高通量測(cè)序技術(shù)及其在貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用

劉敏 葉晟 楊鳳 吳立新

摘要 高通量測(cè)序是傳統(tǒng)DNA測(cè)序的一次重大技術(shù)創(chuàng)新，它為貝類(lèi)養(yǎng)殖物種的研究帶來(lái)了新的機(jī)遇。著重對(duì)454、Solexa 和 SOLiD高通量測(cè)序平臺(tái)的技術(shù)原理、數(shù)據(jù)分析及其在貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述，同時(shí)對(duì)高通量測(cè)序未來(lái)發(fā)展方向做了總結(jié)和展望。

關(guān)鍵詞 高通量測(cè)序；轉(zhuǎn)錄組；貝類(lèi)；應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）07-0130-04

High-throughput Sequencing Technology and Its Application in the Study of Shellfish Transcriptome

LIU Min，YE Sheng，YANG Feng，WU Li-xin*

（College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract High-throughput sequencing is a major technology innovation of traditional DNA sequencing， which brings new opportunities to the research of shellfish species. This review focused on their technical principles， data analysis of the 454， Solexa and SOLiD high-throughput sequencing platforms and their application in the study of shellfish transcriptome. At the same time， the future development direction of high-throughput sequencing was summarized and forecasted.

Key words High-throughput sequencing；Transcriptome；Shellfish；Application

核酸測(cè)序技術(shù)是一種重要的分子生物學(xué)分析方法，被廣泛地應(yīng)用在生物學(xué)研究中。20世紀(jì)70年代，Sanger提出了具有里程碑意義的雙脫氧核苷酸末端終止法[1]，該方法在“人類(lèi)基因組計(jì)劃”實(shí)施中發(fā)揮了巨大作用。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，第一代測(cè)序（Sanger測(cè)序）因其成本高、通量低和速度慢等缺點(diǎn)而不能滿足研究者的需求[2]。自2000年以后，高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)相繼出現(xiàn)，主要包括羅氏的454測(cè)序平臺(tái)、Illumina的Solexa測(cè)序平臺(tái) 和 ABI的SOLiD測(cè)序平臺(tái)，它們以其通量高、速度快、準(zhǔn)確度高、成本低等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用在非模式生物測(cè)序研究中。高通量測(cè)序技術(shù)在貝類(lèi)物種的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)揮了重要作用，主要應(yīng)用在貝類(lèi)分子標(biāo)記篩選、功能基因的挖掘和非編碼miRNA方面的研究中。筆者綜述了高通量測(cè)序技術(shù)的原理、數(shù)據(jù)分析及其在貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組的研究應(yīng)用，并展望了高通量測(cè)序今后的研究發(fā)展方向。

1 高通量測(cè)序的原理及測(cè)序步驟

高通量測(cè)序（High-throughput sequencing）又叫作深度測(cè)序或下一代測(cè)序，該技術(shù)是對(duì)Sanger測(cè)序的一次重大技術(shù)創(chuàng)新，在一次反應(yīng)中能對(duì)數(shù)百萬(wàn)條的核酸序列進(jìn)行測(cè)定。目前，高通量測(cè)序技術(shù)主要包括Roche/454[3]，Illumina/Solexa[4]和ABI/SOLiD 測(cè)序平臺(tái)[5]，下面主要針對(duì)這3種測(cè)序技術(shù)的原理進(jìn)行介紹。

