重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis對大鼠FHF的影響

蔡鵬程，元文峰，丁 浩△

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006；2.樂安縣人民醫(yī)院內(nèi)二科，江西撫州 344300)

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重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis對大鼠FHF的影響

蔡鵬程1，元文峰2，丁 浩1△

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006；2.樂安縣人民醫(yī)院內(nèi)二科，江西撫州 344300)

目的 探討重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis導(dǎo)入大鼠對暴發(fā)性肝功能衰竭(FHF)的影響。方法 利用流體力學(xué)的方法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis導(dǎo)入大鼠肝臟，48 h后用內(nèi)毒素(LPS)+D-半乳糖胺(D-GalN)誘導(dǎo)大鼠FHF；利用熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測C-sis表達；利用蘇木精-伊紅(HE)染色及測定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性檢測凋亡；利用Western Blotting檢測Bcl-2和Bax的表達變化；計算大鼠24 h觀察期內(nèi)的死亡率。結(jié)果 FHF+C-sis質(zhì)粒組的C-sis mRNA和蛋白表達水平較正常對照組和FHF+空載質(zhì)粒組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常對照組相比，F(xiàn)HF+林格液注射組和FHF+空載質(zhì)粒組肝臟細(xì)胞凋亡增多；與FHF+空載質(zhì)粒組相比，F(xiàn)HF+C-sis質(zhì)粒組肝臟細(xì)胞凋亡減少。與正常對照組相比，F(xiàn)HF+林格液注射組大鼠肝臟組織中Caspase-3的表達增多(P<0.01)；與FHF+空載質(zhì)粒組相比，F(xiàn)HF+C-sis質(zhì)粒組大鼠肝臟組織中Caspase-3的表達減少(P<0.05)。與正常對照組相比，F(xiàn)HF+林格液注射組大鼠肝臟組織中Bcl-2表達明顯減少(P<0.01)，Bax表達明顯增多(P<0.01)；而與FHF+空載質(zhì)粒組相比，F(xiàn)HF+C-sis質(zhì)粒組大鼠肝臟組織中Bcl-2表達增多(P<0.05)，Bax表達減少(P<0.05)。在24 h觀察期內(nèi)，正常對照組大鼠均存活，F(xiàn)HF+林格液注射組及FHF+空載質(zhì)粒組大鼠死亡率分別為70.0%和80.0%；而FHF+C-sis質(zhì)粒組大鼠僅20.0%死亡。結(jié)論 C-sis基因可減弱LPS+D-GalN誘導(dǎo)的大鼠FHF。

原癌基因蛋白質(zhì)C-sis；重組質(zhì)粒；大鼠；肝功能衰竭，急性

原癌基因參與調(diào)控細(xì)胞的正常分裂、增殖、成熟及分化過程，以及組織穩(wěn)態(tài)維持過程的調(diào)控[1]。因此，原癌基因?qū)?xì)胞的正常生長及組織修復(fù)具有關(guān)鍵性作用。而原癌基因C-sis是血小板源生長因子B鏈(platelet-derived growth factor B chain，PDGF-B)的編碼基因[2]，它具有促進細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡的作用，并能增強組織修復(fù)功能[3]。暴發(fā)性肝功能衰竭(fulminating hepatic failure，F(xiàn)HF)是以急性嚴(yán)重肝損傷為特征的一種臨床綜合征[4]，缺乏有效的治療手段，病死率很高。所以，需研究其他治療FHF的有效方法。筆者假設(shè)C-sis能在受損肝臟組織的修復(fù)及FHF的治療中發(fā)揮積極作用。為此，本研究將C-sis基因?qū)氪笫蟾闻K，并用內(nèi)毒素(LPS)+D-半乳糖胺(D-GalN)誘導(dǎo)大鼠建立FHF模型，檢測大鼠肝臟的凋亡情況，且計算大鼠死亡率，以探索C-sis是否可以成為FHF治療的分子作用靶點，為治療FHF提供新的思路或切入點。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗大鼠購自江蘇常州凱文實驗動物有限公司；空載質(zhì)粒pcDNA3.1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis由本實驗室保存；總RNA快速提取試劑盒購自上海Generay生物；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific Fisher公司；引物購自上海Invitrogen生物公司；qPCR試劑盒購自Tiangen公司；GAPDH的Ⅰ抗購自Bioworld公司，C-sis的Ⅰ抗購自Abcam公司，Bcl-2和Bax的Ⅰ抗購自Santa Cruz公司；DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及蛋白低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自上海捷瑞生物工程有限公司；蘇木精購自Sigma公司；免疫組織化學(xué)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及重組質(zhì)粒的導(dǎo)入 質(zhì)量(200±10)g的SD大鼠保持每只1籠，于室溫24～25 ℃飼養(yǎng)，每12小時晝夜循環(huán)，并能自由獲取食物及水。本研究獲得南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：研臨審[2013]第42號)。重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis導(dǎo)入大鼠體內(nèi)是通過流體動力學(xué)的方法[5-6]：即大鼠吸入乙醚麻醉后，溶于15 mL林格液的800 μg裸質(zhì)粒在15 s內(nèi)被快速注射進入大鼠尾靜脈。

