海參膠原低聚肽對(duì)糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的促進(jìn)作用

李 林，李 迪，徐 騰，劉 睿，任金威，陳啟賀，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

海參膠原低聚肽對(duì)糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的促進(jìn)作用

李 林，李 迪，徐 騰，劉 睿，任金威，陳啟賀，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

目的：觀察海參膠原低聚肽是否具有促進(jìn)db/db 2型糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的作用。 方法：取90只10w齡的db/db小鼠分為5組，包括模型對(duì)照組乳清蛋白組和3個(gè)海參膠原肽組(從低到高分別為0.25、0.50、1.00 g/kg·BW)，每組18只。另設(shè)一組同周齡、性別的db/m小鼠18只作為正常對(duì)照組。模型對(duì)照組和正常對(duì)照組使用溶劑(蒸餾水)灌胃。進(jìn)行背部切口手術(shù)后開始干預(yù)，分別于術(shù)后第4、7、14d分批處死動(dòng)物，每組每次處死6只。術(shù)后觀察不同時(shí)期傷口愈合情況，測(cè)定血清生化指標(biāo)、皮膚切口抗張力強(qiáng)度以及進(jìn)行皮膚組織HE染色。結(jié)果：與模型對(duì)照組相比，海參膠原肽劑量組小鼠血清IL-8水平降低，IL-10水平升高，NO水平升高，傷口抗張力強(qiáng)度提升，傷口愈合較好。結(jié)論：海參膠原低聚肽能夠改善糖尿病小鼠術(shù)后營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)傷口愈合。

海參膠原低聚肽；糖尿??；傷口愈合

糖尿病人傷口愈合緩慢是糖尿病的一種常見(jiàn)并發(fā)癥[1]。在臨床中，糖尿病患者由于傷口愈合困難，從而使其發(fā)生潰瘍、感染甚至壞疽和截肢[2]。尋找促進(jìn)糖尿病人傷口愈合的方法對(duì)于改善術(shù)后糖尿病人的生活質(zhì)量，減少并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的作用。海參肽具有多種生物活性功能[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，海參膠原肽能夠促進(jìn)正常大鼠傷口膠原蛋白合成從而促進(jìn)傷口愈合[4]。本研究擬建立糖尿病小鼠傷口模型，觀察海參膠原低聚肽對(duì)糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

海參膠原低聚肽：淡黃色粉末，利用生物酶解技術(shù)從海參中提取、制備的小分子生物活性肽。經(jīng)高效液相色譜純化后，用質(zhì)譜儀對(duì)其分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析可知，其相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的占89.44%，游離氨基酸含量占7.496%，其中精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸含量較多。實(shí)驗(yàn)樣品由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性db/db型糖尿病小鼠以及與之周齡、性別匹配的同窩出生的非糖尿病健康db/m小鼠，10w齡，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。

清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度21～23℃，相對(duì)濕度50%～60%，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.3 主要儀器和試劑

高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)；PCLAB-UE生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；力換能器(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)；CK40-SL倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；小鼠IL-8、IL-10(ELISA)檢測(cè)試劑盒、小鼠NO檢測(cè)試劑盒(北京泰格諾克科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷模型的建立 小鼠經(jīng)過(guò)4%水合氯醛麻醉后，進(jìn)行背部脫毛。常規(guī)皮膚消毒，于背部?jī)蓚?cè)分別切一個(gè)長(zhǎng)1.5cm的縱向切口。切口切開肌肉，深達(dá)腹腔。然后模擬臨床手術(shù)過(guò)程逐層縫合肌肉與皮膚。術(shù)后涂抹2%碘伏消毒，并注射青霉素G鈉(1 000 IU/g·BW)防止感染。術(shù)后禁食6h，保持正常飲水。手術(shù)當(dāng)天記為第0d。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 db/db小鼠90只，每組18只，隨機(jī)分為5組。包括模型對(duì)照組、乳清蛋白組(0.50 g/kg·BW)和海參膠原低聚肽劑量組(從低到高分別為0.25、0.50、1.00 g/kg·BW)。同時(shí)設(shè)立1組正常對(duì)照組，為18只同窩出生的非糖尿病db/m小鼠。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組用等體積溶劑(蒸餾水)進(jìn)行灌胃。于手術(shù)當(dāng)天開始灌胃進(jìn)行干預(yù)，海參肽3個(gè)劑量組每天灌胃給予海參肽水溶液，乳清蛋白組給予乳清蛋白水溶液，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組每天灌胃給予同體積的蒸餾水。灌胃量為0.1 mL/10g，每日1次。乳清蛋白水溶液和海參肽水溶液均用蒸餾水配置。分別于術(shù)后第4、7、14d分批處死小鼠，每組每次處死6只。

