酵母菌促進(jìn)或誘導(dǎo)綿羊瘤胃內(nèi)SBD-1基因的表達(dá)可能是其發(fā)揮益生作用尤其是免疫促進(jìn)作用的一種重要作用方式。釀酒酵母菌通過(guò)上調(diào)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1基因的表達(dá)而提高瘤胃天然免疫功能。因此，益生性釀酒酵母菌可能通過(guò)誘導(dǎo)或促進(jìn)瘤胃抗菌肽的表達(dá)在黏膜局部形成高濃度，從而抑制和殺滅瘤胃內(nèi)有害菌并調(diào)節(jié)有益菌數(shù)量和種類(lèi)以維持瘤胃微生態(tài)平衡。同時(shí)，瘤胃上皮細(xì)胞分泌的抗菌肽可作為細(xì)胞間的信號(hào)分子發(fā)揮多重免疫調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果在印證益生菌能夠誘導(dǎo)人和哺乳動(dòng)物胃腸道上皮細(xì)胞抗菌肽表達(dá)的同時(shí)，進(jìn)一步從mRNA水平得出了釀酒酵母菌能夠提高綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1基因的表達(dá)，且濃度為5.2×107CFU/mL的菌液誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞12 h時(shí)SBD-1基因的表達(dá)量達(dá)到最高。

[1] Semple F, Dorin J R.β-Defensins: Multifunctional Modulators of Infection, Inflammation and More[J]. Journal of Innate Immunity, 2012, 4: 337-348.

[2] Meade K G, Cormican P, Narciamdi F,etal.Bovine β-defensin gene family: opportunities to improve animal health[J]. Physiological Genomics, 2014, 46(1): 17-28.

[3] Xiao Y, Hughes A L, Ando J,etal. A genome-wide screen identifies a single beta-defensin gene cluster in the chicken: implications for the origin and evolution of mammalian defensins[J]. BMC Genomics, 2004, 5(1): 56.

[4] Zhao P W, Cao G F. Production of bioactive sheep β-defensin-1 in Pichia pastoris[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(1): 11-17.

[5] Monteleone G, Calascibeffa D, Scaturro M,etal.Polymorphisms of β-defensin genes in Valle del Belice dairy sheep[J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(8): 5 405-5 412.

[6] 盛金良, 陳創(chuàng)夫, 楊霞. 綿羊防御素(sBD1)mRNA在不同發(fā)育階段的組織分布和定量分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 40(1): 20-25.

[7] 李硯, 楊銀鳳. 家畜體內(nèi)防御素的多態(tài)性和表達(dá)[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2013, 40(3): 160-168

[8] 洪智敏, 張和平, 賈永杰, 等. 發(fā)酵乳酸桿菌F6對(duì)雞小腸上皮細(xì)胞β-防御素-9基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 32(8): 1 142-1 147.

[9] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)[J]. 中國(guó)飼料, 2014(2): 1-4.

[10] Galdeamo C M, Demoreno D L A, Viderola G,etal. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria[J]. Clin Vaccine Immunol, 2007, 14(5): 485-492.

[11] Klotz J L, Baldwin R L, Gillis R C,etal. Refinements in primary rumen epithelial cell incubation techniques[J]. Journal of Dairy Science, 2001, 84(1): 183-193.

[12] 孫志洪, 張慶麗, 賀志雄, 等. 山羊瘤胃上皮細(xì)胞和空腸黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2010, 22(3): 602-610.

[13] 范燕茹, 王佩, 金鑫，等. 中國(guó)馴鹿瘤胃上皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2014(11): 8-10.

[14] Schmittgen T D, Zakrajsek B A. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression:validation by real-time,quantitative RT-PCR[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000, 46 (1-2): 69-81.

[15] Schlee M, Harder J, Koten B,etal. Probiotic lactobacilli and VSL#3 induce enterocyte beta-defensin 2[J]. Clinical and Experimental Immunology, 2008, 151(3): 528-535.

[16] 黎觀紅, 洪智敏, 賈永杰. 鼠李糖乳酸桿菌LGA對(duì)雞小腸上皮細(xì)胞β-防御素-9基因表達(dá)的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 43(4): 634-641.

Study on the expression of SBD-1 mRNA induced by Saccharomyces cerevisiae

JIN Xin , ZHANG Man , TIAN Qiao-zhen , LIU Jiao , WANG Yun-he , YANG Yin-feng

(College of veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

In this study，we investigated the effect of probioticSaccharomycescerevisiaeon the β-defensin-1 (Sheep Beta-Defensin-1, SBD-1) expression in cultured ruminal epithelial cells of sheep. The ruminal epithelium cells(RECs) of sheep were cultured successfully in vitro, and the RECs were stimulated 2 h with different concentrations ofSaccharomycescerevisiae, and then for different times. Then the expression of SBD-1 mRNA was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR). The results showed that the expression of SBD-1 mRNA in each time group were increased and then decreased following the increase of Saccharomyces cerevisiae concentrations.The expression of SBD-1 mRNA was highest and significantly higher than the control group and the other concentration groups (P< 0.01). When the cells were stimulated with the concentration of 5.2 × 107CFU·mL-1. When the concentration was constant, the expression of SBD-1 mRNA was increased with the extension of stimulating time, and the expression of SBD-1 mRNA was the highest at 12 h. Therefore, the expression of SBD-1 was the highest when the concentration of Saccharomyces cerevisiae was at 5.2 × 107CFU·mL-1and the stimulating was 12 h stimulating, compared with the other time groups at this concentration (P< 0.01). These findings indicate thatSaccharomycescerevisiaecan induce the expression of SBD-1 in ruminal epithelial cells of sheep. And the level of SBD-1 expression is highest when the rumen epithelial cells are stimulated with the concentration of 5.2×107CFU·mL-1for 12 h.

β-defensin-1 ; ruminal epithelial cells ;Saccharomycescerevisiae; realtime fluorescence quantitative PCR ; sheep

YANG Yin-feng

2016-09-29

金鑫(1990-)，男，博士，從事動(dòng)物解剖及黏膜免疫工作，E-mail：jinxinnndsyxy@163.com

楊銀鳳，E-mail：julie1963@163.com

S826

A

0529-6005(2017)07-0010-03