離子注入不動(dòng)桿菌的降解特性

馬睿 蔡長(zhǎng)龍 梁海鋒 嚴(yán)一心

摘要 [目的]選育能夠高效降解石油烴的不動(dòng)桿菌。[方法]采用低能N+對(duì)不動(dòng)桿菌菌株a8進(jìn)行誘變，測(cè)量離子注入前后不動(dòng)桿菌對(duì)石油烴的降解率，并研究其降解能力和降解機(jī)理。[結(jié)果]當(dāng)N+的注入能量和注入劑量分別為15 keV和8.0×1015 ions/cm2時(shí)，不動(dòng)桿菌的降解率可提高至95.03%；利用該注入?yún)?shù)對(duì)出發(fā)菌種a8進(jìn)行3次連續(xù)誘變后，獲得1株能有效降解59種烷烴的突變菌株AQ-15；結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)AQ-15降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N的酶AlmA基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酶結(jié)合位點(diǎn)之一的47th氨基酸由原來(lái)的天冬氨酸（Asp，D）變?yōu)楦拾彼幔℅ly，G），從而提高了酶的活性，達(dá)到了高效降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N的效果，揭示了離子注入后不動(dòng)桿菌降解率提高的機(jī)理。[結(jié)論]選育出1株能夠高效降解石油烴的不動(dòng)桿菌菌株AQ-15。

關(guān)鍵詞 離子注入；不動(dòng)桿菌；降解率；降解機(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào) X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）07-0001-03

Degradation Characteristics of Ion Implantation Acinetobacter

MA Rui， CAI Chang-long， LIANG Hai-feng et al

（Xian Technological University， Ion Beam Bioengineering and Biodiversity Research Center， Xian， Shaanxi 710021）

Abstract [Objective] The aim was to screen out Acinetobacter strains which could effectively degrade petroleum hydrocarbons. [Method] We mutated Acinetobacter strain a8 by low energy N+， measured degradation rate of Acinetobacter strain a8 to petroleum hydrocarbons before and after ion implantation， and studied its degradation ability and degradation mechanism. [Result] When the injection energy and injection dosage were 15 keV and 8.0×1015 ions/cm2 respectively， the degradation rate of Acinetobacter reached 95.03%； through three continuous mutation of start strain a8 under above injection parameters， a mutant strain AQ-15 which could effectively degrade 59 kinds of alkanes were obtained. The AlmA gene of AQ-15 to degrade long chain paraffin oil was analyzed by combining molecular biology techniques， and it was found that 47th amino acids changed from aspartic acid （Asp，D）into glycine （Gly，G）， and enzyme activity was improved to get target of effectively degrading long chain paraffin oil， which revealed the improvement mechanism of degradation rate of Acinetobacter after ion implantation. [Conclusion] A Acinetobacter strain AQ-15 which could effectively degrade petroleum hydrocarbons was screened out.

Key words Ion implantation；Acinetobacter；Degradation rate；Degradation mechanism

石油類(lèi)產(chǎn)品是重要的能源和工業(yè)原料，隨著其使用范圍的不斷擴(kuò)大，石油類(lèi)產(chǎn)品的排放物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞問(wèn)題也日益凸顯，石油污染治理刻不容緩[1]?？蒲泄ぷ髡咛岢隽艘幌盗兄卫硎臀廴镜募夹g(shù)，包括物理、化學(xué)、生物等方式，其中，生物治理依據(jù)微生物能以烴類(lèi)為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，將烴降解成對(duì)環(huán)境無(wú)害的產(chǎn)物 CO2和H2O的特點(diǎn)，相比物理、化學(xué)治污具有安全、效果好、成本低、處理徹底、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益俱佳并且能解決復(fù)雜環(huán)境污染問(wèn)題的有效治污手段[2]。目前已有多個(gè)菌種被證實(shí)能夠降解石油烴，周常義等[3]從受污海水中篩選出能以0#柴油為唯一碳源的不動(dòng)桿菌，該菌株在最適pH 7.0、溫度28 ℃條件下，經(jīng)過(guò)3 d培養(yǎng)，其降解率僅為38.7%～56.2%。張子間等[4]從石油污染的土壤中分離篩選出1株能夠降解石油烴的綠葉假單胞菌，并采用10 mV的He-Ne激光進(jìn)行輻照，誘變選育出1株高效降解石油烴的不動(dòng)桿菌，其在最適生長(zhǎng)條件下，比未受輻照的菌株降解相同石油烴縮短24 h。因此，采用新技術(shù)誘變選育高效石油烴降解菌株是推廣微生物治理生態(tài)環(huán)境的當(dāng)務(wù)之急。