1.4.3 傷口愈合的評(píng)價(jià)

傷口愈合的組織病理學(xué)觀察：各組小鼠于第4、7、14d處死時(shí)取左側(cè)全層皮膚組織，組織切口距傷口邊緣0.5 cm，用甲醛固定用于做石蠟切片進(jìn)行HE染色。

傷口的抗?jié)q強(qiáng)度測(cè)試：各組小鼠于第4、7、14d處死時(shí)取右側(cè)傷口皮膚，以傷口處為中線，寬0.5 cm，距傷口兩側(cè)各0.5 cm為長(zhǎng)的長(zhǎng)方形皮膚，去除皮下脂肪組織。將皮膚短邊的一頭連接到張力感受器，另一端連接到可以通過(guò)旋鈕微調(diào)距離的裝置上。緩慢調(diào)動(dòng)旋鈕拉伸皮膚，通過(guò)多功能生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄皮膚斷開時(shí)的張力大小。通過(guò)測(cè)微尺測(cè)量皮膚的厚度計(jì)算橫截面積，張力除以橫截面積即為皮膚的抗張強(qiáng)度。

血清生化指標(biāo)檢測(cè)：小鼠摘眼球采血后靜置30min，于4℃ 3 000r/min的條件下離心20min，取上層血清保存待用。用試劑盒測(cè)定血清中IL-8、IL-10、NO的水平，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 術(shù)后小鼠傷口愈合組織病理學(xué)觀察結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，術(shù)后第7d，正常對(duì)照組傷口表面完整性較好，創(chuàng)面毛細(xì)血管密集，成纖維細(xì)胞較多。模型對(duì)照組傷口表面完整性較差，瘢痕組織較多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，毛細(xì)血管形成較少。乳清蛋白組傷口創(chuàng)面毛細(xì)血管較少且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。海參肽干預(yù)后可見(jiàn)毛細(xì)血管形成增多，瘢痕組織明顯減少，成纖維細(xì)胞聚集，且炎性細(xì)胞明顯低于模型對(duì)照組。

由圖2可見(jiàn)，術(shù)后第14d，正常對(duì)照組傷口表面愈合較好，表面平整，瘢痕組織小，少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管密集，成纖維細(xì)胞較多。模型對(duì)照組傷口仍有大量瘢痕組織，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞均較少。乳清蛋白組瘢痕組織較多，毛細(xì)血管少。海參肽干預(yù)組瘢痕組織明顯減少，皮膚表面完整性較好，毛細(xì)血管較多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯較少且伴有較多的成纖維細(xì)胞。

圖1 術(shù)后第7d小鼠傷口愈合組織學(xué)觀察情況(40×)A：正常對(duì)照組 B：模型對(duì)照組 C：乳清蛋白組 D：海參肽低劑量組 E：海參肽中劑量組 F：海參肽高劑量組

圖2 術(shù)后第14d小鼠傷口愈合組織學(xué)觀察情況(40×)A：正常對(duì)照組 B：模型對(duì)照組 C：乳清蛋白組 D：海參肽低劑量組 E：海參肽中劑量組 F：海參肽高劑量組

