BBC3基因表達與肺鱗狀細胞癌預后的相關性及其分子機制研究

李 超，沈?qū)W遠，胡煜琳

(1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院胸心外科，重慶 402160；2.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院腎病風濕科，重慶 402160；3.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科 402160)

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BBC3基因表達與肺鱗狀細胞癌預后的相關性及其分子機制研究

李 超1，沈?qū)W遠1，胡煜琳2，3△

(1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院胸心外科，重慶 402160；2.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院腎病風濕科，重慶 402160；3.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科 402160)

目的 驗證BCL2綁定組件3(BBC3)基因表達與肺鱗狀細胞癌(LUSC)術后生存時間的相關性，探究其分子機制。方法 利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測BBC3基因在39例LUSC患者腫瘤組織標本內(nèi)的表達，并對患者進行隨訪，收集臨床生存資料。使用Kaplan-Meier法結合log rank檢驗進行生存分析，使用COX比例風險模型進行多因素生存分析。在NCI-H226細胞系內(nèi)過表達BBC3基因，利用噻唑藍(MTT)法及流式細胞術檢測其表達對細胞增殖及凋亡的影響。結果 BBC3的表達與腫瘤是否轉(zhuǎn)移(r=0.556，P=0.023)、腫瘤大小(r=0.532，P=0.042)、T分期(r=0.551，P=0.021)及TNM分期(r=0.524，P=0.047)明顯相關。Kaplan-Meier法結合log rank檢驗發(fā)現(xiàn)BBC3表達與患者生存時間明顯相關，BBC3高表達者生存時間明顯高于BBC3低表達者(χ2=7.542,P=0.006)。COX比例風險模型分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤是否轉(zhuǎn)移、腫瘤T分期、TNM分期及BBC3表達均獨立且明顯影響患者的生存時間(P<0.05)。重組BBC3質(zhì)粒組凋亡細胞比例明顯高于對照組與空載質(zhì)粒組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 BBC3基因表達可抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡，與LUSC預后具有明顯相關性，可能作為判別LUSC術后生存預測的的潛在輔助性分子標志物。

BBC3；肺；腫瘤，鱗狀細胞；預后；細胞增殖；細胞凋亡；生物學標記

肺癌是當今世界對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，肺癌因其早期不易被發(fā)現(xiàn)并且對化療和放療常產(chǎn)生耐藥，故病死率高[1]。其中肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)占所有非小細胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)的80%以上，是最常見的肺癌類型。目前，LUSC發(fā)生、發(fā)展的分子機制研究已有大量的積累，但由于缺少準確的預后分子標志物或指標，患者的5年生存率仍然處于非常低的水平[2-3]。生物芯片、高通量測序及蛋白質(zhì)譜等高通量生物技術的迅速發(fā)展，為快速有效地尋找LUSC的早期預后分子標志物提供了新的視角與方向[1，4-8]。目前，已有部分研究通過高通量技術，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的分子標志物，例如：表皮生長因子受體(EGFR)[9]、核苷酸剪切修復復合體(ERCC1)的5′核酸內(nèi)切酶[10]、原癌基因Kirsten-Rous肉瘤病毒(K-ras)[11]、核糖核苷酸還原酶的調(diào)節(jié)亞基(RRM1)[12]。但又陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，這些標志物的預測準確性及與LUSC的功能相關性都有限，且缺少多中心、大樣本研究的驗證[13-14]。因此，在本課題組的前期工作中，利用公共數(shù)據(jù)庫中收集得到的大量LUSC組織標本表達譜數(shù)據(jù)及臨床生存資料數(shù)據(jù)，結合生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了5個潛在的LUSC預后相關的基因。其中BCL2綁定組件3(BCL2 binding component 3，BBC3)還未有研究發(fā)現(xiàn)其與LUSC的關系[15]。本研究中收集39例患者LUSC組織標本及相關的臨床生存資料，并檢測BBC3基因的表達情況，進一步驗證BBC3基因與LUSC預后的相關性。同時，研究BBC3基因與癌細胞增殖與凋亡的分子機制，評估其作為LUSC預后分子診斷標志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 一般資料 LUSC組織標本均取自重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院2010-2012年手術切除的LUSC組織，患者共39例，男28例，女11例；年齡34～72歲；有吸煙史者26例，無吸煙史者13例；22例腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，17例未轉(zhuǎn)移；腫瘤大于或等于3 cm者21例，<3 cm 者18例；T分期0期20例，Ⅰ期8例，Ⅱ期11例；TNM分期Ⅰ期13例，Ⅱ期12例，Ⅲ期14例；癌胚抗原(CEA)水平高22例，正常17例；術后10例行化療，29例未行化療。所有標本均在離體后30 min內(nèi)液氮速凍，并于-80 ℃冰箱保存。術后跟蹤隨訪患者至2015年6月，記錄死亡時間與病例，每3個月隨訪1次，每次詳細記錄患者的一般體征及相關檢查結果，以手術時間為生存起始時間，以隨訪結束時間為終止時間，隨訪時間均大于3年，對于非腫瘤原因?qū)е碌乃劳鲆暈椤按婊睢?，隨訪截止時有20人死亡。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與基因過表達試驗 人肺癌NCI-H226細胞購自中國科學院細胞庫(貨號：TCHu235)。常規(guī)培養(yǎng)，接種至6孔板，待細胞生長平鋪約60%～80%，按照lipofectamine 2000TM試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書進行轉(zhuǎn)染，經(jīng)檢測無突變的重組質(zhì)粒加入量為4 μg/L，轉(zhuǎn)染細胞后加入100 mL/L胎牛血清1640培養(yǎng)液(上海遠慕生物科技有限公司)，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞48 h，挑取單克隆集落逐步擴增后傳代培養(yǎng)，以200 μg/mL G418維持。試驗設3個組，分別為無轉(zhuǎn)染空白細胞對照(NCI-H226)組，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞對照(NCI-H226-pcDNA3.1)組及重組BBC3質(zhì)粒試驗(NCI-H226-pcDNA3.1-BBC3)組。利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測BBC3基因的表達。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 利用TRIZol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA，具體步驟參考試劑盒說明。采用SYBR Green法檢測BBC3基因的表達。采用10.00 μL ABI體系，包括單鏈cDNA 1.00 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5.00 μL，上游引物和下游引物各0.45 μL(1 μmol/L)，再加去離子水3.10 μL。采用ABI Stepone qRT-PCR儀檢測。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，共40個循環(huán)。以β-actin基因作為內(nèi)參照進行PCR，用計算機軟件(StepOneTMSoftware v3.0)分析各反應的熒光強度得出反應的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。使用比較Ct值法計算目的基因的相對表達水平。引物信息見表1。

