大鼠背根神經(jīng)節(jié)ERK5/CREB信號(hào)通路在神經(jīng)病理性疼痛中的作用

肖 純 孫建良 浙江省嘉興市第一醫(yī)院麻醉科 嘉興 314000

盧 波 姚 娟 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（育英兒童醫(yī)院）麻醉科

·實(shí)驗(yàn)研究·

大鼠背根神經(jīng)節(jié)ERK5/CREB信號(hào)通路在神經(jīng)病理性疼痛中的作用

肖 純 孫建良 浙江省嘉興市第一醫(yī)院麻醉科 嘉興 314000

盧 波 姚 娟 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（育英兒童醫(yī)院）麻醉科

目的：探討脊髓與背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5（ERK5）信號(hào)通路在神經(jīng)病理性疼痛中的作用。方法：SD大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎（CCI）建立神經(jīng)病理性模型。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)CCI大鼠DRG磷酸化ERK5（p-ERK5）表達(dá)的變化；鞘內(nèi)注射ERK5反義寡核苷酸對(duì)CCI大鼠DRG p-CREB表達(dá)以及機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱縮足反射潛伏期（TWL）的影響。結(jié)果：CCI大鼠同側(cè)DRG p－ERK5標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加；鞘內(nèi)注ERK5反義寡核苷酸有效抑制DRG ERK5表達(dá)的同時(shí)，CCI所致的p-CREB表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）、機(jī)械與熱痛覺(jué)過(guò)敏也明顯減輕（P＜0.05）。結(jié)論：DRG ERK5參與了神經(jīng)病理性疼痛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，其部分作用是通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子CREB實(shí)現(xiàn)的。

大鼠 坐骨神經(jīng)結(jié)扎 神經(jīng)病理性疼痛 背根神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5 cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白

神經(jīng)病理性疼痛是困擾人類(lèi)健康的嚴(yán)重問(wèn)題，目前其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，臨床治療效果亦不理想。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal rootganglion，DRG）細(xì)胞是初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)元，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[1]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5（extracellular-signal regulated protein kinase 5，ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein ki?nases，MAPKs）家族的新成員，研究發(fā)現(xiàn)ERK5在DRG的活化參與了炎癥性疼痛與神經(jīng)病理性疼痛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但其機(jī)制尚不清楚[2-3]。本研究擬通過(guò)觀(guān)察坐骨神經(jīng)結(jié)扎（CCI）大鼠DRG磷酸化ERK5（p-ERK5）的表達(dá)變化，及其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CREB（cAMP response elementbinding protein）活性的調(diào)節(jié)作用，探討其在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行。第一部分，32只大鼠隨機(jī)分為坐骨神經(jīng)結(jié)扎組（CCI組）與假手術(shù)組（Sham組），每組16只。坐骨神經(jīng)結(jié)扎組大鼠參照Xie[4]的方法行坐骨神經(jīng)結(jié)扎建立神經(jīng)病理性疼痛模型；假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎。于術(shù)前1天，術(shù)后1、4、7天各處死4只大鼠取材行免疫組化試驗(yàn)，觀(guān)察大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-ERK5的表達(dá)變化。

第二部分，共60只大鼠，參照Yaksh等[5]描述的方法行鞘內(nèi)置管。于坐骨神經(jīng)結(jié)扎前36、24、12h，通過(guò)導(dǎo)管行鞘內(nèi)給藥，按鞘內(nèi)所給藥物不同隨機(jī)分為ERK5反義寡核苷酸組（AS組）、ERK5錯(cuò)義寡核苷酸組（MM組）與生理鹽水組（NS組），每組20只。其中48只大鼠于術(shù)前1天，術(shù)后1、4、7天各處死4只取材行免疫組化試驗(yàn)，觀(guān)察大鼠背根神經(jīng)節(jié)p-CREB的表達(dá)變化；其余12只大鼠，鞘內(nèi)給藥后不行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，于鞘內(nèi)給藥后12h處死取材行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，測(cè)定背根神經(jīng)節(jié)ERK5含量，評(píng)估反義寡核苷酸對(duì)ERK5表達(dá)的抑制效果。