2.2 術(shù)后各組小鼠傷口張力強(qiáng)度

如表1所示，術(shù)后第7d，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、乳清蛋白組、海參肽3個(gè)劑量組傷口張力強(qiáng)度均明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白組傷口張力強(qiáng)度無(wú)顯著升高，海參肽3個(gè)劑量組傷口張力強(qiáng)度均明顯較高，其中海參肽中、高劑量組傷口張力強(qiáng)度增高更為顯著；與乳清蛋白組相比，海參肽3個(gè)劑量組傷口張力強(qiáng)度均明顯較高，其中海參肽中、高劑量組傷口張力強(qiáng)度增高更為顯著。術(shù)后第14d，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、乳清蛋白組、海參肽3個(gè)劑量組傷口張力強(qiáng)度均明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白組傷口張力強(qiáng)度無(wú)顯著升高，海參肽中、高劑量組傷口張力強(qiáng)度均明顯較高，其中海參肽中劑量組傷口張力強(qiáng)度增高更為顯著；與乳清蛋白組相比，海參肽中、高劑量組傷口張力強(qiáng)度均明顯較高。

表1 術(shù)后第7、14d各組小鼠傷口張力強(qiáng)度

注：*與正常對(duì)照組相比P<0.05、**與正常對(duì)照組相比P<0.01；#與模型對(duì)照組相比P<0.05、##與模型對(duì)照組相比P<0.01；△與乳清蛋白組相比P<0.05；△△與乳清蛋白組相比P<0.01。

2.3 小鼠血清中白細(xì)胞介素8、10水平

由表2、表3發(fā)現(xiàn)，在同一時(shí)期里，各劑量組IL-8含量與模型對(duì)照組相比均有降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣在同一時(shí)期里，各個(gè)劑量組IL-10含量與模型對(duì)照組相比均有顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 術(shù)后第4、7、14d各組小鼠血清白細(xì)胞介素8水平

表3 術(shù)后第4、7、14d各組小鼠血清白細(xì)胞介素10水平

注：*與正常對(duì)照組相比P<0.05、**與正常對(duì)照組相比P<0.01；#與模型對(duì)照組相比P<0.05、##與模型對(duì)照組相比P<0.01；△與乳清蛋白組相比P<0.05、△△與乳清蛋白組相比P<0.01。

2.4 小鼠血清中一氧化氮(NO)檢測(cè)結(jié)果

術(shù)后第14d，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、乳清蛋白組、海參肽3個(gè)劑量組小鼠血清NO濃度均明顯較低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，海參肽3個(gè)劑量組小鼠血清NO濃度均明顯較高血清NO濃度均明顯較高(P<0.05)；與乳清蛋白組相比，海參肽低、中劑量組小鼠血清NO濃度均明顯較高(P<0.01)(圖3)。

圖3 術(shù)后第14d各組小鼠血清NO水平 注：*與正常對(duì)照組相比P<0.05、**與正常對(duì)照組相比P<0.01；#與模型對(duì)照組相比P<0.05、##與模型對(duì)照組相比P<0.01；△與乳清蛋白組相比P<0.05、△△與乳清蛋白組相比P<0.01。

3 討論與結(jié)論

db/db小鼠是自發(fā)性糖尿病模型小鼠，屬2型糖尿病模型。小鼠在1個(gè)月時(shí)開始貪食及發(fā)胖，繼而發(fā)生嚴(yán)重的糖尿病癥狀[5]。相比于手動(dòng)誘發(fā)糖尿病的小鼠，該模型鼠不存在人為誘導(dǎo)因素的干擾，糖尿病的產(chǎn)生與臨床患者更為相似[6]，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。由于db/db小鼠純合子不育，需要用雜合子來(lái)交配繁殖，故引入m基因來(lái)保持小鼠的糖尿病表型[7]。純合子的db/db小鼠保持糖尿病表型，而雜合子的db/m小鼠為非糖尿病。本實(shí)驗(yàn)采用db/m小鼠作為正常對(duì)照，以對(duì)比正常的非糖尿病小鼠與糖尿病小鼠之間的差異。對(duì)照組中另設(shè)一組乳清蛋白組，意為提供與中劑量組同濃度蛋白質(zhì)，排除額外攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)帶來(lái)的影響，說(shuō)明干預(yù)效果是由海參膠原低聚肽產(chǎn)生。

