低氧培養(yǎng)對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生長和線粒體分布及功能的影響

王 春，魏含清，裴軼勁

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室/干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究所，廣東東莞 523808)

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·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.003

低氧培養(yǎng)對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生長和線粒體分布及功能的影響

王 春，魏含清，裴軼勁△

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室/干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究所，廣東東莞 523808)

目的 研究低氧培養(yǎng)條件對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的生長和線粒體分布及功能的影響。方法 將MEFs分為20%氧濃度的常氧培養(yǎng)組和5%氧濃度的低氧培養(yǎng)組連續(xù)培養(yǎng)，每24小時采用臺盼藍(lán)染色對MEFs活細(xì)胞計數(shù)；Mito-Tracker Green對細(xì)胞線粒體染色并在激光共聚焦顯微鏡下觀察；腺苷三磷酸(ATP)試劑盒檢測ATP合成。結(jié)果 對數(shù)生長期低氧培養(yǎng)組活細(xì)胞數(shù)高于常氧培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；并且低氧培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)線粒體核周分布型比例高于常氧培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時兩組細(xì)胞內(nèi)ATP水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 低氧培養(yǎng)條件影響線粒體在MEFs細(xì)胞內(nèi)的分布和能量的合成，對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用高于常氧培養(yǎng)。

低氧；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；線粒體分布；腺苷三磷酸

氧是細(xì)胞必要的生存條件，是細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理功能調(diào)節(jié)的重要的因素。大多數(shù)細(xì)胞體外培養(yǎng)是將細(xì)胞置于與空氣中氧濃度近似的常氧條件下進(jìn)行[1]。體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)往往是模擬體內(nèi)環(huán)境建立起來的，但大多數(shù)培養(yǎng)系統(tǒng)都采取與空氣中的氧濃度一致的培養(yǎng)條件。但在正常的生理狀況下體內(nèi)細(xì)胞組織所處的微環(huán)境與體外環(huán)境是有區(qū)別的，因此逐漸有研究嘗試降低氧濃度對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并且已證明不同的氧濃度對細(xì)胞狀態(tài)的影響[2-7]。線粒體是存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，是維持生命活動的能力工廠，是除細(xì)胞核外唯一具有遺傳效應(yīng)的細(xì)胞器，其主要功能是合成腺苷三磷酸(ATP)。目前已有研究表明線粒體的特征與卵母細(xì)胞的成熟[8-9]、干細(xì)胞的“干性”維持[10]及分化[11-12]有非常密切的聯(lián)系。線粒體形態(tài)、膜電位、能量代謝等參數(shù)在卵母細(xì)胞成熟前后，以及干細(xì)胞分化前后有非常明顯的變化[10，13]。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)應(yīng)用廣泛，在胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的培養(yǎng)中，經(jīng)過絲裂霉素或γ射線處理終止生長后作為支撐干細(xì)胞生長的滋養(yǎng)層使用[14-16]。滋養(yǎng)層的質(zhì)量好壞關(guān)乎著干細(xì)胞的生長，如何建立穩(wěn)定高效的MEFs培養(yǎng)體系仍在不斷地嘗試中。MEFs的常規(guī)培養(yǎng)是在常氧條件下，對MEFs在低氧培養(yǎng)條件下的生長狀況及線粒體的研究較少。本實驗在低氧條件下培養(yǎng)MEFs，觀察其生長、線粒體分布及功能等指標(biāo)的變化，有助于進(jìn)一步闡明低氧條件下線粒體分布與能量代謝的關(guān)系，為優(yōu)化培養(yǎng)條件提供相關(guān)證據(jù)，并為MEFs培養(yǎng)體系的優(yōu)化及后續(xù)干細(xì)胞的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)、0.25%Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清(FBS)均購于美國Gibco公司；ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit試劑盒購于美國Sigma公司；Mito-Tracker Green試劑盒購于中國碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 MEFs的分離培養(yǎng)與分組 取懷孕13.5～14.5 d昆明孕鼠，脫頸處死，在無菌條件下將鼠胚從孕鼠體內(nèi)分離，去除頭、尾、四肢及內(nèi)臟后剪碎并用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5～10 min后去上清液，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪入培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，細(xì)胞生長至對數(shù)生長期傳代，傳代比例為1∶3至1∶6。MEFs以相同的密度傳代接種至培養(yǎng)皿中，分為常氧培養(yǎng)組(37 ℃、5%CO2、20%O2)和低氧培養(yǎng)組(37 ℃、5%CO2、5%O2)，連續(xù)培養(yǎng)1個生長周期，每天相差顯微鏡下觀察。

