一株地衣芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)研究

宋 曦，汪 慧，尚 菲，韓 雍，劉圓媛

(1隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000；2隴東學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

一株地衣芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)研究

宋 曦1，汪 慧1，尚 菲2，韓 雍1，劉圓媛1

(1隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000；2隴東學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

目的：對(duì)地衣芽孢桿菌所產(chǎn)凝乳酶的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。方法：在不同的溫度、pH值、底物濃度、不同金屬離子等條件下測(cè)定地衣芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶相對(duì)酶活力。結(jié)果：地衣芽孢桿菌所產(chǎn)凝乳酶最適凝乳溫度為70℃；40℃以上熱處理后凝乳活性有不同程度的損失，75℃熱處理10min后凝乳酶活性喪失；pH值為5～8時(shí)凝乳活性隨乳pH值的降低而增強(qiáng)，pH值為7時(shí)凝乳酶最穩(wěn)定；Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Al3+對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用；Li2+、Na+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活性有抑制作用；底物濃度最適為250 g/L、Ca2+的最適濃度為0.014 g/L。

地衣芽孢桿菌；凝乳酶

凝乳酶在干酪加工過(guò)程中主要作用為專一性地水解乳中κ-酪蛋白第105～106 位苯丙氨酸和甲硫氨酸之間的肽鍵，形成穩(wěn)定的副κ-酪蛋白及親水性的糖巨肽[1-3]。國(guó)際市場(chǎng)上凝乳酶中動(dòng)物性來(lái)源的約占70%、微生物性的占30%、植物性的不到1%。微生物產(chǎn)凝乳酶不受自然條件影響，生產(chǎn)成本低，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，所以成為國(guó)內(nèi)外的研究重點(diǎn)[2-8]。

本試驗(yàn)從甘肅省天祝藏族自治縣牦牛牧區(qū)土壤中分離得到高產(chǎn)凝乳酶菌株1株，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定表明該菌株與地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisstrainN8 和BacilluslicheniformisstrainYP1A同源性為99%，標(biāo)記為D3.11。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

菌種：實(shí)驗(yàn)室篩選菌種，經(jīng)16sRNA序列分析比對(duì)，確定為地衣芽孢桿菌。

試劑：酪蛋白、牛肉膏、磷酸氫二鈉、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水、10%脫脂牛乳、硫酸銨等。

儀器與設(shè)備：冷凍離心機(jī)、電子分析天平、顯微鏡、搖床、恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，試管(若干)、接種針、接種槍、酒精燈、玻璃棒、紗布、棉線、鐵架臺(tái)、移液管、三角瓶(若干)、培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定方法

(1)硫酸銨鹽析用量條件的確定：低溫條件下向發(fā)酵液中緩慢加入研細(xì)的硫酸銨粉末至20 %～30 %飽和度，靜置3 h，在12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，分別收集上清液。同樣條件下，再緩慢向上清液中加入硫酸銨至70%、80%、90%、100%飽和度，沉淀過(guò)夜，在12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，分別收集沉淀，溶于pH為6.0的磷酸鹽緩沖溶液中待測(cè)用。

(2)凝乳酶凝乳活性的測(cè)定：采用Arima方法[9]，取5 mL 100g/L的脫脂乳，在一定溫度下保溫5 min，加入1 mL酶液，迅速混合均勻，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時(shí)間(s)。把40 min凝固1 mL 100 g/L脫脂乳的酶量定義為一個(gè)索氏單位。

T—凝乳時(shí)間；D—稀釋倍數(shù)

1.2.2 試驗(yàn)方法

(1)酶的最適凝乳溫度：將酶液分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃下保溫5 min 后測(cè)定酶活力，以35 ℃時(shí)的酶活力為對(duì)照。

(2)酶的熱穩(wěn)定性：將酶液分別在40、50、60、70 ℃下保溫10、20、30、40、50、60 min后，測(cè)定酶活力，以35 ℃時(shí)的酶活為力為對(duì)照。

(3)脫脂乳的pH值對(duì)酶凝乳活性的影響：用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH將100 g/L的脫脂乳的pH分別調(diào)節(jié)到5.5、5.8、6.1、6.4、6.7在酶最適宜的凝乳溫度下測(cè)定酶的凝乳活性，以脫脂乳自然pH值(6.5)下酶活力為對(duì)照。

(4)不同pH值下的穩(wěn)定性：用0.1 mol/L HCl和0.1mol/L NaOH將酶液調(diào)節(jié)到pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，在室溫下放置過(guò)夜后，再將酶液pH調(diào)節(jié)到酶最適pH值，在酶最適溫度下測(cè)定酶活力，以酶液pH自然時(shí)的酶活作為對(duì)照。