離子注入誘變育種是將一定能量的離子束射入生物體內(nèi)，通過(guò)入射離子的能量、質(zhì)量、動(dòng)量和電荷4種因素作用，引起生物體細(xì)胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)使基因產(chǎn)生突變，再?gòu)倪@些變異的種子中篩選出正性變異種類(lèi)，經(jīng)過(guò)培育而成為新品種的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)具有變異頻率高、變異譜寬、變異快、變異穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)[5]。筆者從長(zhǎng)慶油田的含油污泥中篩選、鑒定出1株不動(dòng)桿菌，采用離子注入技術(shù)對(duì)其誘變，測(cè)定了離子注入前后不動(dòng)桿菌對(duì)石油烴的降解率，通過(guò)連續(xù)注入低能N+培育出1株不動(dòng)桿菌菌株，利用GC-MS法對(duì)其降解特性和降解能力進(jìn)行了研究，并通過(guò)不動(dòng)桿菌基因組測(cè)序，揭示了其降解率提高的機(jī)理，最終獲得了1株高效降解石油烴的不動(dòng)桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

從陜西省長(zhǎng)慶油田附近提取的含油污泥中篩選出1株能以原油為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株a8，通過(guò)分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）。

1.1.2 培養(yǎng)基。

無(wú)機(jī)鹽溶液：K2HPO4 5.00 g/L，（NH4）2SO4 1.00 g/L，MgSO4 0.25 g/L，NaNO3 2.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，K2HPO4·3H2O 1.00 g/L，pH 7.0～7.2。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.00 g/L，NaCl 10.00 g/L，酵母粉 5.00 g/L，pH 7.0～7.2?；A(chǔ)培養(yǎng)基：K2HPO4 0.50 g/L，CaCl2 0.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，NH4NO3 1.00 g/L，F(xiàn)eCl3 0.05 g/L，K2HPO4·3H2O 1.50 g/L，瓊脂粉13.00 g/L，pH 7.0～7.2。原油培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽溶液中添加原油2%，pH 7.0～7.5；原油來(lái)自于長(zhǎng)慶油田（C15～C28，黏度為128 mPa·s）。

1.1.3 儀器。采用四川成都同創(chuàng)材料表面新技術(shù)工程中心研制的生物改性離子注入設(shè)備，該設(shè)備的氣體離子源加速電壓為10～70 kV連續(xù)可調(diào)，最大束流為8 mA，束斑直徑≥100 mm。試驗(yàn)中高純氮?dú)饬髁繛? sccm，工作氣壓為1.3×10-3 Pa，加速電壓為15～20 kV，注入劑量為2.0×1015～12.0×1015 ions/cm2可調(diào)，燈絲電流為10 A，引出電壓為60 V，抑制電壓為1 kV。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化與分離。

將分離保藏的出發(fā)菌株a8置于LB固體培養(yǎng)基上30 ℃活化24 h后，觀察其生長(zhǎng)形態(tài)。挑取活化后的菌落接種到液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并于30 ℃、110 r/min條件下培養(yǎng)16 h得1#菌液。