1.1 Roche/454

454測(cè)序平臺(tái)是采用邊合成邊測(cè)序的原理，其測(cè)序步驟如下：①DNA文庫(kù)構(gòu)建，將所測(cè)核酸序列打斷成幾百bp的小片段后，在兩端分別加上特異性的接頭。②乳液PCR，上述步驟帶接頭的DNA片段會(huì)與一個(gè)磁珠結(jié)合，磁珠被擴(kuò)增試劑乳化之后，形成油包水的微反應(yīng)器系統(tǒng)。測(cè)序PCR反應(yīng)就發(fā)生在液滴包裹的微反應(yīng)器里，每一個(gè)油滴體系中只包含1個(gè)DNA模板。擴(kuò)增以后，每一個(gè)DNA分子都能進(jìn)行大量富集，最后構(gòu)成一個(gè)克隆集落。454測(cè)序儀的測(cè)序通道體積狹窄，僅僅能容納一個(gè)磁珠。③轉(zhuǎn)移至PTP 載板（Pico Titer Plate），將每個(gè)磁珠移至GS FLX測(cè)序儀載樣板的每個(gè)小孔內(nèi)，為測(cè)序做準(zhǔn)備。④焦磷酸測(cè)序，在PTP孔內(nèi)添加被激活液處理的磁珠，測(cè)序系統(tǒng)會(huì)把底物的聚合與熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)。當(dāng)發(fā)生堿基配對(duì)時(shí)，釋放的焦磷酸基團(tuán)在酶的作用下產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，獲得測(cè)序熒光信號(hào)。通過(guò)捕捉的熒光信號(hào)，就能夠達(dá)到核酸測(cè)序的目的。與其他高通量測(cè)序技術(shù)相比，454測(cè)序平臺(tái)具有測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)和速度快的優(yōu)點(diǎn)，適合基因組的重測(cè)序、從頭測(cè)序和宏基因組學(xué)等。然而，454測(cè)序平臺(tái)也存在一些缺點(diǎn)，如成本高、準(zhǔn)確率低，對(duì)相同堿基聚合區(qū)域難以處理。454 測(cè)序平臺(tái)在性能上很難有升級(jí)和突破，所以羅氏公司從2016 年起逐步停止焦磷酸測(cè)序儀的生產(chǎn)[6]。

1.2 Illumina /Solexa

Solexa測(cè)序平臺(tái)的原理是邊合成邊測(cè)序，它是基于橋式PCR和可逆終止子的反應(yīng)，測(cè)序步驟如下：①構(gòu)建文庫(kù)，首先把DNA序列隨機(jī)打斷成小片段，并在兩端加上特定的接頭。②錨定橋接，將第1步獲得的DNA 片段變性為單鏈，并和接頭引物結(jié)合，形成后續(xù)擴(kuò)增的橋狀結(jié)構(gòu)。放大反應(yīng)在帶有8個(gè)通道 的flow cell玻璃管內(nèi)進(jìn)行，每一個(gè)通道的內(nèi)表面有許多個(gè)固定的單鏈接頭。③預(yù)擴(kuò)增，添加Taq 酶和不帶標(biāo)記的底物dNTP進(jìn)行橋式PCR 擴(kuò)增。在變性時(shí)，單鏈橋型片段錨定到附近的固相表面。經(jīng)過(guò)連續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)，上百萬(wàn)條成簇的雙鏈DNA待測(cè)片段將會(huì)在flow cell 的固相表面上。④單堿基延伸測(cè)序，在flow cell玻璃管中添加DNA 聚合酶、4種不同的熒光標(biāo)記dNTP和引物進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)互補(bǔ)鏈合成時(shí)，就會(huì)釋放出帶有熒光標(biāo)記dNTP的熒光，系統(tǒng)根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)就可以推斷出待測(cè)的序列信息。