表1 PCR引物

1.2.3 Western blotting 收集細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在5%牛血清清蛋白(BSA)溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結合。Tris緩沖生理鹽水/吐溫(TBS/T)洗膜3次，每次5 min。封閉過的膜加入一級抗體(CST，貨號：4976，1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，抗原抗體結合。TBS/T洗膜3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二級抗體(CST，貨號：7467，1∶3 000稀釋)以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準，室溫孵育膜1 h。TBS/T洗膜3次，每次5 min。加入化學發(fā)光底物發(fā)光，用凝膠成像系統(tǒng)(美國Chemilumines-cenceimaging system)掃描圖像，Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度數(shù)值化，統(tǒng)計BBC3蛋白與β-actin吸光度(A)值比值。

1.2.4 噻唑藍(MTT)比色法 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度約5×104/mL，接種于96孔板，每孔加入100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底。共設置3組：對照組，空載質(zhì)粒組，重組BBC3質(zhì)粒組，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心96孔板，利用虹吸原理棄去培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上振蕩10 min。在酶標儀490 nm波長處測量各孔A值。

1.2.5 流式細胞術 3組細胞(對照組、質(zhì)粒組、重組BBC3質(zhì)粒組)取對數(shù)生長期細胞以1×105/孔接種于96孔板中，每孔2 mL體系，待細胞貼壁后換液。3組均設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化收集細胞(包括上清中的細胞)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，棄去上清液，加入5 μL磷脂結合蛋白V(Annexin V)和1 μL碘化丙啶(PI)做標記，避光15 min，再加入1×Buffer 400 μL，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，使用Sperman等級相關分析BBC3基因表達與各臨床指標間的相關性，使用Kaplan-Meier法進行生存分析，使用log rank檢驗分析單因素預后顯著性，使用COX比例風險模型進行多因素生存分析。采用Students′t檢驗計算不同組間的差異。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BBC3基因表達與臨床資料及LUSC預后的相關性 BBC3的表達與腫瘤是否轉(zhuǎn)移(r=0.556，P=0.023)、腫瘤大小(r=0.532，P=0.042)、T分期(r=0.551，P=0.021)及TNM分期(r=0.524，P=0.047)明顯相關，與年齡(r=0.231，P=0.467)、性別(r=0.215，P=0.632)、吸煙史(r=0.313，P=0.197)、CEA水平(r=0.322，P=0.124)、術后是否化療(r=0.304，P=0.226)無明顯相關性，見表2。以39份組織標本BBC3基因表達水平的中位數(shù)為界，分為BBC3高表達者(17例)與BBC3低表達者(22例)。使用Kaplan-Meier法繪制LUSC患者的生存曲線，見圖1；同時利用log rank檢驗分析BBC3表達與生存時間的相關性，結果顯示二者明顯相關，其中BBC3高表達者生存時間明顯高于BBC3低表達者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.542，P=0.006)。