1.2.2 離子注入不動(dòng)桿菌。

取適量1#菌液，加入無(wú)菌水稀釋至濃度為1.0×107 CFU/mL，取0.1 mL菌液均勻涂布于無(wú)菌平皿中央，無(wú)菌風(fēng)吹干制成菌膜，以N+為低能離子注入源，注入能量為15 keV，注入離子劑量分別為0和8.0×1015 ions/cm2。離子注入采用間隔式注入方式，每注入4 s后停止5 s，重復(fù)上述注入模式，直到達(dá)到所要求的注入劑量。注入后，注入劑量為0的記為M0-a8平皿，注入劑量為8.0×1015 ions/cm2的記為M0-A8平皿。取1.0 mL無(wú)菌水至注入平皿中心，用無(wú)菌刮鏟反復(fù)洗脫；取0.1 mL洗脫液涂布于已經(jīng)準(zhǔn)備好的原油培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌鏟涂抹均勻；將M0-a8平皿和M0-A8平皿上培養(yǎng)的不動(dòng)桿菌培養(yǎng)24 h后，分別挑選菌體生長(zhǎng)快、透明圈大的2個(gè)單菌落點(diǎn)接于含烴平皿上，記為M1代，編號(hào)分別為M1-a81、M1-a82（注入劑量為0），M1-A81、M1-A82（注入劑量為8.0×1015 ions/cm2）。

1.2.3 GC法石油烴降解率測(cè)定。

分別將存活的M1-a81、M1-a82、M1-A81、M1-A82不動(dòng)桿菌按5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有2%原油的液體培養(yǎng)基的三角瓶中（以石油烴為唯一碳源），置于往復(fù)式振蕩器上，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，將不同菌株的上清液倒入相應(yīng)編號(hào)的分液漏斗中，加入50.0 mL二氯甲烷，振蕩萃取，重復(fù)該萃取過(guò)程3次，收集二氯甲烷層，40 ℃蒸發(fā)至近干，置于比色管中定容至5.0 mL。以不接種的含相同石油烴濃度的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。用GC9160氣相色譜儀分析并計(jì)算石油烴降解率。

GC9160氣相色譜分析條件：檢測(cè)器FID，載氣N2，色譜柱DB-5，進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃。升溫程序：40 ℃，保持5 min；100 ℃，升溫速度10 ℃/min，保持5 min；200 ℃，升溫速度10 ℃/min，保持5 min；300 ℃，升溫速度10 ℃/min，保持5 min。

1.2.4 高效降解不動(dòng)桿菌菌株培育。

以菌株a8為出發(fā)菌株，以離子注入劑量8.0×1015ions/cm2和注入能量15 keV為注入?yún)?shù)，對(duì)該菌株進(jìn)行3輪低能N+注入誘變、培育，獲得1株高效降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)蜔N的菌株，命名為AQ-15。

1.2.5 GC-MS法石油烴降解譜測(cè)定。

以出發(fā)菌株a8為對(duì)照，利用GC-MS法分析菌株a8與菌株AQ-15降解譜的變化。將AQ-15接入液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)96 h，用正己烷萃取發(fā)酵液，進(jìn)行GC-MS殘油組分檢測(cè)分析。

取重量法中定容后溶液1.0 mL稀釋100倍作為檢測(cè)樣品。氣相色譜儀條件：毛細(xì)管色譜柱RTX-5SM，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm，長(zhǎng)度20 m，柱溫采用多階段程序升溫，初溫60 ℃，保持5 min，4 ℃/min升至130 ℃，保持2 min，再以12 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，最后以7 ℃/min升至280 ℃，保持10 min，進(jìn)樣溫度260 ℃，載氣為高純氦，恒流流量1 mL/min，分流比5∶1，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜儀條件：電離方式為電子轟擊（EI+），電離能量70 eV，離子源溫度200 ℃，檢測(cè)溫度250 ℃。

1.2.6 不動(dòng)桿菌降解機(jī)理研究。

利用生物信息學(xué)分析不動(dòng)桿菌降解機(jī)理，設(shè)計(jì)引物（正向引物：5′-atgcctgtcgaacacctgga-3′；反向引物：5′-tcaacccagcgcgtgcaccg-3′），分別以A-8和AQ-15菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：模板（約60 ng/μL）2.0 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4.0 μL，緩沖液 5.0 μL，正反向引物（20 μmol/L）各2.0 μL，3 U Taq DNA聚合酶 1.0 μL，ddH2O 35.7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；52 ℃ 2 min；72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖DNA回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行分析并翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。蛋白質(zhì)三維結(jié)果模擬由I-TASSER在線服務(wù)系統(tǒng)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不動(dòng)桿菌的鑒定