(5)Ca2+對(duì)酶凝乳活性的影響：脫脂乳中添加CaCl2，使其含量分別為0.004、0.006、0.008、0.012、0.014、0.016、0.018 g/L，35 ℃下測(cè)定凝乳酶活，以CaCl2添加量為 0.011 g/L的脫脂乳時(shí)的酶活作為對(duì)照。

(6)金屬離子對(duì)酶的凝乳活性的影響：配制KCl，MgSO4、LiSO4、FeCl2、NaCl、MnSO4、Fe(SO4)3、Al(SO4)3、CuSO4、ZnCl含量分別為0.05 mol/L的脫脂乳溶液，在酶的最適作用溫度下測(cè)定酶活力，以未添加金屬離子的10 %脫脂乳時(shí)的酶活為對(duì)照。

(7)底物濃度對(duì)酶的凝乳活性的影響：脫脂奶粉配制成10、50、100、150、200、250 g/L溶液，35 ℃下測(cè)定酶活力，以脫脂乳為10 %的酶活為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨用量的確定

將收集沉淀溶解于pH 6.8的磷酸緩沖液中，測(cè)定凝乳酶活力。表1可知，酶活在初始硫酸銨濃度為20 %時(shí)最高，其原因可能是30 %時(shí)濃度過(guò)大，而使酶蛋白有一定的沉淀。在同樣條件下緩慢向上清液中加入硫酸銨至70 %、80 %、90 %、100 %飽和度，沉淀過(guò)夜，測(cè)得在加入硫酸銨至濃度為70 %時(shí)酶活力最高。

表1 不同硫酸銨飽和度下的酶活

2.2 酶的最適凝乳溫度

將已分離純化好的酶液分別在25～70 ℃范圍內(nèi)保溫10 min后測(cè)定凝乳酶活力。圖1結(jié)果表明，D3.11菌株所產(chǎn)凝乳酶在35～70 ℃有較高的凝乳活力，凝乳最適溫度為70 ℃，當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)凝乳速度緩慢。在溫度為35～70 ℃之間凝乳酶活力較高，從30 ℃開(kāi)始凝乳酶活力與溫度成正比，高于70 ℃時(shí)，活力迅速下降，升至75 ℃時(shí)失活。在酶蛋白的活性范圍內(nèi)，隨著溫度的升高會(huì)加快酶促反應(yīng)的進(jìn)行，但高于酶的最適反應(yīng)溫度后，高溫會(huì)使凝乳酶性質(zhì)發(fā)生改變，甚至使酶失去活力，所以導(dǎo)致相對(duì)酶活力迅速降低，當(dāng)凝乳酶失去活性后，其相對(duì)凝乳活力為零。

2.3 酶的熱穩(wěn)定性

將已分離純化好的酶液分別在40、50、60、70 ℃下保溫10、20、30、40、50、60 min，測(cè)定其剩余活力，表2結(jié)果表明，凝乳酶在40 ℃下處理60 min，凝乳活性比處理前有所增高；在50 ℃下處理10 min時(shí)酶活較處理前有所提高，但繼續(xù)處理20、30、40、50、60 min后酶活力逐漸降低；在60 ℃下處理10、20、30、40、50、60 min后酶活力大幅度降低，處理60 min時(shí)活力喪失73.1%；70 ℃下處理10 min后凝乳酶活力即完全喪失。酶的變性不僅取決與溫度的高低，還與該溫度下保持的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，在高于變性溫度下，酶在很短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)高凝乳活性，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，活性逐漸損失，直至完全失活。

圖1 不同溫度下凝乳酶的相對(duì)酶活

表2 一定溫度下保持一定時(shí)間后凝乳酶的相對(duì)酶活

2.4 底物pH值對(duì)凝乳酶活力的影響

將脫脂乳pH值分別調(diào)節(jié)為pH 5.5、5.8、6.1、6.4、6.7后測(cè)定凝乳酶活力。由圖2可知，隨著pH值的升高，凝乳活力整體呈下降趨勢(shì)，在酸性條件下酶具有較高的凝乳活力，pH為5.5時(shí)凝乳活力最高。當(dāng)pH為6.7時(shí)凝乳活力則下降很快，不到對(duì)照試驗(yàn)的20 %。出現(xiàn)以上現(xiàn)象是因?yàn)閜H值的變化會(huì)影響到酶的空間結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致酶活性部位可基團(tuán)改變，酶分子活性中心催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)的離解，底物的離解及酶～底物復(fù)合物的離解，從而影響反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，影響酶反應(yīng)速度。