1.3 ABI/SOLiD

SOLiD測(cè)序平臺(tái)是利用連接酶在連接過(guò)程中進(jìn)行測(cè)序的原理，即邊連接邊測(cè)序。 SOLiD測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和微乳滴 PCR 擴(kuò)增與454技術(shù)類(lèi)似，只是SOLiD的微珠更小，只有1 μm。它的特點(diǎn)是采用雙堿基編碼技術(shù)（two-base encoding）進(jìn)行誤差校正，其測(cè)序步驟如下：①制備單鏈DNA文庫(kù)，將DNA待測(cè)序列打斷成很小的片段，并在兩頭添加不同的接頭，連接載體，獲得單鏈DNA文庫(kù)。②微乳化PCR（emulsion PCR），將帶有接頭的單鏈DNA固定在磁珠表面，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 3′端修飾。③轉(zhuǎn)移至上樣玻片，將磁珠放置在SOLiD上樣玻片（slide），準(zhǔn)備測(cè)序。④進(jìn)行雙堿基編碼測(cè)序，在體系中加入通用引物、DNA連接酶和帶有 8 個(gè)堿基單鏈熒光探針混合物（3′-XXnnnzzz-5′），此探針3′端的第1位和第2位的堿基是確定的，5′端是帶有熒光標(biāo)記的（根據(jù)種類(lèi)不同在6～8位zzz上加不同的熒光）。SOLiD測(cè)序包括5輪測(cè)序反應(yīng)，每一輪反應(yīng)又由多個(gè)連接反應(yīng)構(gòu)成。第1輪的第1次測(cè)序反應(yīng)中，當(dāng)探針3′端的第1和2位在連接酶的作用下進(jìn)行配對(duì)連接時(shí)，就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。記錄熒光顏色信息后，除去6～8 位堿基和淬滅5′末端熒光信號(hào)，也就是說(shuō)，實(shí)際上每一次測(cè)序的位置都相差5個(gè)堿基，第1輪得到第1和第2位的顏色信息。以此類(lèi)推，第2次測(cè)得第6和7位的顏色信息，第3次測(cè)得第11和12位的顏色信息，第4次測(cè)得第16和17位的顏色信息……第1輪測(cè)序之后，將新合成的鏈變性、洗脫，引物重置，進(jìn)行下一輪測(cè)序。由于之后的每一輪引物都要比前一輪引物向前移動(dòng)1位，所以第2輪將會(huì)測(cè)得第0～1位、5～6位、10～11位和15～16位等的熒光顏色信息。5輪反應(yīng)結(jié)束后，可以得到全部位置的熒光顏色信息，同時(shí)每個(gè)位點(diǎn)都會(huì)被檢測(cè)2次，準(zhǔn)確率達(dá)99.94%。SOLiD測(cè)序儀每次循環(huán)可以測(cè)75～110 bp，與Solexa技術(shù)類(lèi)似，后續(xù)的序列拼接工作需要足夠運(yùn)算能力的計(jì)算機(jī)（主要指CPU和內(nèi)存）和具有一定生物信息學(xué)操作經(jīng)驗(yàn)的處理人員[7]。

454、SOliD和Solexa技術(shù)的測(cè)序原理、運(yùn)行成本和數(shù)據(jù)輸出量均不相同，但其共同之處是不需要克隆，可以直接進(jìn)行高通量測(cè)序。此外，這3種測(cè)序技術(shù)也都要進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、片段擴(kuò)增、測(cè)序、信號(hào)捕獲等環(huán)節(jié)。研究者可以根據(jù)研究目的、試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)、測(cè)序深度來(lái)選擇測(cè)序平臺(tái)。近年來(lái)，利用高通量測(cè)序?qū)ω愵?lèi)進(jìn)行測(cè)序研究剛剛興起，加之傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序成本昂貴，使得貝類(lèi)的基因組資源缺乏。對(duì)于分析貝類(lèi)這樣的非模式生物，需要找出鄰近物種的基因組數(shù)據(jù)或較完整的轉(zhuǎn)錄組信息，若是沒(méi)有搜尋到相關(guān)信息，在經(jīng)費(fèi)允許的情況下454測(cè)序可作為首要選擇，從而為研究獲得較長(zhǎng)的序列片段。如果試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限，Solexa測(cè)序也可以在被考慮范圍之內(nèi)，主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面是可以產(chǎn)生很大的數(shù)據(jù)量，從而增加測(cè)跨區(qū)域片段的概率；另一方面是功能強(qiáng)大的軟件不斷地被開(kāi)發(fā)出來(lái)，可能使拼接序列的讀長(zhǎng)變得稍長(zhǎng)些。從這兩方面來(lái)看，Solexa測(cè)序在某種程度上也削減了短序列帶來(lái)的缺陷。

2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析步驟

2.1 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序獲得的原始讀段（raw reads），結(jié)果以fastq格式儲(chǔ)存，并被提交到NCBI SAR數(shù)據(jù)庫(kù)中。數(shù)據(jù)獲得后要對(duì)測(cè)序讀段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)測(cè)序質(zhì)量值分布和堿基分布情況，評(píng)估數(shù)據(jù)量是否滿足后續(xù)分析要求。之后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，過(guò)濾掉低質(zhì)量序列、接頭序列和核糖體，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行接下來(lái)的組裝分析。