對(duì)出發(fā)菌a8在30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色圓形，不透明，邊緣不光滑，表面扁平。生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，a8為革蘭氏陰性細(xì)菌，氧化酶接觸呈陽(yáng)性，淀粉水解呈陽(yáng)性，好氧，對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，該菌株特征與不動(dòng)桿菌屬一致。

2.2 離子注入前后不動(dòng)桿菌的降解率

由表1可知，菌落M1-A82的降解率最高，達(dá)95.03%，結(jié)合對(duì)二氯甲烷萃取液分液前的觀察， M1-A82菌株的有機(jī)相顏色最淺，說(shuō)明該菌的發(fā)酵液中殘留的石油烴相對(duì)較少，該菌對(duì)石油烴的降解能力最強(qiáng)。

2.3 高效降解不動(dòng)桿菌的降解特性

采用GC-MS對(duì)出發(fā)菌株a8和誘變菌株AQ-15處理的石油殘油組分進(jìn)行分析。由圖1、2可知，出發(fā)菌株的原油中含有C8～C36的多種烷烴，而誘變菌株降解后的殘油組分中只能檢測(cè)少量的長(zhǎng)鏈烷烴，降解效果明顯，表明誘變菌株具有高效降解長(zhǎng)鏈烷烴的能力。

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，出發(fā)菌株a8可以完全降解29種化合物，而誘變后得到的菌株AQ-15可以降解59種化合物，比出發(fā)菌株能多降解30種化合物，降解能力大幅度提高。

2.4 離子注入不動(dòng)桿菌的降解機(jī)理

根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，在石油降解菌的烷烴降解酶系統(tǒng)中，降解長(zhǎng)鏈烷烴主要為長(zhǎng)鏈烷烴羥化酶AlmA[6]。為闡明突變菌株高效降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N的分子機(jī)理，依據(jù)不動(dòng)桿菌基因組測(cè)序結(jié)果，經(jīng)分析后AlmA長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N酶基因全長(zhǎng)為1 500 bp，編碼500個(gè)氨基酸，其基因序列經(jīng)Blast比對(duì)后，同源性與NCBI中報(bào)道基因相似度為98%，誘變前后AlmA降解酶DNA序列及蛋白質(zhì)序列比較如圖3所示，其中Sbjct為出發(fā)菌株，Query為誘變菌株，根據(jù)比對(duì)結(jié)果可知，突變位點(diǎn)發(fā)生在成熟肽區(qū)域，經(jīng)誘變后140th核苷酸由原來(lái)的A變?yōu)镠，相應(yīng)的47th氨基酸由原來(lái)的天冬氨酸（Asp，D）變?yōu)楦拾彼幔℅ly，G）。其酶的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)為Asp47。由此可知，天冬氨酸為極性帶負(fù)電荷酸性氨基酸，而甘氨酸為非極性氨基酸，且突變位點(diǎn)發(fā)生在酶結(jié)合位點(diǎn)Asp47，說(shuō)明突變可能改變了結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，使得酶活性有所提高。

3 結(jié)論

將低能N+注入不動(dòng)桿菌菌株a8，測(cè)定了N+注入前后不動(dòng)桿菌的降解率，當(dāng)N+的注入能量和注入劑量分別為15 keV和8.0×1015ions/cm2時(shí)，不動(dòng)桿菌的降解率有所提高，可達(dá)95.03%；利用上述離子注入?yún)?shù)對(duì)出發(fā)菌種a8經(jīng)過(guò)3次連續(xù)誘變，篩選培育后獲得了1株降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N能力較高的突變菌株AQ-15，該菌株能有效降解59種烴烷；以AQ-15為研究對(duì)象，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)其降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N的酶AlmA基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明酶結(jié)合位點(diǎn)之一的47th氨基酸由原來(lái)的天冬氨酸（Asp，D）變?yōu)楦拾彼幔℅ly，G），從而提高了酶的活性，達(dá)到了高效降解長(zhǎng)鏈?zhǔn)屯闊N的效果，揭示了離子注入后不動(dòng)桿菌降解率提高的機(jī)理。

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