1.2.2 MEFs生長曲線的繪制 采用臺盼藍(lán)染色法，按1.76×104/cm2的密度傳代接種至培養(yǎng)皿中，連續(xù)培養(yǎng)；每24小時取各組3個皿計數(shù)，實驗重復(fù)3次。0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色后血球計數(shù)板計數(shù)。然后以時間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制MEFs生長曲線。

1.2.3 MEFs線粒體分布類型鑒定 每隔24小時各組取3個皿用Mito-Tracker Green染色[10-11]。根據(jù)說明書按照1∶5 000的比例將1 mmol/L Mito-Tracker Green儲存液與MEFs完全培養(yǎng)基混合配制成Mito-Tracker Green染色工作液，37 ℃孵育45 min，去除Mito-Tracker Green染色工作液加入37 ℃預(yù)溫的新鮮MEFs完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下488 nm處觀察。在低倍視野中選取3個不同的視野，觀察視野中細(xì)胞內(nèi)線粒體的分布類型并計算各類型的百分比。鑒定時，染色效果不佳、細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)不在視野內(nèi)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，以及細(xì)胞重疊導(dǎo)致無法辨別線粒體分布類型的細(xì)胞不在鑒定的范圍之內(nèi)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測 用ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit對細(xì)胞內(nèi)ATP水平進(jìn)行測定，根據(jù)試劑盒說明制作ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線。每隔24小時收集各組細(xì)胞，用100 μL ATP Assary Buffer裂解1×106個細(xì)胞，去除蛋白后加入相應(yīng)體積ATP反應(yīng)液，混合均勻避光孵育30 min，多功能酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(A)值，根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每1×106細(xì)胞中的ATP水平。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 常氧和低氧條件對MEFs生長的影響 MEFs在傳代后第2天開始進(jìn)入對數(shù)生長期，活細(xì)胞量急劇增加；第5天活細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高峰，之后細(xì)胞進(jìn)入衰老期，MEFs活細(xì)胞數(shù)開始減少；第8天后，活細(xì)胞數(shù)趨于穩(wěn)定。同時，在低氧環(huán)境下MEFs的活細(xì)胞量始終高于常氧培養(yǎng)的細(xì)胞，并在MEFs對數(shù)生長期細(xì)胞增殖速度相對常氧培養(yǎng)逐漸增大(圖1)。傳代后第1～3天及第6～7天低氧培養(yǎng)組的MEFs活細(xì)胞數(shù)與常氧培養(yǎng)組的MEFs活細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；傳代后第4～5天和第8～10天低氧培養(yǎng)組的MEFs活細(xì)胞數(shù)與常氧培養(yǎng)組的MEFs活細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 常氧、低氧培養(yǎng)生長周期中線粒體分布類型變化 在整個生長周期中，無論是常氧還是低氧培養(yǎng)，MEFs細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)多為桿狀，線粒體分布類型多樣。根據(jù)線粒體在細(xì)胞內(nèi)分布狀況將其主要分為：(1)線粒體核周分布型，該類型細(xì)胞中線粒體集中分布于細(xì)胞核周圍，越往細(xì)胞膜方向線粒體的熒光強度逐漸減弱甚至消失(圖2A、2D)；(2)線粒體均勻分布型，該類型細(xì)胞中線粒體均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中線粒體的熒光強度無明顯變化(圖2B、2E)；(3)線粒體聚集分布型，該類型細(xì)胞中線粒體聚集于細(xì)胞質(zhì)某些部位，線粒體熒光強度比其他部位明顯增強，并且細(xì)胞內(nèi)線粒體熒光強度變化無明顯規(guī)律(圖2C、2F)。

表1 MEFs在常氧和低氧培養(yǎng)下的細(xì)胞數(shù)比較

-：無數(shù)據(jù)