2.2 數(shù)據(jù)組裝

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列組裝包括有參基因組裝和無(wú)參考基因組裝（從頭組裝）。

有參基因組裝：利用Scripture或Cufflinks軟件，將測(cè)序讀段比對(duì)到基因組上，再通過(guò)重疊信息得到graph，將graph中的信息進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最后獲得轉(zhuǎn)錄本。有參基因組裝具有內(nèi)存需求小、靈敏度高、污染小和拼接的轉(zhuǎn)錄本序列較完整等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些缺點(diǎn)，如依賴參考序列和軟件錯(cuò)誤比對(duì)等。

無(wú)參考基因組裝：又稱從頭組裝，常用軟件為T(mén)rinity。以Trinity軟件對(duì)樣本組裝情況為例，根據(jù)序列之間的重疊信息組裝獲得contig，再通過(guò)序列的contig和雙末端信息之間的相似性比對(duì)，然后進(jìn)行contig聚類(lèi)，而后在局部組裝得到transcript[8]。通常把最主要的transcript當(dāng)成Unigene。獲取的Unigene進(jìn)行后續(xù)的注釋、定量、基因結(jié)構(gòu)分析、基因的表達(dá)量差異和差異表達(dá)分析。

與有參基因組裝相比，從頭組裝不依賴參考序列、比對(duì)軟件，能較好地重建。但是，同樣存在缺點(diǎn)，如要有較大內(nèi)存和更高的測(cè)序深度、敏感性強(qiáng)、高相似度的轉(zhuǎn)錄本可能被合并等。

2.3 比對(duì)及注釋

利用比對(duì)軟件將組裝得到的Unigene序列和公共數(shù)據(jù)庫(kù)COG[9]、Swiss-Prot[10] 、 NR[11]、KEGG[12]進(jìn)行相似性搜查，若是Unigene序列被比對(duì)到高優(yōu)先級(jí)的數(shù)據(jù)庫(kù)，就不用進(jìn)行下一輪比對(duì)，否則仍會(huì)與之后的database比對(duì)完。在BLAST結(jié)果中，取比對(duì)到相似性最高的蛋白，最后得到這個(gè)Unigene的功能注釋信息。將NR比對(duì)的結(jié)果輸入到Blast2GO軟件[13]中，就可以獲得Unigene序列的GO注釋信息。獲得GO注釋后，通過(guò)WEGO軟件[14]可以統(tǒng)計(jì)GO功能分類(lèi)，從而了解物種的基因功能。目前，采用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括PDB、TrEMBL 和Swiss-Prot等。

3 高通量測(cè)序在貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組是指細(xì)胞或特定組織在某一狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA集合。以真核生物基因組研究為例，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比全基因組測(cè)序針對(duì)性更強(qiáng)，僅僅研究被轉(zhuǎn)錄的部分，既減小了研究范圍又降低了成本。此外，通過(guò)基因表達(dá)譜量的變化確定是否有某個(gè)特定基因，轉(zhuǎn)錄組是作為衡量功能基因組研究的一個(gè)重要指標(biāo)。近些年，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用在貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組研究中，同時(shí)大量的貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組研究文章被發(fā)表，取得了很大成果。