1.2.2 FHF的造模和分組 將大鼠分為4組，每組至少8只大鼠。其中1組設(shè)為正常對照組，其余3組大鼠均通過腹腔內(nèi)注射溶于1 mL無菌生理鹽水的相應(yīng)質(zhì)量的LPS和D-GalN(按50 μg/kg LPS+300 mg/kg D-GalN乘以大鼠體質(zhì)量得出)誘導(dǎo)FHF[7]，再分別用林格液、空載質(zhì)粒pcDNA3.1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1/C-sis進行預(yù)處理(如前所述)，即FHF+林格液注射組、FHF+空載質(zhì)粒組、FHF+C-sis質(zhì)粒組。于質(zhì)粒注射后48 h腹腔內(nèi)注射LPS+D-GalN。腹腔注射LPS+D-GalN 8 h后，提取肝組織和血液標(biāo)本。另有40只大鼠如上所述分組，在腹腔注射LPS/D-GalN 24 h后計算動物死亡率。

1.2.3 熒光定量PCR 肝組織總RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄參照說明書操作。C-sis的上游引物5′-ATG ACC CGA GCA CAT TCT GG-3′，下游引物5′-ACA CCT CTG TAC GCG TCT TG-3′；β-actin的上游引物5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游引物5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。PCR反應(yīng)體系：2×SuperReal premix plus 10 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、cDNA(加去離子水稀釋成一致濃度)8 μL。并按如下條件進行PCR擴增：95.0 ℃ 15 min，95.0 ℃ 10 s，60.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 20 s模板閱讀，共39個循環(huán)，融合曲線70～95 ℃，增量0.5 ℃ 10 s模板閱讀。最終使用熒光定量PCR分析軟件即BIO-RAD CFX Manager實施計算及分析。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 用放射免疫沉淀試驗(RIPA)提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)水平，取100 μg獲得的蛋白質(zhì)進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC膜)上，NC膜用脫脂奶粉溶液4 ℃封閉過夜；再分別以相應(yīng)比例稀釋的Ⅰ抗孵育，4 ℃過夜，用Ⅱ抗孵育NC膜2 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色照相。采用Quantity One 4.62軟件進行分析,結(jié)果以目的條帶/3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的灰度值表示。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測 肝臟組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，然后按4 μm切片，并通過蘇木精和伊紅染色，最終用光學(xué)顯微鏡觀察分析。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測Caspase-3活性 將肝臟組織固定，石蠟包埋、切片和脫蠟。切片用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷和滅活后，用Caspase-3的Ⅰ抗(抗體工作濃度為1∶100)孵育，再用相應(yīng)的Ⅱ抗孵育。切片用DAB染色，最后用蘇木精復(fù)染。顯微鏡下觀察，陽性表達呈棕黃色或棕褐色，每張免疫組織化學(xué)切片選擇3個不同的視野(×200)觀察，并判讀陽性表達強度和陽性率。染色結(jié)果按試劑說明書進行，采用半定量分析方法：評分以染色強度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比進行乘積[8]。染色強度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色記為0分，淡黃色或輕微黃色記為1分，深黃色或棕黃色記為2分，棕褐色或黑褐色記為3分。陽性細(xì)胞百分比即每張免疫組織化學(xué)切片選擇5個不同的視野(×200)觀察，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞平均數(shù)：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。每個視野均進行染色強度計分與陽性細(xì)胞百分比乘積評分，以陽性細(xì)胞百分比與染色強度的乘積進行評分：0分判為陰性，1～6分判為弱陽性，7～12分判為強陽性。

