基于含有活性銅的碳點電化學傳感器選擇性檢測尿酸

劉紅英+金騰飛+戴大響+焦明儒+黃成+張名鎮(zhèn)+顧春川

摘 要 采用水熱法制備了含有活性銅的碳點，利用熒光光譜和紫外可見吸收光譜對其光學性質(zhì)進行了表征。通過電沉積法將其修飾于玻碳電極表面， 構(gòu)建了電化學生物傳感器，采用循環(huán)伏安法、交流阻抗法和差分脈沖伏安法對電極的電化學行為進行了考察， 并對其電化學反應機理進行了探討。結(jié)果表明，此傳感器對尿酸具有良好的電催化效果，可有效消除抗壞血酸和多巴胺等物質(zhì)的干擾。在最佳條件下，氧化峰電流與尿酸的濃度在1.00～300 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， 檢出限為0.30 μmol/L（S/N=3）。此傳感器具有制作簡單、選擇性好、靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點，有望應用于實際樣品的檢測。

關(guān)鍵詞 活性銅； 碳點； 電化學； 生物傳感器； 尿酸

1 引 言

尿酸（UA）是人體嘌呤的代謝產(chǎn)物[1]，在體內(nèi)含量過高會導致痛風性關(guān)節(jié)炎、高尿酸血癥和Lesh Nyan綜合癥等疾病[2]。近年來，隨著生活水平提高，越來越多的人處于尿酸過高的亞健康甚至疾病狀態(tài)。由此可見，UA濃度的準確檢測在臨床醫(yī)學領(lǐng)域具有重要意義。發(fā)展靈敏、快速、低廉的UA檢測方法非常重要。

目前，UA的測定方法有色譜法[3]、分光光度法[4]、熒光法[5]、化學發(fā)光法[6]、電化學發(fā)光法[7]、電化學法[8，9]等。其中，電化學方法具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和成本低廉等優(yōu)點而廣泛應用于UA的測定[10]。然而，傳統(tǒng)電極上其氧化電位與抗壞血酸（AA）的電位接近，容易受到AA的影響[11]。為了解決這一問題，已發(fā)展很多策略。Hiroaki等[12]報道了一種銅修飾電極選擇性檢測UA。Cu可與UA形成配合物，沉積在電極表面，將AA與UA很好地區(qū)分。另一方面，納米材料具有獨特的光學與電學性質(zhì)以及比表面積大、反應活性高、吸附能力強等優(yōu)良特性，為電極的表面修飾提供了新的研究途徑[13]。

碳點是尺寸小于10.0 nm的納米顆粒，是近年發(fā)展起來的一類新型“零維”碳納米材料。由于其具有優(yōu)良的光學性質(zhì)、良好的生物相容性、化學惰性及低毒性，引起了研究者的關(guān)注，成為材料科學前沿領(lǐng)域的一個新研究熱點[14]。在過去的幾年里，碳點的研究已經(jīng)取得許多重要成果，在生物成像[15]、藥物輸送[16]、傳感器[17]及能量轉(zhuǎn)換[18]等領(lǐng)域得到很大發(fā)展。最近，Ren等利用水熱法合成了具有類酶性質(zhì)的含有活性銅的碳點（CuCDs）[19]， XPS分析該碳點中的銅呈現(xiàn)0和+1價， 該材料能夠?qū)⒒钚糟~對UA的選擇性檢測與碳點優(yōu)良的電催化性質(zhì)結(jié)合起來。

本研究首先采用水熱法合成含有活性銅的碳點，通過電沉積法將其修飾在玻碳電極表面，制備CuCDs/GCE電極，如圖1所示。利用碳點較大的比表面積和高的電子傳遞速率， 以及活性銅對電極界面上基質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移速率的促進作用和對UA的選擇性，實現(xiàn)對UA的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F4000型熒光分光光度計（日本日立公司）； Shimadzu 3600 UVVis光譜儀（日本島津公司）； CHI660A電化學工作站（上海辰華儀器有限公司），采用三電極系統(tǒng)：以飽和甘汞電極為參比電極，Pt絲電極為對電極，裸玻碳電極（GCE，φ=3 mm）或修飾玻碳電極為工作電極； ZF20D暗箱三用紫外分析儀（上海驥輝科學儀器有限公司）。