3.1 高通量測(cè)序在貝類(lèi)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

高通量測(cè)序技術(shù)作為一種快速開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的有效方法，越來(lái)越受到研究人員的青睞。通過(guò)高通量測(cè)序開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記主要包括簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。簡(jiǎn)單重復(fù)序列是指由2～6個(gè)核苷酸為重復(fù)基序的串聯(lián)的DNA序列組成，具有高多態(tài)性、穩(wěn)定性強(qiáng)和共顯性遺傳等特點(diǎn)，主要用于遺傳分析、遺傳圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定和分子標(biāo)記輔助育種。單核苷酸多態(tài)性是指由單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，通常用于鑒別生物體的遺傳變異。對(duì)SSR標(biāo)記而言，一般采用MISA軟件進(jìn)行SSR標(biāo)記篩查。MISA軟件是一個(gè)可以大量識(shí)別和定位SSR序列的篩查工具，同時(shí)，它還提供了一個(gè)和引物設(shè)計(jì)Primer3的接口工具，利用這個(gè)工具可以將識(shí)別的SSR轉(zhuǎn)成Primer3的格式，為設(shè)計(jì)引物提供了便利條件。Hou等[15]利用454 GS FLX測(cè)序系統(tǒng)對(duì)蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，檢測(cè)到了超過(guò)49 000 SNPs和2 700 SSRs。Wang等[16]對(duì)櫛孔扇貝（Chlamys farreri）進(jìn)行高通量測(cè)序，并與之前研究的蝦夷扇貝測(cè)序進(jìn)行比較分析，38個(gè)假定的快速演變基因和大量的SNP被辨別。Niu等[17]在對(duì)縊蟶（Sinonovacula constricta）的轉(zhuǎn)錄組研究中也檢測(cè)到大量的SSR和SNP。Franchini等[18]對(duì)中間鮑（Haliotis midae）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究獲得了數(shù)以千計(jì)的分子標(biāo)記SSR（4 707個(gè)contigs鑒定出7 381）和SNP（4 380個(gè)contigs鑒定出11 934），同時(shí)為大量的SSR設(shè)計(jì)出高質(zhì)量的PCR引物。Chen等[19]利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)河蜆（Corbicula fluminea）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定出2 151條SSR序列。此外，還有其他貝類(lèi)物種利用高通量測(cè)序技術(shù)去開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，如蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）[20]、大珠母貝（Pinctada maxima）[21]和褶紋冠蚌（Cristaria plicata）[22]等。從這些例子看出，利用454和Solexa測(cè)序技術(shù)可以大量挖掘分子標(biāo)記SSR和SNP，它成為快速開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的一條有效途徑。同時(shí)，這些分子標(biāo)記非常有助于進(jìn)一步分析群體遺傳結(jié)構(gòu)和構(gòu)建遺傳圖譜。

3.2 高通量測(cè)序在挖掘貝類(lèi)功能基因或新基因中的應(yīng)用

根據(jù)試驗(yàn)方案：①取不同發(fā)育時(shí)期或經(jīng)過(guò)脅迫（重金屬、菌、溫度或鹽度脅迫等）處理的生物個(gè)體組織，然后提取RNA。②轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，利用組裝的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行相似性比對(duì)，研究者可以尋找到功能基因、新基因或差異表達(dá)基因等。

Moreira等[23]利用454測(cè)序技術(shù)對(duì)實(shí)施體外刺激的菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，產(chǎn)生了平均讀長(zhǎng)為250 bp的974 976個(gè)高質(zhì)量讀段，利用這些讀段組裝得到51 265個(gè)contigs，其中有22 915個(gè)contigs被注釋。在注釋的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)35個(gè)contigs包括大量的免疫相關(guān)基因，并且詳盡地分析展示出幾個(gè)免疫通路和進(jìn)程的假定成員。同時(shí)，在補(bǔ)體途徑中發(fā)現(xiàn)了雙殼類(lèi)從未被描述的分子序列。和454測(cè)序技術(shù)相比，盡管Solexa序列要比454所測(cè)讀長(zhǎng)短，但是它的應(yīng)用性和測(cè)序深度要遠(yuǎn)大于454技術(shù)。Meng等[24]利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)鎘暴露的蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）進(jìn)行測(cè)序，14 240條序列被注釋。通過(guò)GO注釋和KEGG通路分析，辨別出720個(gè)基因涉及刺激反應(yīng)和302個(gè)基因涉及免疫反應(yīng)通路。此外，利用數(shù)字基因表達(dá)圖譜DGE系統(tǒng)對(duì)鰓和消化腺檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組變化，在這2個(gè)組織分別檢測(cè)到了7 556和3 002個(gè)差異表達(dá)基因。此外，Meng等[25]為了闡明銅暴露在免疫系統(tǒng)上的毒理學(xué)機(jī)制，以之前研究的蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）為材料，利用Illumina HiSeq 2000研究其鰓組織中的差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄本豐度?？偣茶b定了1 312個(gè)上調(diào)基因和2 237個(gè)下調(diào)基因。同時(shí)，顯著富集分析確定了9個(gè)GO術(shù)語(yǔ)和38個(gè)涉及銅暴露反應(yīng)的途徑。Zhang等[26]利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)美洲牡蠣（Crassostrea virginica）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析揭示其先天免疫相關(guān)基因的豐富性。測(cè)序組裝得到66 229個(gè)contigs，它涵蓋了89.4%的已發(fā)表的EST和97.9%的線粒體基因，并且39 978個(gè)contigs和unigenes被辨別和注釋。仍有26 251個(gè)contigs沒(méi)有出現(xiàn)在比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，說(shuō)明Illumina測(cè)序可以勝任轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序的工作。