2.2 多因素分析生存時間的影響因素 本研究使用COX比例風險模型對可能影響患者生存時間的多種臨床資料進行多因素分析，結果發(fā)現(xiàn)，腫瘤是否轉(zhuǎn)移、腫瘤T分期、TNM分期及BBC3表達均獨立且明顯影響患者的生存時間，見表3。

2.3 BBC3對細胞增殖的影響 Western blotting檢測3組細胞中BBC3基因表達情況見圖2A。重組BBC3質(zhì)粒組中BBC3表達明顯升高(P<0.05)，而對照組與空載質(zhì)粒組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>005)，BBC3基因的過表達試驗有效。采用MTT法檢測BBC3表達對細胞增殖能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，空載質(zhì)粒組細胞存活率為108%，重組BBC3質(zhì)粒組降低到74%；重組BBC3質(zhì)粒組與對照組及空載質(zhì)粒組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2B。

表2 患者臨床資料與BBC3表達相關性

圖1 BBC3高表達與低表達患者的生存曲線

2.4 BBC3對細胞凋亡的影響 利用流式細胞術檢測3組細胞的凋亡，對照組、空載質(zhì)粒組、重組BBC3質(zhì)粒組細胞的凋亡率分別為(51.28±6.23)%、(54.34±5.46)%及(75.08±6.24)%，其中重組BBC3質(zhì)粒組凋亡細胞比例明顯高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而對照組與空載質(zhì)粒組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3、表4。

表3 影響生存時間的多因素分析

HR：風險比

A:Western blotting檢測3組細胞內(nèi)BBC3表達；B:MTT法檢測3組細胞的增殖能力；*：P<0.05，與空載質(zhì)粒組比較

圖2 3組細胞內(nèi)BBC3的表達及細胞增殖能力

圖3 流式細胞術檢測3組細胞凋亡

組別ULURLLLR對照組0．1324．3148．5926．97空載質(zhì)粒組0．1826．1845．4828．16重組BBC3質(zhì)粒組1．2128．5923．7146．49

UL：左上角(單核細胞)；LL：左下角(活細胞)；UR：右上角(壞死及末期凋亡細胞)；LR：右下角(早期凋亡細胞)

3 討 論

傳統(tǒng)利用高通量技術篩選腫瘤標志物的技術手段，往往只單純地分析所有基因的表達情況(轉(zhuǎn)錄組學研究)，篩選出在不同組間表達存在明顯差異的基因。而后再擴大樣本量檢測某些候選標志基因的表達，進一步驗證其分型的準確性和穩(wěn)定性。而區(qū)別于傳統(tǒng)的高通量技術篩選腫瘤標志物的方式，在本課題組的前期工作中，不僅僅考慮基因在不同組間的表達差異情況(Cox生存分析)，同時，還進一步整合了基因間的調(diào)控關系信息(TF調(diào)控基因集)、基因與其他分子間的調(diào)控關系信息(miRNA靶向基因集)及基因本身的生物學功能信息(GO功能數(shù)據(jù)集)。最終利用基因表達信息(轉(zhuǎn)錄組)結合以上3種其他層面的分子信息綜合分析篩選，最后得到更具有生物學代表性的候選分子標志物，其中包括了BBC3[15]。而本研究即通過收集LUSC患者組織標本，針對前期工作得到的BBC3基因進行進一步的試驗驗證，然后利用Kaplan-Meier法及Cox比例風險分析發(fā)現(xiàn)，BBC3基因的表達確實與LUSC患者的臨床生存時間明顯相關。