聚甲基丙烯酸鈉（PMAA，30%，Sigma 公司）； UA、AA、多巴胺（DA）、Cu（NO3）2、K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6（國藥集團化學試劑有限公司）。0.100 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）由NaH2PO4、Na2HPO4和KCl 配制，并用0.100 mol/L H3PO4或NaOH調(diào)節(jié)pH值。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

2.2 含有活性銅碳點的制備

采用水熱法一步合成含有活性銅碳點[20]： 首先稱取2.50 g PMAA和適量Cu（NO3）2于燒杯中，加入50.0 mL去離子水， 混合均勻后倒入水熱反應釜中，240℃反應9 h。 所得產(chǎn)物13000 r/min離心30 min， 去除溶液中的大顆粒殘渣。用截留分子量為1 kD的透析袋透析純化12 h， 最終在4℃下避光保存。

不含活性銅碳點的制備方法同上，所不同的是將PMAA和Cu（NO3）2的混合溶液換成PMAA溶液。

2.3 修飾電極的制備

分別用粒徑為1.00、0.30和0.05 μm的氧化鋁粉末配合麂皮打磨電極，再依次用丙酮、乙醇和去離子水超聲清洗。將其置入含有活性銅的碳點溶液中，利用電沉積法，在0～2.0 V的電位范圍以100 mV/s掃速循環(huán)掃描10圈，制得CuCDs/GCE電極。將打磨好的玻碳電極置于不含活性銅的碳點溶液中，在相同條件下電化學沉積制得CDs/GCE。

3 結(jié)果與討論

3.1 CuCDs的表征

透射電鏡（圖2A）顯示， 所合成的CuCDs具有良好的結(jié)晶性和單分散性，平均粒徑為5.5 nm。紫外可見吸收光譜（圖2B（a））顯示， CuCDs從紫外區(qū)到可見區(qū)均有吸收， 且在260 nm附近有一個明顯的紫外吸收峰。CuCDs在365 nm波長紫外燈激發(fā)下發(fā)出強的藍綠色熒光。對其熒光性能進行研究發(fā)現(xiàn)，在350 nm激發(fā)波長下獲得位于460 nm的最大發(fā)射，如圖2B（b）所示，與文獻[20]報道的一致。

3.2 修飾電極的電化學表征

CuCDs通過電沉積法形成CuCDs/GCE，沉積過程如圖3A所示。在外加電場下，表面包覆了PMAA的CuCDs以平行方式沉積到電極表面。用交流阻抗技術(shù)對此電極進行表征。圖3分別為裸GCE，CDs/GCE和CuCDs/GCE在Fe（CN）36溶液中的交流阻抗圖譜。裸GCE的電子轉(zhuǎn)移阻抗值為90.0 Ω，CDs修飾到電極表面后，其阻抗值降至78.0 Ω，表明其電子轉(zhuǎn)移阻礙性變小，說明CDs具有良好的導電性。當CuCDs修飾后，阻抗僅為68.0 Ω，表明活性銅能促進電極表面的電子傳遞，電荷傳輸電阻減小。這證明了CuCDs已成功固定于電極表面，且活性銅和碳點兩者能夠產(chǎn)生協(xié)同效應， 有利于電荷傳輸。