圖2 脫脂乳pH值對(duì)凝乳酶活性的影響

2.5 酶液在不同pH值時(shí)的穩(wěn)定性

用0.1mol/L的HCl和NaOH將不同酶液調(diào)至pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，室溫下放置過(guò)夜，然后將pH值調(diào)到6.0，測(cè)定凝乳酶活力。圖3結(jié)果表明，D3.11菌株所產(chǎn)凝乳酶在弱酸和中性偏堿的環(huán)境中都還保留有一定的凝乳活力，在pH為7時(shí)較穩(wěn)定，超過(guò)pH 7值，酶的穩(wěn)定性下降，活力受影響，甚至完全失活。當(dāng)pH高于7.0或低于2.0時(shí)酶活損失嚴(yán)重，說(shuō)明該凝乳酶在強(qiáng)酸，強(qiáng)堿條件下都不穩(wěn)定。過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)，甚至使酶變性而失活。

圖3 凝乳酶在不同pH值處理后酶活力

2.6 Ca2+對(duì)凝乳酶活性的影響

由圖4可知，CaCl2質(zhì)量濃度達(dá)到0.014 g/L時(shí)凝乳活力呈增加趨勢(shì)，低濃度的Ca2+對(duì)酶的凝乳活力影響較小，到0.018 g/L趨于穩(wěn)定；從整體上看Ca2+加速了凝乳過(guò)程。當(dāng)CaCl2添加量不足時(shí)，凝乳時(shí)間延長(zhǎng)，而且凝塊組織松散；反之，添加過(guò)多時(shí)，雖然凝乳速度加快，但凝塊堅(jiān)實(shí)，所以CaCl2的添加量應(yīng)該在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，此凝乳酶在0.018 g/L趨于穩(wěn)定。

圖4 Ca2+對(duì)酶凝乳效果的影響

2.7 其他金屬離子對(duì)酶的凝乳效果的影響

當(dāng)脫脂乳中不同金屬離子的含量為0.05 mol/L時(shí)，測(cè)定凝乳酶活力。由表3可知，F(xiàn)e2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Al3+對(duì)凝乳活力有顯著的促進(jìn)作用，其中Fe2+最大可使凝乳活力提高46.3%，Mg2+最小也有1.6 %的促進(jìn)作用。Li2+、Na+、Cu2+、Zn2+對(duì)凝乳活力有抑制作用，Cu2+對(duì)凝乳活力抑制能力最大，達(dá)到60.8%，而Li2+、Na+抑制作用最小都達(dá)到13.1 %。k+對(duì)凝乳活力的影響不明顯。

表3 不同金屬離子對(duì)凝乳酶活力影響

2.8 底物濃度對(duì)酶的凝乳效果的影響

由圖5可知，脫脂乳濃度分別為10、50、100、150、200、250 g/L時(shí)測(cè)定凝乳酶活力，結(jié)果表明脫脂乳的不同濃度對(duì)凝乳酶的酶活力有一定程度的影響，當(dāng)脫脂乳液的濃度高于一定程度時(shí)，酶的活力有所減弱。底物濃度越大，凝乳酶活性越高，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?00 g/L時(shí)，隨著底物濃度的增大，酶凝乳活性增加較快，當(dāng)大于200g/L時(shí)，酶的凝乳活性趨于穩(wěn)定，凝乳酶活力最大。