為了進一步探究BBC3基因在腫瘤預后中可能的分子機制，本研究進一步對BBC3在NCI-226細胞內(nèi)進行過表達試驗，然后檢測BBC3的表達對細胞增殖及凋亡能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，BBC3的高表達可以抑制細胞的增殖并促進細胞凋亡。由此認為，在LUSC的發(fā)展過程中，BBC3基因參與細胞凋亡通路，是影響LUSC生存時間的關鍵機制。同時，BBC3基因本身也是一個經(jīng)典的促凋亡蛋白，屬于Bcl2蛋白家族成員，可與其他Bcl2蛋白家族成員結合并誘導線粒體功能紊亂，同時激活(Caspase)凋亡途徑[16]。另還有研究發(fā)現(xiàn)，其在細胞自噬過程中也起到重要作用[17]。因BBC3在凋亡過程中的重要作用，有研究認為其可能成為腫瘤治療的一個關鍵性靶點蛋白。目前已有研究證明，BBC3與胰腺導管腺癌預后明顯相關，其在生存時間長的患者腫瘤組織內(nèi)明顯高表達[18]。但目前尚缺乏研究證明其與LUSC發(fā)生、發(fā)展相關。而本研究發(fā)現(xiàn)BBC3基因的表達確實與LUSC患者的臨床生存時間呈明顯負相關。筆者認為其分子機制可能是，BBC3在LUSC組織中高表達，可促進腫瘤細胞的凋亡，有效降低術后LUSC腫瘤的復發(fā)能力。因此，筆者認為BBC3的表達高低可以作為LUSC預后的分子標志物，并可與其他預后相關的臨床資料相聯(lián)合對LUSC的預后進行判斷。

但是，受限于目前臨床樣本量，BBC3在臨床預后上的診斷價值還需要更大樣本及更長隨訪時間的研究。同時，筆者認為疾病分子標志物的真正確立，不僅需要在統(tǒng)計學上證明其疾病分類的準確性和穩(wěn)定性，還需要通過進一步的試驗探究其在疾病發(fā)生過程中的具體機制，從生物學上證明其切實有效，且可作為疾病的分子標志物用于臨床檢驗。因此，針對BBC3基因在LUSC組織中的具體分子機制研究，尤其是參與的上下游基因調(diào)控通路，將是本課題組下一步的重點工作。

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Study on the relationship between BBC3 expression and prognosis of patients with squamous cell lung neoplasms and its mechanism*

LiChao1，ShenXueyuan1，HuYulin2，3△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,YongchuanHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China；2.DepartmentofNephropathyandRheumatism,YongchuanHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China；3.DepartmentofInternalMedicine,RongchangDistrictPeople′sHospital,Chongqing402160,China)

Objective To explore the correlation between BCL2 binding component 3 (BBC3) expression and postoperative survival time of lung squamous cell carcinoma (LUSC),and investigate its molecular mechanism.Methods The expression of BBC3 in 39 patients was detected by using qRT-PCR assay.Meanwhile,clinical data of all patients were collected by follow-up visit.Then,the survival analysis was performed by using Kaplan-Meier and log rank tests.Moreover,multiple factors analysis was performed using COX proportional hazard model.At last,BBC3 was over-expressed in NCI-H226 cell lines,then detected the effects of BBC3 expression on cell proliferation and apoptosis by using MTT assay and flow cytometry.Results BBC3 expression were significantly correlated with the tumor metastasis (r=0.556，P=0.023),tumor size (r=0.532，P=0.042),T staging (r=0.551，P=0.021) and TNM staging (r=0.524，P=0.047).Meanwhile,the results of Kaplan-Meier and log rank tests found that BBC3 expression was significantly correlated with survival time of patients with LUSC,and the length of survival time in patients with high BBC3 expression was longer than that in patients with low BBC3 expression (χ2=7.542，P=0.006).The COX proportional hazard model indicated that tumor metastasis,T staging,TNM staging and BBC3 expression were independent factors which significantly affected survival time.Moreover,the proportion of apoptotic cells in the recombinant plasmid BBCs group was higher than that in the empty plasmid group and control group (P<0.05).Conclusion BBC3 expression could suppress the proliferation of tumor cells and promote apoptosis,and are significantly correlated with survival time of patients,so which may be assistant biomarkers for prognosis of LUSC.

BBC3；lung；neoplasms，squamous cell；prognosis；cell proliferation；apoptosis；biological markers

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.012

重慶市科委一般項目(cstc2016jcyjA0343)；重慶市衛(wèi)生局科研面上項目(2015MSXM058)；重慶市永川區(qū)自然科學基金(Ycstc,2015nc5004)；重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院院內(nèi)課題(YJZQN201529，YJSCI201504 )。 作者簡介：李超(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事胸部腫瘤的基礎與臨床研究?！?/p>

E-mail:lcr808@126.com。

R734.2

A

1671-8348(2017)19-2631-04

2017-03-01

2017-05-05)