3.3 UA在CuCDs/GCE上的電化學響應

為了實現(xiàn)對UA的電化學檢測，考察了100 μmol/L UA在不同修飾電極上的電化學行為。如圖3C所示， UA在裸GCE上無明顯的峰，而在CDs/GCE上有一個微弱的峰，位于0.326 V。在電極表面引入CuCDs后， UA在0.299 V呈現(xiàn)一個尖銳的氧化峰， 比CDs/GCE的氧化峰電位負移了0.027 V，且峰電流增加了2.30倍。這表明CuCDs/GCE對UA的氧化具有較好的催化作用。推測原因如下：一是碳點的顆粒較小，具有非常大的比表面積和高的電子傳遞速率； 二是活性銅的引入能有效改善電極的導電性，促進了電極界面上基質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移速率； 三是活性銅在碳點表面的均勻分布更好地發(fā)揮了協(xié)同催化效應。

3.4 pH值和掃速的影響

圖4A為不同pH值下UA 在CuCDs/GCE上的循環(huán)伏安曲線。由圖4A可見，UA在pH 7.0的PBS中獲得了最大峰電流。鑒于人體體液為中性環(huán)境，故UA檢測時選擇pH 7.0的PBS為支持電解質(zhì)。UA的氧化峰電位隨pH值的增加而發(fā)生明顯負移。且與pH值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為E（mV）=0.807-0.0705pH （R2=0.995），斜率為70.0 mV/pH，與理論值59.0 mV/pH相接近[21]，表明UA的電化學反應是一個等質(zhì)子等電子的過程。根據(jù)文獻[22]，UA的氧化是一個兩電子參與的過程，因此電極上UA的反應近似為兩電子兩質(zhì)子過程，方程式如式（1）所示。

在10～200 mV/s范圍內(nèi)，研究了掃描速度對UA氧化峰電流的影響。圖4B為不同掃速下CuCDs/GCE在含有UA的PBS緩沖液中的循環(huán)伏安圖，UA的氧化峰電流隨掃速的增加而增大，且呈線性關(guān)系， 線性方程為I=0.0589V-2.58 （R2=0.9976），表明UA在CuCDs/GCE受吸附控制。

3.5 電化學檢測

最佳條件下，采用示差脈沖伏安法對不同濃度的UA進行檢測。如圖5所示，UA的氧化峰電流隨其濃度的增加而增大。在1.00～300 μmol/L范圍內(nèi)，峰電流與UA濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為I=0.0613C +1.0453 （R2=0.993），檢出限為0.30 μmol/L （S/N=3）， 比較了不同修飾電極對UA檢測的線性范圍和檢出限。如表1所示，本傳感器線性范圍更寬，檢出限更低，具有更好的檢測性能。

3.6 干擾實驗

UA的測定干擾主要來自AA、DA和葡萄糖。 在最佳條件下，分別考察1.0 mmol/L的AA和葡萄糖、0.100 mmol/L DA對UA測定的影響。如圖6A所示，此修飾電極能很好地區(qū)分AA和UA，且響應信號的相對標準偏差（RSD）小于5.0%。 DA（圖6B）和葡萄糖（圖6C）也對UA的測定無影響，說明此電極的選擇性良好。

3.7 傳感器的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

分別考察了CuCDs/GCE的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。在UA濃度為100 μmol/L時，測得6根電極的電化學響應電流的相對標準偏差為4.30%，表明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將傳感器置于4℃保存1個月，對UA測定的電化學信號標準偏差為6.50%，表明此傳感器對UA的測定具有良好的穩(wěn)定性。

3.8 實際樣品中UA濃度的測定

利用修飾電極對5份血清樣本進行了分析，并與醫(yī)院檢測結(jié)果比對（表2），結(jié)果表明，此電極可用于實際樣品的測定。

4 結(jié) 論

采用水熱法制得含有活性銅的碳點，采用電沉積法將其固定在電極表面，制得電化學傳感器。利用碳點較大的比表面積和高的電子傳遞速率，及活性銅對電極界面上基質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移速率的促進作用和對尿酸的選擇性，實現(xiàn)對尿酸的選擇性測定。此傳感器制備簡單，且能夠有效消除抗壞血酸和多巴胺對尿酸測定的干擾，表現(xiàn)出線性范圍寬、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性好、抗干擾能力強等優(yōu)點，有望應用于實際樣品的檢測。

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