基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構建及免疫效果研究

趙佳琪，王婉瑩，范業(yè)寧，馬春平，張東紅，呂 揚，趙 臣

(吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林 132013)

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基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構建及免疫效果研究

趙佳琪，王婉瑩，范業(yè)寧，馬春平，張東紅，呂 揚，趙 臣△

(吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林 132013)

目的 構建pIRES2-MLAA34-HSP70重組質粒，并檢測其免疫效果。方法 采用逆轉錄PCR(RT-PCR)的方法提取急性單核細胞白血病相關抗原基因MLAA-34和熱休克蛋白(HSP)70基因，設計特異性重疊引物，以重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術擴增MLAA34-HSP70融合基因，構建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70。將核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，檢測小鼠脾淋巴細胞對U937細胞的殺傷作用及小鼠脾細胞懸液中白細胞介素(IL)-2、IL-4和γ干擾素(IFN-γ)水平。結果 擴增出MLAA34-HSP70融合基因2 956 bp，成功構建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70，經鑒定與預期結果一致；脾淋巴細胞殺傷活性結果顯示，核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70對U937細胞的殺傷效率明顯高于其他實驗組及對照組(P<0.01)；核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70組細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明顯高于其他實驗組及對照組(P<0.01)。結論 成功構建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗，該核酸疫苗能誘發(fā)強烈的體液免疫，增強機體對腫瘤細胞的免疫應答，對MLAA34陽性細胞具有特異性殺傷作用。

疫苗，DNA；重疊延伸PCR；白血病，單核細胞，急性；MLAA-34；熱休克蛋白質類70

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因導入動物體細胞內，并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答反應，以達到預防和治療疾病的目的[1]?？乖砦换蚴呛怂嵋呙绲暮诵牟糠郑匀诤匣驗槟康幕驑嫿ê怂嵋呙缫咽菢I(yè)界的共識。將相同或相似功能的基因融合，可以增強目的蛋白的免疫原性，提高核酸疫苗的免疫保護效應。重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)采用互補末端引物，使PCR產物形成重疊鏈，從而將來源不同的多個基因片段拼接在一起[2]。利用SOE-PCR技術不需要內切酶消化和連接酶處理即可進行有效的基因重組，因而在構建融合基因、定點突變及基因敲除等方面有著廣泛的應用[3]。本研究擬采用SOE-PCR技術將急性單核細胞白血病相關抗原基因MLAA-34及熱休克蛋白70(HSP70)融合為MLAA34-HSP70融合基因，進而構建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70，免疫BALB/c小鼠并檢測其脾淋巴細胞對U937細胞的殺傷效應，為核酸疫苗的抗腫瘤研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 U937細胞、pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-HSP70質粒為本課題組保存。BALB/c鼠[無特定病原體(SPF)級，雌性，6～8周齡]購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。噻唑藍(MTT)試劑、限制性內切酶(EcoRⅠ/BamHⅠ)購自美國NEB公司，總RNA提取試劑盒、無內毒素質粒提取試劑盒、逆轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒、T4 DNA連接酶、膠回收純化和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，胎牛血清、RPMI 1640(高糖)培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；無水乙醇、氯仿等常規(guī)試劑均為國產分析純。

1.2 引物設計與合成 根據質粒pIRES2-EGFP多克隆位點情況選取EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點進行基因克隆。MLAA-34基因(GenBank：AY288977.2)擴增片段理論長度為1 014 bp，HSP70基因(GenBank：NM_005345.5)擴增片段理論長度為1 927 bp，P2和P3引物設計重疊序列GGC GGC GGC GGC GGC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 引物堿基序列

1.3 細胞培養(yǎng)及基因提取

1.3.1 U937細胞培養(yǎng) U937細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2，收集U937細胞并調整細胞濃度至2×105/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加U937細胞100 μL作為脾淋巴細胞殺傷活性實驗的靶細胞。

1.3.2 MLAA-34基因提取 U937細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中， 37 ℃ 5%CO2，收集培養(yǎng)的U937細胞，Trizol法抽提總RNA，逆轉錄合成互補RNA(cRNA)，分別以P1/P2和P3/P4為引物，嚴格按照試劑盒說明書進行RT-PCR。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。RT-PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化PCR產物。