2 結(jié) 果

2.1 C-sis表達升高的鑒定 與正常對照組和FHF+空載質(zhì)粒組比較，F(xiàn)HF+C-sis質(zhì)粒組的C-sis mRNA(圖1A)和蛋白質(zhì)(圖1B)表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

*：P<0.01，與正常對照組和FHF+空載質(zhì)粒組比較

圖1 熒光定量PCR和Western Blotting檢測大鼠肝臟組織C-sis的表達

2.2 HE染色檢測結(jié)果 正常對照組：大鼠肝組織肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核呈圓形，無脂滴、炎癥、壞死等病變，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞、血竇圍繞中央靜脈呈放射狀排列；FHF+林格液注射組：可見炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞類型以中性粒細(xì)胞為主，9只大鼠肝組織內(nèi)可見散在肝細(xì)胞凋亡，1只大鼠

A:正常對照組(n=8,×100);B:正常對照組(n=8,×200);C:FHF+林格液注射組(n=10,×100);D:FHF+林格液注射組(n=10,×200);E:FHF+空載質(zhì)粒組(n=14,×100);F:FHF+空載質(zhì)粒組(n=14,×200);G:FHF+C-sis質(zhì)粒組(n=13,×100);H:FHF+C-sis質(zhì)粒組(n=13,×200)

圖2 HE染色檢測結(jié)果

肝組織廣泛性壞死，肝臟組織結(jié)構(gòu)消失，肝竇內(nèi)可見大量瘀血；FHF+空載質(zhì)粒組：可見炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞類型與FHF+林格液注射組相同，其中12只大鼠肝組織內(nèi)可見散在肝細(xì)胞凋亡，2只大鼠肝組織廣泛性壞死，肝竇內(nèi)可見大量瘀血；FHF+C-sis質(zhì)粒組：肝組織內(nèi)可見以中性粒細(xì)胞為主的小灶性炎，4只大鼠肝細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核固縮，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，1只大鼠肝組織廣泛性壞死，肝竇內(nèi)可見大量瘀血。具體結(jié)果見圖2。

2.3 Caspase-3活性檢測結(jié)果 與正常對照組比較，F(xiàn)HF+林格液注射組Caspase-3表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與FHF+空載質(zhì)粒組比較，F(xiàn)HF+C-sis質(zhì)粒組Caspase-3表達水平降低，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖3。

表1 大鼠肝臟組織中Caspase-3表達比較

*：P<0.01，與正常對照組比較；#：P<0.05，與FHF+空載質(zhì)粒組比較

A:正常對照組;B:FHF+林格液注射組;C:FHF+空載質(zhì)粒組;D:FHF+C-sis質(zhì)粒組

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝臟組織中Caspase-3的表達(×200)

*：P<0.01，與正常對照組比較；#：P<0.05，與FHF+空載質(zhì)粒組比較。A：正常對照組(n=8)，B：FHF+林格液注射組(n=9)，C：FHF+空載質(zhì)粒組(n=9)，D：FHF+C-sis質(zhì)粒組(n=9)

圖4 Western Blotting檢測大鼠肝臟組織Bcl-2與Bax的表達

2.4 動物死亡率 24 h觀察期內(nèi)各組大鼠死亡情況見表2。正常對照組大鼠均存活，F(xiàn)HF+林格液注射組和FHF+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組24 h內(nèi)大鼠死亡率分別為70.0%、80.0%；FHF+C-sis質(zhì)粒組在24 h的觀察期內(nèi)僅2只大鼠死亡，死亡率為20.0%。