細(xì)胞傳代貼壁后，細(xì)胞內(nèi)線粒體分布類型開始以核周分布為主，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間延長，線粒體均勻分布類型所占比例逐漸上升；線粒體聚集分布類型在細(xì)胞內(nèi)的比例一直相對較小，但也隨細(xì)胞培養(yǎng)時間延長而增加。貼壁第1天常氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體核周分布型占74.4%，在低氧培養(yǎng)組細(xì)胞中占72.5%；第4天開始常氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體核周分布型所占比例低于50.0%，第5天開始低氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體核周分布型所占比例低于50.0%，相反線粒體均勻分布型比例超過50.0%(表2)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，常氧和低氧培養(yǎng)組MEFs在第4～5天線粒體核周分布型、均勻分布型比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同一天低氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體核周分布型所占比例高于常氧培養(yǎng)組細(xì)胞，低氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體均勻分布型所占比例則要低于常氧培養(yǎng)條件(圖3)。

2.3 常氧、低氧培養(yǎng)對MEFs生長周期中ATP水平的改變 常氧和低氧培養(yǎng)組MEFs中ATP水平貼壁第1天開始往下降，至第5天降為最低，然后急劇上升，至第7天達(dá)到最高，第8天再下降；MEFs傳代貼壁生長第1天，常氧培養(yǎng)組細(xì)胞ATP水平高于低氧培養(yǎng)組，自第2天起，低氧培養(yǎng)組細(xì)胞ATP水平高于常氧培養(yǎng)組(圖4A、B)；常氧和低氧培養(yǎng)組MEFs細(xì)胞內(nèi)ATP水平在傳代后第1～3天和第9天比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MEFs在第4～8天對數(shù)生長期和第10天衰老期，常氧和低氧培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)ATP水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表3。

A：線粒體核周分布型；B：線粒體均勻分布型；C：線粒體聚集分布型；D：核周分布型線粒體熒光強度；E：均勻分布型線粒體熒光強度；F：聚集分布型線粒體熒光強度；標(biāo)尺為20 μm，紅色線條為熒光強度檢測位置

圖2 MEFs細(xì)胞線粒體分布類型

*：P<0.05，與同一天低氧培養(yǎng)組比較

A：常氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體分布類型變化；B：低氧培養(yǎng)組細(xì)胞線粒體分布類型變化；C：線粒體核周分布類型變化；D：線粒體均勻分布類型變化；E：線粒體聚集分布類型變化

圖3 隨培養(yǎng)時間延長在常氧和低氧培養(yǎng)下的MEFs線粒體分布類型變化

A：常氧和低氧培養(yǎng)的MEFs在不同時間ATP水平柱狀圖；B：常氧和低氧培養(yǎng)的MEFs在不同時間ATP水平折線圖；#：P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；##：P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

圖4 常氧和低氧培養(yǎng)隨時間MEFs細(xì)胞內(nèi)ATP水平變化

3 討 論

氧氣在細(xì)胞生命活動中是必不可少的因素，目前細(xì)胞體外培養(yǎng)體系大部分提供的氧氣濃度與空氣中的氧濃度一致，但在正常的生理狀況下體內(nèi)細(xì)胞組織所處的微環(huán)境與體外環(huán)境是有區(qū)別的，例如：動脈血中氧濃度為12%，成年人組織中平均氧濃度為3%～5%[17-18]。因此關(guān)于不同氧濃度對細(xì)胞影響的研究也取得了一定的成果，這包括干細(xì)胞[2-3]、成體細(xì)胞[4]等。在對成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，在低氧環(huán)境中細(xì)胞增殖、存活率、集落生成、分化能力有明顯的提升[5-7]。

線粒體是細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布的細(xì)胞器。有研究指出，在卵母細(xì)胞成熟過程中線粒體的功能成熟是細(xì)胞質(zhì)成熟的一個重要指標(biāo)，其分布和代謝活性是細(xì)胞質(zhì)成熟的重要標(biāo)志，并且在成熟的細(xì)胞質(zhì)中具有線粒體重分布的能力[8]；并指出影響線粒體分布很重要的一個因素就是卵母細(xì)胞的成熟和胚胎的發(fā)育[19]，線粒體在未成熟的細(xì)胞中以周邊分布為主，而成熟的細(xì)胞則以均勻分布為主。也有研究者提出，線粒體的特征可作為干細(xì)胞性能維持的“干性”指標(biāo)，在干細(xì)胞增殖分化的過程中，線粒體有著較明顯的變化，線粒體形態(tài)、定位等特性是評定多能性干細(xì)胞是否具備多能性的標(biāo)志[10]。有研究顯示，在小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的研究過程中發(fā)現(xiàn)，分化后細(xì)胞的線粒體膜電位、活性氧(ROS)水平及線粒體鈣含量等參數(shù)要低于分化前的細(xì)胞，證實了小鼠胚胎干細(xì)胞分化后線粒體功能下降[13]。同時還有研究表明，線粒體動力學(xué)和分布的正常運行對細(xì)胞生存是至關(guān)重要的，尤其是神經(jīng)細(xì)胞[20]。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行生命活動的主要能量來源，細(xì)胞通過線粒體的氧化磷酸化生成ATP供能，在低氧環(huán)境中線粒體氧化磷酸化過程受到抑制影響ATP的生成。但是有研究證明，在緩慢持續(xù)的低氧環(huán)境中線粒體的功能會得到恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，MEFs在轉(zhuǎn)入低氧環(huán)境中后，ATP水平出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象，隨時間的增加，ATP水平逐漸上升。這也說明線粒體功能在低氧初期受到了一定的影響，后期功能恢復(fù)正常。