1.4 SOE-PCR擴增MLAA34-HSP70融合基因 將回收純化的PCR產物，MLAA-34和HSP70目的基因片段作為模板，以P1、P4為引物，采用SOE-PCR法擴增融合基因MLAA34-HSP70。SOE-PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化PCR產物。

1.5 核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構建及鑒定 提取質粒pIRES2-EGFP，與回收的MLAA34-HSP70融合基因片段分別進行EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，37 ℃ 1.5 h，酶切產物經瓊脂糖電泳回收純化，利用T4 DNA連接酶將MLAA34-HSP70融合基因亞克隆至pIRES2-EGFP質粒中，16 ℃連接過夜，構建pIRES2-MLAA34-HSP70重組質粒。將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞，并在卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)。將卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基上生長的陽性轉化克隆子編號，用接種環(huán)挑取克隆子(不要完全挑完)于3 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，次日提取pIRES2-MLAA34-HSP70質粒并進行PCR擴增和酶切鑒定。

1.6 核酸疫苗免疫BALB/c小鼠 質粒DNA大量制備和純化(按試劑盒說明書進行)并用生理鹽水調整至1.0 g/L。BALB/c鼠40只，分為4組，每組10只。對照組(A組)、實驗組(B、C、D組)分別在小鼠兩側股四頭肌肌內注射空質粒pIRES2、pIRES2-MLAA34、pIRES2-HSP70和pIRES2-MLAA34-HSP70，每只100 μg。小鼠每次接種前24 h，均用0.25%布比卡因100 μL預處理。在0、2、4周進行3次同樣劑量免疫。

1.7 脾淋巴細胞懸液的制備 末次免疫后第7天，處死小鼠，置70%乙醇浸泡3～5 min，無菌取脾臟，置于不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，剪去脂肪及筋膜組織，于200目不銹鋼網篩上研碎，重懸于含5%胎牛血清的Hank′s液中，2 000 r/min離心5 min，低滲裂解紅細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基清洗3次，并調整濃度為1×107/mL。

1.8 脾淋巴細胞殺傷活性的檢測 取步驟1.7制備的脾淋巴細胞懸液，倍比稀釋。96孔細胞培養(yǎng)板各反應孔中加脾淋巴細胞100 μL，使效靶比分別為50∶1、25∶1、12.5∶1和6.25∶1(各設3個復孔)，在37 ℃ 5%CO2中孵育24 h，測定每組小鼠特異性淋巴細胞殺傷活性。反應結束后，每孔加入20 μL MTT工作液，37 ℃反應4 h，棄去MTT反應液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，室溫振蕩10 min，酶標儀測定570 nm處吸光度值(A570)。脾淋巴細胞殺傷活性(%)=[1-(反應孔A570-效應細胞對照孔A570)/靶細胞對照孔A570]×100%。

1.9 細胞因子水平的檢測 將步驟1.7制備的脾淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL(各設3個復孔)，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h，以純化的MLAA-34蛋白(20 μg/mL)刺激抗原。以刀豆蛋白A(ConA，10 μg/mL)為陽性對照，未用抗原刺激孔為陰性對照，培養(yǎng)48 h后收集上清液，ELISA法檢測細胞因子，包括白細胞介素(IL)-2、IL-4和干擾素-γ(IFN-γ)水平(嚴格按照試劑盒說明書操作)。

2 結 果

2.1 SOE-PCR擴增MLAA34-HSP70融合基因結果 以MLAA-34基因和HSP70基因為模板，以P1、P4為引物，采用SOE-PCR法擴增MLAA34-HSP70融合基因，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見圖1。

1：標記物；2：MLAA34-HSP70融合基因；3：HSP70基因；4：MLAA34基因

圖1 MLAA34-HSP70融合基因擴增結果

2.2 核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構建及鑒定 將質粒pIRES2-EGFP與MLAA34-HSP70融合基因分別進行EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，采用T4連接酶將MLAA34-HSP70融合基因與pIRES2-EGFP載體連接，構建重組質粒pIRES2-MLAA34-HSP70，挑取陽性克隆菌，擴增后提取重組質粒進行PCR及EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，經1.0%瓊脂糖電泳鑒定，見圖2。