圖5 不同脫脂乳濃度時(shí)的凝乳酶相對(duì)酶活

3 結(jié)論與討論

(1)菌株D3.11產(chǎn)凝乳酶分離時(shí)采用硫酸銨為初始飽和度為20 %，加入硫酸銨到飽和度為70 %時(shí)效果最佳。(2)菌株D3.11產(chǎn)凝乳酶的最適凝乳溫度為70℃。在40 ℃下處理60 min，酶的活力較穩(wěn)定，凝乳活性比處理前有所增高；在50 ℃下處理10 min酶活較處理前有所提高，但繼續(xù)處理20、30、40、50、60 min酶活力逐漸降低；70℃下處理10 min后酶活力喪失。說(shuō)明該菌株產(chǎn)凝乳酶耐高溫，適合于工業(yè)生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)薛璐等人對(duì)江米酒凝乳酶酶學(xué)特性的研究表明，其溫度在65℃后酶活力喪失[10]。高維東等[11]對(duì)微小毛霉凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，其最適溫度為60、70℃后酶活力喪失。王博達(dá)等[12]將解淀粉芽孢桿菌所產(chǎn)凝乳酶進(jìn)行克隆、重組表達(dá)后發(fā)現(xiàn)重組后的凝乳酶在70℃時(shí)酶活力最高，說(shuō)明D3.11所產(chǎn)凝乳酶耐高溫性能較好。(3)pH為5.5時(shí)凝乳活力最高。菌株D3.11產(chǎn)凝乳酶，強(qiáng)堿條件下都不穩(wěn)。所以在該凝乳酶的應(yīng)用過(guò)程中，必須將酶的反應(yīng)環(huán)境pH值控制在弱酸性條件下。CARIAS J R等[13]對(duì)黃色粘球菌產(chǎn)凝乳酶研究表明，該菌在pH 6.0時(shí)酶活力最高。CAVALCANTI M T H等[14-15]對(duì)諾卡氏菌所產(chǎn)凝乳酶研究表明，其最適pH值為11.0和7.5，即在堿性條件下較穩(wěn)定，可見(jiàn)不同細(xì)菌所產(chǎn)凝乳酶最適pH值相差較大。(4)Fe2+、Fe3+、Mn2+、Mg2+、Al3+對(duì)菌株D3.11產(chǎn)凝乳酶凝乳活力有顯著的促進(jìn)作用。Li2+、Na+、Cu2+、Zn2+對(duì)菌株D3.11產(chǎn)凝乳酶凝乳活力有抑制作用。K+對(duì)菌株D3.11產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力的影響不明顯。Ca2+最適濃度為0.014 g/L，Ca2+參與乳的凝固過(guò)程，當(dāng)酶作用于酪蛋白形成福κ-酪蛋白時(shí)，Ca2+可加速副κ-酪蛋白的進(jìn)一步聚集而凝固。同時(shí)副κ-酪蛋白對(duì)凝乳酶本身也有一定的影響[3，16]。脫脂乳濃度為200g/L時(shí)，酶活力最大。◇

[1]劉顯庭，張昊，郭慧媛，等.凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)乳業(yè)，2013(133)：54-57.

[2]郭本恒.乳品化學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001：7.

[3]BRUNO M A，et al.Milk cloting and proteolytic activity of an enzyme preparation from Bromelia hieromymi fruits[J].LWT-Food Science and Technology，2010，43(4)：697-701.

[4]高維東，甘伯中，丁福軍，等.微生物凝乳酶的研究進(jìn)展[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37(5)：34-36.

[5]張衛(wèi)兵，宋曦，賀曉玲，等.Bacillus licheniformis產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2011，30(2)：70-73.

[6]Prados，PINO A，F(xiàn)ernandez-salguero J.Effect of a powdered begetable coagulant from Cynara cardunculus in the accelerated ripening of Mznchego cheese[J].Int J Food Sci Technol，2007，42(5)：556-561.

[7]杜琨，張亞寧.干酪的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及研究動(dòng)態(tài)[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005(10)：45-46.

[8]杭鋒，洪青，王欽博，等.凝乳酶的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2016，30(3)：273-279.

[9]K Arima，I Shinjiro，T Gakuzo.Milk-clltting enzymes from microorganinism，Part InScreening test and identification of potent fungus[J].Agric Biol Chem，1967，31(5)：540-545.

[10]薛璐，陳歷俊，姜鐵民，等.江米酒凝乳酶酶學(xué)特性的研究[J].食品科學(xué)，2008，29(4)：259-262.

[11]高維東，甘伯中，丁福軍，等.微小毛霉凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2010，31(3)：185-188.

[12]王博達(dá)，丁重陽(yáng)，張梁，等.解淀粉芽孢桿菌凝乳酶的克隆、重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)[J].工業(yè)微生物，2016，45(6)：9-15.

[13]CARIAS J R，RAUBGEAUD J，MAZAUD C，et al.A chymosin-like extracellular acidic endoprotease from Myxococcus xanthus[J].J Bacteriol，1992，174(15)：5136-5140.

[14]CAVALCANTI M T H，et al.Partial purification of new milk-clotting enzyme produced by Nocardiopsis sp.[J].Bioresource Technol，2004，93(1)：29-35.

[15]CAVALCANTI M T H，et al.Milk clotting protease production by Nocardiopsis sp.in an inexpensive medium[J].World J Microb Biot，2005，21(2)：151-154.

[16]FOLTMANN B，et al.The primary sructure of calf chymosin[J].J Biol Chem，1979(254)：8447-8456.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

The Properties of Chymosin fromBacilluslicheniformis

SONG Xi1，WANG Hui1，SHANG Fei2，HAN Yong1, LIU Yuan-yuan1

(1College of Agriculture and Forestry；2College of life Science and Technology，Longdong University，Qingyang 745000，China)

Bacilluslicheniformis；chymosin

宋曦(1984— )，女，碩士研究生，講師，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生。