表2 觀察時間內(nèi)動物死亡情況

2.5 Bcl-2和Bax的表達 與正常對照組比較，F(xiàn)HF+林格液注射組的Bcl-2表達水平明顯降低，Bax表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與FHF+空載質(zhì)粒組比較，F(xiàn)HF+C-sis質(zhì)粒組Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

原癌基因能促進正常細(xì)胞和組織增殖，并抑制其凋亡，對細(xì)胞正常生長及組織修復(fù)起到了非常重要的作用。原癌基因C-sis的基本功能是誘導(dǎo)有絲分裂信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)且能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖[9-10]。C-sis編碼蛋白PDGF-B是一種較強的化學(xué)誘導(dǎo)劑和促有絲分裂源，能誘導(dǎo)間葉組織來源細(xì)胞分裂及增殖，促進血管的再生及創(chuàng)傷愈合[11-12]。以上提示C-sis有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡，從而促進組織修復(fù)的功能。因此，筆者假設(shè)C-sis可能在受損的肝臟組織修復(fù)及針對FHF的治療中起到積極作用。FHF是由多種病因引起的，突然出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死和嚴(yán)重肝功能損傷，且在首發(fā)癥狀出現(xiàn)后的8周內(nèi)發(fā)生肝性腦病的一種臨床綜合征。其臨床特點為起病急、進展快，肝細(xì)胞廣泛壞死，且病情危重、癥狀表現(xiàn)多樣。病毒感染，尤其是乙型肝炎病毒感染為我國FHF最常見病因[13]。當(dāng)前針對FHF缺乏有效的治療手段，病死率高。所以，仍需研究其他治療FHF的有效方法。本研究結(jié)果表明，LPS/D-GalN成功誘導(dǎo)大鼠發(fā)生FHF，導(dǎo)致大鼠急性死亡，而C-sis基因表達的上調(diào)能抑制FHF誘發(fā)的肝臟細(xì)胞凋亡，降低大鼠死亡率。這與預(yù)期的實驗結(jié)果一致，即證實：C-sis基因具有抑制FHF的肝損傷作用。此外，用LPS/D-GalN處理后8 h大鼠才開始出現(xiàn)死亡，所以在LPS/D-GalN處理大鼠后8 h這個時間節(jié)點獲取大鼠肝臟。

有研究發(fā)現(xiàn)，將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進入FHF豬體內(nèi)有助于FHF的恢復(fù)[14]。還有研究表明，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞導(dǎo)入豬的肝臟內(nèi)，可用于治療D-Gal誘發(fā)的FHF[15]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌的分子能誘導(dǎo)FHF大鼠模型的肝細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，下調(diào)巨噬細(xì)胞的浸潤，將CD4+T淋巴細(xì)胞系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成抗炎狀態(tài)，并促進肝星狀細(xì)胞死亡，因此能改善FHF的肝損傷程度及肝硬化[16]。由此可見，目前針對FHF治療的研究多數(shù)集中在干細(xì)胞對受損肝臟的修復(fù)方面。干細(xì)胞是人體中保留的未成熟細(xì)胞，具有分化形成其他細(xì)胞和組織器官的潛力，可將其運用于包括FHF在內(nèi)的多種臟器疾病的治療。然而，首先由于成體干細(xì)胞產(chǎn)量很低，難以應(yīng)用于FHF的治療[17]；其次，當(dāng)FHF發(fā)生時，干細(xì)胞的獲取困難；此外，外來的干細(xì)胞輸入體內(nèi)后產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)限制了干細(xì)胞的異體移植。而將C-sis應(yīng)用于FHF的治療沒有上述問題的限制。