2.3 脾淋巴細胞殺傷活性的檢測 將核酸疫苗分組免疫小鼠后，檢測致敏脾淋巴細胞對U937細胞的殺傷效率，見表2。其中，核酸疫苗D組的殺傷效率明顯高于A、B、C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而A、B、C組殺傷效率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 細胞因子水平的檢測 脾淋巴細胞懸液經純化的MLAA-34蛋白刺激后，ELISA法檢測脾細胞上清液中細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平，見表3。核酸疫苗D組的細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平明顯高于A、B、C組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。B組和C組上述各細胞因子水平明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。B組和C組間上述各細胞因子水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1：標記物；2：pIRES2-MLAA34-HSP70重組質粒；3：雙酶切鑒定結果；4：PCR鑒定結果

圖2 重組質粒pIRES2-MLAA34-HSP70的鑒定

*：P<0.01，與D組比較

表3 小鼠脾淋巴懸液細胞因子水平比較

*：P<0.01，與A組比較；#：P<0.01，與D組比較

3 討 論

核酸疫苗制作簡單、應用安全，是白血病免疫治療的策略之一。核酸疫苗導入宿主體內后可被抗原提呈細胞或機體組織細胞攝取，在細胞內表達蛋白抗原，刺激機體產生細胞免疫和體液免疫，免疫保護作用好[4]。在構建核酸疫苗時筆者使用了SOE-PCR技術，將MLAA-34基因和HSP70基因融合在一起，形成MLAA34-HSP70融合基因。MLAA-34基因與急性單核細胞白血病的發(fā)生密切相關，其表達下調能顯著抑制U937細胞在體外的增殖，同時會誘發(fā)白血病細胞的凋亡，是理想的急性白血病免疫治療的靶基因[5-7]。HSP70參與腫瘤基因調控及細胞增殖，具有抗原遞呈功能，能強烈刺激免疫系統(tǒng)針對腫瘤抗原的免疫反應，進而誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫應答，以HSP為基礎的腫瘤疫苗是目前腫瘤疫苗研究中的熱點[8-9]。

SOE-PCR技術的關鍵主要在于引物的設計，在設計引物時，重疊序列可以是基因序列上的任意位點，不需要考慮融合位點及其附近的特殊序列。通過特定的重疊互補序列的引物作為橋梁，從而使PCR擴增產物末端形成了相同的重疊鏈，通過重疊鏈的延伸將PCR擴增片段拼接起來，從而將兩個目的基因融合在一起，相比于限制性內切酶的酶切和連接酶的連接更加簡便快捷[10]。因此，在融合基因、突變體分子的構建過程中，特別是在人類體細胞敲除、疫苗的研究、多克隆抗體的產生，以及在植物基因工程中具有廣泛的應用[11-13]。本研究設計引物時采用柔性肽基因GGC GGC GGC GGC GGC作為重疊序列，融合蛋白MLAA-34和HSP70之間以柔性肽相連接，保證了兩個蛋白融合表達且正確折疊，MLAA-34和HSP70皆能發(fā)揮其獨特功能，從而保證了核酸疫苗的免疫活性。實驗表明，核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70免疫BALB/c小鼠后，致敏脾淋巴細胞對U937細胞具有較強的殺傷效率，明顯高于其他實驗組和對照組，說明核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70能有效地刺激機體產生針對U937細胞的特異性殺傷作用；此外，致敏小鼠脾細胞培養(yǎng)液中細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平明顯增高，說明該核酸疫苗能誘發(fā)強烈的體液免疫，增強機體對腫瘤細胞的免疫應答，具有明顯的免疫保護作用。

[1]宋曉暉，陳洪鎖，孫雅楠，等．白血病疫苗的研究進展[J]．吉林醫(yī)藥學院學報，2013，34(3)：208-212．

[2]Thornton JA． Splicing by overlap extension PCR to obtain hybrid DNA products[J]．Methods Mol Biol，2016，1373：43-49．