Qin等[27]利用454測(cè)序技術(shù)在8個(gè)不同的早期發(fā)育階段對(duì)葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）進(jìn)行de novo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，提供了深度覆蓋的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，并注釋了大量的序列數(shù)據(jù)，同時(shí)鑒定和量化了6個(gè)獨(dú)特序列涉及生長(zhǎng)和早期發(fā)育的一些功能基因，例如腎上腺素能受體、多巴胺受體、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGFR），胰島素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，卵泡抑素前體。Huan等[28]對(duì)文蛤（Meretrix meretrix）的4個(gè)不同幼蟲(chóng)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共獲得704 671個(gè)讀數(shù)，并組裝成124 737個(gè)獨(dú)特序列（35 205個(gè)重疊群和89 532個(gè)單獨(dú)序列）。進(jìn)一步分析顯示，這些序列中的94.66%（118 075個(gè)）是低表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)對(duì)UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，15 000 215個(gè)（12.20%）序列被注釋。通過(guò)分析每個(gè)獨(dú)特序列的深度，進(jìn)行初步定量分析，大量序列顯示了4個(gè)幼蟲(chóng)階段之間的轉(zhuǎn)錄差異，其與發(fā)育、生長(zhǎng)、殼形成和免疫應(yīng)答等相關(guān)。Song等[29]利用Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)脈紅螺（Rapana venosa）的6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，對(duì)6個(gè)涉及神經(jīng)分泌功能序列進(jìn)行了量化和鑒定。對(duì)unigenes涉及的各種生物過(guò)程中的功能注釋可以刺激對(duì)該物種早期發(fā)育機(jī)制的研究，同時(shí)了解早期發(fā)育和變態(tài)的機(jī)制將有利于該物種的水產(chǎn)養(yǎng)殖。

研究者利用高通量測(cè)序技術(shù)在對(duì)其他雙殼貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組研究中也發(fā)現(xiàn)了功能基因，如櫛孔扇貝[16]、合浦珠母貝（Pinctada martensii）[30-31]、河蜆[19]、南極帽貝（Laternula elliptica）[32]、中國(guó)蛤蜊（Mactra chinensis）[33]和紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）[34]等。

3.3 高通量測(cè)序在貝類(lèi)MicroRNA發(fā)現(xiàn)和功能研究中的應(yīng)用

微小RNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸（nt）的小非編碼RNA，其在動(dòng)物和植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)節(jié)[35]。隨著更多miRNA的調(diào)節(jié)靶基因和其功能被發(fā)現(xiàn)，miRNA指導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)的廣度和重要性開(kāi)始備受關(guān)注。近年來(lái)，利用高通量測(cè)序有很多關(guān)于貝類(lèi)的miRNA研究，其研究表明miRNA控制很多細(xì)胞功能，包括代謝、增殖、凋亡和免疫等，控制了不同生物代謝通路多個(gè)基因的表達(dá)，在貝類(lèi)生長(zhǎng)和發(fā)育中扮演重要角色。