MEFs傳代貼壁，處于分裂增殖旺盛期時，細(xì)胞核相對細(xì)胞質(zhì)活躍，線粒體需要圍繞細(xì)胞核為細(xì)胞的分裂增殖提供大量的能量，線粒體主要分布在細(xì)胞核周圍；絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的線粒體核周分布類型。MEFs經(jīng)過對數(shù)生長期的生長與增殖，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞密度增大，在一定程度上抑制了細(xì)胞的分裂，在此期間，細(xì)胞產(chǎn)生的能量更多的是為了維持細(xì)胞的形態(tài)和各項功能的正常，所以細(xì)胞質(zhì)相對細(xì)胞核較為活躍，大多數(shù)線粒體表現(xiàn)為均勻分布型，為維持細(xì)胞的正常生理功能提供能量。相對常氧培養(yǎng)環(huán)境，低氧環(huán)境對細(xì)胞分裂增殖的促進(jìn)作用更為明顯，線粒體核周分布狀態(tài)持續(xù)時間更長，在細(xì)胞分裂增殖期間，線粒體生成的ATP水平更高，這有利于細(xì)胞的分裂、增殖。本研究結(jié)果中，低氧培養(yǎng)條件下MEFs在經(jīng)過細(xì)胞的分裂增殖后活細(xì)胞數(shù)量多于常氧培養(yǎng)也證實了這一說法。

綜上所述，低氧培養(yǎng)條件對MEFs生長和線粒體分布及功能具有較大的影響。但對于低氧培養(yǎng)條件影響MEFs線粒體功能的相關(guān)機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究。

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Effects of hypoxia on the growth,mitochondria distribution and function of mouse embryonic fibroblast*

WangChun，WeiHanqing，PeiYijin△

(PhysiologyTeachingandResearchSection,InstituteofStemCellandRegenerativeMedicine/DepartmentofBasicMedicalSciences,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China)

Objective To explore the effects of hypoxia on the growth,mitochondria distribution and function of mouse embryonic fibroblasts(MEFs).Methods MEFs were sub-cultured in the hypoxia group containing 5% oxygen and normal oxygen group containing 20% oxygen,every 24 hours,living MEFs were counted by using trypan blue staining.Mito-Tracker Green was used to stain mitochondria,then cells were observed by using laser confocal microscope.The ATP kit was used to detect ATP synthesis.Results During the logarithmic phase,the numbers of living cells in the hypoxia group were higher than those in the normal oxygen group,the differences were statistically significant (P<0.05).The percentages of perinuclear mitochondrial in the hypoxia group were higher than those in the normal oxygen group,the differences were statistically significant (P<0.05).Meanwhile,the significant difference was found in the ATP level between the two groups (P<0.05).Conclusion The distribution of mitochondria in MEFs and energy synthesis are influenced by the hypoxic culture condition,which could be better for promoting cell growth compared with normal oxygen culture condition.

hypoxia；mouse embryonic fibroblasts；mitochondrial distribution；adenosine triphosphate

國家自然科學(xué)基金項目(81173136)；廣東省科技計劃項目(2013B022000003)；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究專項(廣東省自然科學(xué)基金)(2015A030313524)；廣東省東莞市國際科技合作(含港澳臺)項目(2015508102004)。 作者簡介：王春(1990-)，在讀碩士，主要從事干細(xì)胞與發(fā)育毒性方面的研究?！?/p>

，E-mail：pyj@gdmu.edu.cn。

R394.1；R329.2+5

A

1671-8348(2017)19-2599-05

2017-02-03

2017-04-08)