傷口愈合包括凝血期、炎癥期、增殖期與塑性期，這四個(gè)時(shí)期之間沒(méi)有明顯的界限[8]。在正常傷口愈合的過(guò)程中，炎癥反應(yīng)迅速發(fā)生并持續(xù)3d左右，然而在糖尿病患者的傷口愈合過(guò)程中，炎癥反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)并影響傷口的正常愈合[9]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組小鼠皮膚切口進(jìn)行病理觀察，與模型對(duì)照組相比，各劑量組明顯可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的減少，提示海參膠原低聚肽對(duì)于糖尿病小鼠傷口愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。有研究表明，炎性相關(guān)因子IL-8增加可能延長(zhǎng)炎癥期引起糖尿病傷口愈合障礙[10]。同時(shí)，對(duì)于抗炎因子IL-10，也有報(bào)道其調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞再生，促進(jìn)組織修復(fù)[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠IL-8和IL-10進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果相對(duì)于模型對(duì)照組，顯示各劑量組IL-8水平降低而IL-10水平升高。說(shuō)明海參膠原低聚肽的干預(yù)，避免了慢性傷口愈合過(guò)程的炎癥反應(yīng)過(guò)度延長(zhǎng)，從而對(duì)糖尿病傷口的愈合有著一定的促進(jìn)作用。創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中毛細(xì)血管的再生能夠?yàn)閯?chuàng)傷部位組織提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)肉芽組織的形成。本研究通過(guò)對(duì)db/db 2型糖尿病小鼠傷口皮膚組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，3個(gè)海參肽劑量組的小鼠傷口處微血管的形成相對(duì)于模型對(duì)照組顯著增加。

傷口重塑以及瘢痕的形成主要受膠原的影響[12-13]。本實(shí)驗(yàn)病理檢測(cè)顯示，3個(gè)劑量組小鼠傷口處成纖維細(xì)胞明顯多于模型對(duì)照組。通過(guò)傷口抗張強(qiáng)度測(cè)試也發(fā)現(xiàn)中劑量和高劑量組小鼠傷口抗張力強(qiáng)度顯著高于模型對(duì)照組，說(shuō)明海參肽中、高劑量組小鼠傷口愈合程度顯著優(yōu)于模型對(duì)照組。除了分泌膠原酶以外，成纖維細(xì)胞還會(huì)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)[14-15]。VEGF可以影響血管的新生和血管通透性的增加，刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)，從而改善傷口愈合過(guò)程中的血管形成[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)db/db小鼠進(jìn)行VEGF的局部治療可以通過(guò)促進(jìn)局部血管生成改善傷口處的新生血管生成情況[17]。由此可以推測(cè)VEGF或者刺激其產(chǎn)生的藥物可用于促進(jìn)慢性傷口愈合的組織修復(fù)。目前已經(jīng)證明NO可以增加VEGF的表達(dá)從而刺激新生血管的形成[18]，并且NO是促進(jìn)VEGF表達(dá)的最為有效的因子[19]。本實(shí)驗(yàn)各個(gè)劑量組NO水平均顯著高于模型對(duì)照組，因此，可以推測(cè)海參膠原低聚肽可能促進(jìn)糖尿病小鼠NO水平升高，從而促進(jìn)新生血管的形成，進(jìn)而改善慢性傷口的愈合。

本研究通過(guò)建立db/db 2型糖尿病小鼠術(shù)后傷口模型，設(shè)立蒸餾水以及乳清蛋白干預(yù)作為對(duì)照組，探討海參膠原低聚肽對(duì)于糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的促進(jìn)作用，結(jié)果提示，海參膠原低聚肽能夠促進(jìn)糖尿病小鼠手術(shù)后傷口的NO生成和新生血管形成，減少炎癥反應(yīng)并且增強(qiáng)傷口抗張力強(qiáng)度，說(shuō)明海參膠原低聚肽能夠促進(jìn)糖尿病人傷口愈合。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effect of Sea Cucumber Collagen Oligopeptide in Diabetic Wound Healing

LI Lin，LI Di，XU Teng，LIU Rui，REN Jin-wei，CHEN Qi-he，LI Yong

(School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China)

sea cucumber oligopeptide;diabetes mellitus;wound healing

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81573138)。

李林(1991— )，男，碩士，研究方向：肽營(yíng)養(yǎng)學(xué)。

李勇(1957— )，男，教授，研究方向：肽營(yíng)養(yǎng)學(xué)。