對(duì)于小RNA（miRNA）測(cè)序而言，Illumina和SOLiD測(cè)序平臺(tái)要優(yōu)于454測(cè)序平臺(tái)，因前兩者有更大的單次數(shù)據(jù)產(chǎn)出量，可以提供一定的測(cè)序深度，從而提高其測(cè)序覆蓋度。Bao等[36]對(duì)泥酣（Tegillarca granosa）血細(xì)胞miRNA進(jìn)行測(cè)序，2個(gè)小RNA文庫(kù)被構(gòu)建（對(duì)照組和Cd處理組），經(jīng)過(guò)與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，總共鑒定出215個(gè)保守的miRNA，同時(shí)在沒(méi)有泥酣參考基因組序列的情況下，利用生物分析發(fā)現(xiàn)39個(gè)泥酣特有的miRNA。在Cd刺激的文庫(kù)中有5個(gè)miRNA表達(dá)顯著上調(diào)，11個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)，上調(diào)miRNA主要涉及發(fā)育和細(xì)胞進(jìn)程，下調(diào)miRNA在胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Zhao 等[37]利用2種牡蠣物種香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）和長(zhǎng)牡蠣（C.gigas）進(jìn)行低鹽度脅迫，并對(duì)鰓組織構(gòu)建的4個(gè)小RNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。在長(zhǎng)牡蠣中鑒定出137個(gè)保守的和65個(gè)新的miRNA，同時(shí)在香港牡蠣中也鑒定85個(gè)保守的和2個(gè)新的miRNA。此外，在香港牡蠣物種中，顯示相反表達(dá)類(lèi)型的5個(gè)miRNA-mRNA互作對(duì)被辨別。對(duì)這些辨別的miRNA進(jìn)一步研究，可能會(huì)揭示其在應(yīng)答脅迫中的重要作用，從而為闡明牡蠣耐鹽的分子機(jī)理提供線索。Jiao等[38]利用Illumina/Solexa深度測(cè)序?qū)掀种槟肛怣icroRNA進(jìn)行描述和辨別，研究鑒定出258個(gè)MicroRNA，其中，205個(gè)是跨物種保守的，53個(gè)是其特有的。一些pm-miRNA被預(yù)測(cè)參與生物礦化，例如miR-2305和miR-0046。Zhou等[39]利用Illumina平臺(tái)對(duì)來(lái)自牡蠣血細(xì)胞的3個(gè)小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以研究細(xì)菌攻擊和熱脅迫后miRNA的潛在免疫調(diào)節(jié)作用。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定出199個(gè)牡蠣miRNA（71種已知的和128種新型的）。研究顯示免疫攻擊可以誘導(dǎo)表達(dá)miRNA，其可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，例如吞噬作用和凋亡。此外，一些免疫相關(guān)的表達(dá)miRNA也可以通過(guò)熱應(yīng)激來(lái)調(diào)節(jié)改善牡蠣對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。Chen等[40]也對(duì)刺激后的牡蠣血細(xì)胞miRNA進(jìn)行了免疫調(diào)節(jié)研究。關(guān)于miRNA的研究還有中間鮑[41] 和長(zhǎng)牡蠣[42]。這些在某階段特異表達(dá)的miRNA可能會(huì)在一些生物進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，因此，miRNA的測(cè)序分析將會(huì)促進(jìn)靶基因功能研究。

4 展望

近些年，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用在貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組的功能基因研究中。對(duì)于貝類(lèi)這樣的非模式生物，大多是無(wú)參考基因組序列的物種，通過(guò)高通量測(cè)序可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)信息將會(huì)豐富貝類(lèi)物種的遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)，并且有利于這些物種進(jìn)行深入的分子生物學(xué)研究。

高通量測(cè)序雖然在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和分子生物學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用，但是在大量序列的拼接上仍然有不足之處。后續(xù)的拼接（序列的準(zhǔn)確性和完整性）工作對(duì)于分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和獲取有意義的信息非常重要。在分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方面，錯(cuò)誤拼接會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記擴(kuò)增失敗，同時(shí)太短序列的拼接也會(huì)增添設(shè)計(jì)引物的困難。研究者可以著手對(duì)拼接方法和測(cè)序工藝進(jìn)行改進(jìn)，從而增加序列的拼接長(zhǎng)度。面對(duì)這些龐大的數(shù)據(jù)分析，如何得到有用的生物信息學(xué)信息將成為之后研究的熱點(diǎn)。今后高通量測(cè)序技術(shù)會(huì)在各領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用，為分子標(biāo)記和功能基因的挖掘提供一條便利的途徑，從而極大地促進(jìn)遺傳分析和分子育種方面的研究。

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