另外，C-sis編碼的蛋白PDGF-B能誘導(dǎo)間葉組織來源細(xì)胞分裂和增殖，對于血管再生和創(chuàng)傷愈合具有良好的促進作用[11-12]。PDGFB能刺激人纖維細(xì)胞源性外質(zhì)體釋放，后者能加速糖尿病小鼠潰瘍愈合[18]。有研究使用納米技術(shù)制作生物可降解膜，該膜能釋放重組人PDGF-B用于促進糖尿病并發(fā)的創(chuàng)面愈合[19]。PDGF-B能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的可溶性環(huán)氧化物水解酶表達水平升高，而后者被抑制可明顯減弱大鼠大動脈損傷模型的新生血管形成[20]。以上提示C-sis具有促進上述組織或細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的功能。但C-sis是否能促進肝臟組織或細(xì)胞的生長并抑制其凋亡，國內(nèi)外鮮有相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，C-sis基因表達的上調(diào)能抑制LPS+D-GalN誘導(dǎo)的FHF大鼠發(fā)生肝細(xì)胞凋亡，并降低大鼠死亡率，表明C-sis基因具有抑制FHF的肝損傷作用。

綜上所述，C-sis基因可能成為治療FHF的分子作用靶點，為FHF的治療提供了新的可能途徑。而且本研究可為包括FHF在內(nèi)的肝臟損傷的基因治療提供理論和實踐基礎(chǔ)。

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The effect of the recombinant plasmid pcDNA3.1/C-sis on FHF of rats*

CaiPengcheng1,YuanWenfeng2,DingHao1△

(1.DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China；2.theSecondDepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofLe′anCounty,Fuzhou,Jiangxi344300,China)

Objective To explore the effect of the recombinant plasmid pcDNA3.1/C-sis on fulminant hepatic failure (FHF) in rats.Methods 48 h after recombinant plasmid pcDNA3.1/C-sis being imported into rat liver by using the method of fluid mechanics,FHF in rats was induced by endotoxin (LPS)+D-galactosamine (D-GalN).With fluorescence quantitative PCR and Western blotting,C-sis expression was tested.The apoptosis of rat liver was detected by using HE staining and measuring Caspase-3 activity.The expression changes of Bcl-2 and Bax were examined through using Western blotting.The mortality rate of rats was calculated during 24 h observation period.Results Compared with the normal control group and FHF+empty plasmid group,C-sis mRNA and protein expression levels were increased significantly in the FHF+C-sis plasmid group,there were statistically significant differences(P<0.01).Compared with the normal control group,the apoptotic hepatocytes were increased in the FHF+Ringer′s solution injection group and FHF+empty plasmid group;compared with FHF+empty plasmid group,the apoptotic hepatocytes in the FHF+C-sis plasmid group were decreased.Compared with the normal control group,Caspase-3 expression level was increased in the FHF+Ringer′s solution injection group (P<0.01);compared with the FHF+empty plasmid group,Caspase-3 expression level in the FHF+C-sis plasmid group was decreased (P<0.05).Compared with the normal control group,Bcl-2 expression level was decreased significantly (P<0.01),and Bax expression level was increased significantly (P<0.01) in the FHF+Ringer′s solution injection group;compared with the FHF+empty plasmid group,the Bcl-2 expression level was increased (P<0.05),and Bax expression was decreased (P<0.05)in the FHF+C-sis plasmid group.During the 24 h observation period,all rats in the normal control group were alive;the mortality rates of the FHF+Ringer′s solution injection group and FHF+empty plasmid group were 70.0% and 80.0% respectively,while that of the FHF+C-sis plasmid group was only 20.0%.Conclusion C-sis gene could inhibit FHF in rats induced by LPS+D-GalN.

proto-oncogene proteins C-sis；recombinant plasmid；rats；liver failure,acute

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.004

國家自然科學(xué)基金資助項目(81300348)；江西省青年科學(xué)基金資助項目(20151BAB215006)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(GJJ150259)；江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目(20165199)。 作者簡介：蔡鵬程(1990-)，住院醫(yī)師，本科，主要從事消化系疾病方面的研究?！?/p>

，E-mail：efydinghao@163.com。

R575.3

A

1671-8348(2017)19-2604-04

2017-02-07

2017-04-12)