[3]彭雷，趙艷，馬銀花．基于巢式PCR的重疊延伸PCR優(yōu)化[J]．安徽農業(yè)科學，2016，44(20)：126-127．

[4]Donnelly JJ，Wahren B，Liu MA．DNA vaccines:progress and challenges[J]．J Immunol，2005，175(2)：633-639．

[5]Zhao J，He A，Zhang W，et al．Quantitative assessment of MLAA-34 expression in diagnosis and prognosis of acute monocytic leukemia[J]．Cancer Immunol Immunother，2011，60(4)：587-597．

[6]Zhang WJ，Zhang WG，Zhang PY，et al．The expression and functional characterization associated with cell apoptosis and proteomic analysis of the novel gene MLAA-34 in U937 cells[J]．Oncol Rep，2013，29(2)：491-506．

[7]趙天宇，趙佳琪，范業(yè)寧，等．pIRES2-MLAA34-EGFP穿梭載體的構建及表達[J]．吉林醫(yī)藥學院學報，2016，37(3)：184-187．

[8]游朝勇．HSP70與惡性腫瘤關系的研究進展[J]．實用癌癥雜志，2012，27(1)：89-91，94．

[9]Guzhova IV，Margulis BA．HSP70-based anti-cancer immunotherapy[J]．Hum Vaccin Immunother，2016，12(10)：2529-2535．

[10]Dahm P，Jennewein S．Introduction of the early pathway to taxol biosynthesis in yeast by means of biosynthetic gene cluster construction using SOE-PCR and homologous recombination[J]．Methods Mol Biol，2010(643)：145-163。

[11]張旻，姜紹通，鄭娟，等．潮霉素B抗性為選擇標記的整合型表達載體的構建及在米根霉中的遺傳轉化[J]．生物工程學報，2015，31(8)：1203-1218．

[12]Yuelan Z，Yiwei L，Liyuan L，et al．Expression and identification of the ADF-linker-3-1E gene of Eimeria acervulina of chicken[J]．Parasitol Res，2016，115(4)：1641-1647．

[13]Li B，Ye J，Lin Y，et al．Preparation and identification of a single-chain variable fragment antibody against Newcastle diseases virus F48E9[J]．Vet Immunol Immunopathol，2014，161(3/4)：258-264．

Study on immune effect of DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 constructed by SOE-PCR*

ZhaoJiaqi，WangWanying，F(xiàn)anYening，MaChunping，ZhangDonghong，LvYang，ZhaoChen△

(InspectionCollegeofJilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin132013,China)

Objective To construct the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70,and to detect its immune effect.Methods The acute monocytic leukemia associated antigen gene MLAA-34 and heat-shock protein (HSP)70 gene were extracted by using RT-PCR.The specific overlapping primer was designed,and the fusion gene MLAA34-HSP70 was amplified by using SOE-PCR technique.Then the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 was constructed,and BALB/c mice were immunized with this DNA vaccine.The splenic lymphocyte killing activity was detected by using MTT,levels of IL-2,IL-4 and IFN-γ were also detected by using ELISA.Results The MLAA34-HSP70 gene (2 956 bp) and the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 was amplified and constructed successfully.The killing efficiency of DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 in U937 cells was significantly higher than that in other experimental groups and control group (P<0.01),and levels of IL-4,IL-2 and IFN-γ in DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 group were significantly higher than those in the other experimental groups and control group (P<0.01).Conclusion The DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 is constructed successfully.It is shown that the DNA vaccine induces strong humoral immunity,which could enhance immune responses to tumor cells and specificlly kill MLAA34 positive cells.

vaccines，DNA；gene splicing by overlap extension PCR；leukemia，monocytic，acute；MLAA-34；heat-shock protein 70

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.006

吉林省科技廳自然科學基金資助項目(20160101179JC)；吉林省衛(wèi)生和計劃生育委員會項目(2015Z071)；吉林省教育廳“十三五”科技項目(JJKH20170416KJ)；吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課題(2015024)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201613706019)。 作者簡介：趙佳琪(1996-)，在讀本科，主要從事血液系統(tǒng)疾病免疫治療方面的研究?！?/p>

，E-mail：s2209503@sina.com。

R733.7

A

1671-8348(2017)19-2612-03

2016-11-18

2017-02-06)