第三部分，24只大鼠隨機(jī)分為三組，每組8只，分組與處理同第二部分。于坐骨神經(jīng)結(jié)扎前1天，術(shù)后1、4、7天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫組織化學(xué) 動(dòng)物戊巴比妥鈉（60mg/kg，腹腔注射）深麻醉下，經(jīng)升主動(dòng)脈依次灌注4℃生理鹽水 100mL、4%多聚甲醛 400mL（0.1mol/L PB，pH7.4）。取同側(cè)L4、L5DRG置于多聚甲醛后固定3h后，移至30%蔗糖脫水至組織沉底。冰凍冠狀切片，片厚25μm。切片經(jīng)0.01M的PBS沖洗3次，與0.3% H2O2、10%山羊血清孵育后，加入山羊抗p-ERK5抗體（1:200，Santa Cruz公司美國(guó)）孵育，4℃過(guò)夜。按SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。

1.4 免疫印跡 動(dòng)物在戊巴比妥鈉（60mg/kg，腹腔注射）麻醉下處死，迅速取同側(cè)L4、L5DRG移至液氮保存。將組織在預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提緩沖液（10mM HEPES，1mM Na3VO4，1.5mM MgCl2，10mM KCl，50mM NaF，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，0.5mM Phenylmethylsulfonyl fluoride，1mM Dithiothreitol， 0.02%cocktail，pH 7.9）中勻漿，加入90μL10%NP-40劇烈震蕩30s，4℃14000g離心15min，吸取上清液。Bradford法測(cè)定樣本蛋白濃度，加入4倍樣本緩沖液（mM:Tris-HCl 250，蔗糖 200，Dithiothreitol 300，0.01%考馬斯亮蘭-G和8%SDS，pH 6.8），95℃水浴5min。取等量30μg樣本加至10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，壓縮膠80V，分離膠150V。半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。3%牛血清封閉3h。加兔抗ERK5抗體（1:500，Cell Signaling Technology公司，美國(guó)），4℃孵育過(guò)夜。TBST沖洗，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:10000），室溫?fù)u床孵育1.5h，TBST沖洗，NBT/BCIP檢測(cè)反應(yīng)條帶。

1.5 鞘內(nèi)給藥 在異氟醚吸入麻醉下使用微量注射器行鞘內(nèi)給藥。根據(jù)分組不同，分別在坐骨神經(jīng)結(jié)扎前36、24、12h鞘內(nèi)注射10nmol/10μLERK5反義寡核苷酸（溶于生理鹽水），或相同劑量的錯(cuò)義寡核苷酸或生理鹽水。ERK5反義及錯(cuò)義寡核苷酸采用Nadruz[6]設(shè)計(jì)的序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行硫代磷酸化修飾，反義序列：5'-GCC?GCCGCCGCCGCCAT-3'，錯(cuò)義序列：5'-CGCGC?GCTCGCGCACCC-3'。鞘內(nèi)給藥時(shí)間大于30s，隨后用10μl生理鹽水沖洗導(dǎo)管。

1.6 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 采用von Frey纖維按Chaplan[7]報(bào)道的方法測(cè)定大鼠左后足機(jī)械縮足反射閾值（MWT）。將大鼠于置透明的有機(jī)玻璃箱中，底為1cm×1cm的鐵絲網(wǎng)，測(cè)定前使之適應(yīng)15min，以不同折力的Von Frey纖維（Stoehing公司，美國(guó)）刺激大鼠足底，從2g開(kāi)始，以u(píng)p-down法并在閾值上下刺激5次，計(jì)算50%縮足反應(yīng)閾值，最大折力為15g，大于此值時(shí)記為15g。按Hargreaves[8]報(bào)道的方法測(cè)定熱縮足反射潛伏期（TWL）。用熱輻射刺激儀（10V，50W；光斑直徑為0.8cm，浙江大學(xué)國(guó)家光學(xué)儀器技術(shù)研究中心）照射大鼠足底，記錄照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間，每只動(dòng)物測(cè)定3次，間隔3min，取平均值為T(mén)WL。

1.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)與半定量分析 隨機(jī)選取各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)4～5DRG，高倍鏡下計(jì)算DRG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目；West?ern blot條帶用Adobe Photoshop軟件進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠p-ERK5陽(yáng)性的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達(dá) 術(shù)前坐骨神經(jīng)結(jié)扎組與假手術(shù)組大鼠僅有少量背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達(dá)p－ERK5；假手術(shù)組大鼠術(shù)后p－ERK5陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量無(wú)明顯改變（圖1-A）；與假手術(shù)組比較坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠p－ERK5陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量明顯增加（P＜0.05）（圖1-B、C）。坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型建立1天后p－ERK5陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量達(dá)峰值，p－ERK5陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量增加一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（7天）（圖1-C）。

圖1 CCI對(duì)DRG p-ERK5表達(dá)的影響

2.2 鞘內(nèi)注射ERK5反義寡核苷酸對(duì)坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后DRG p-CREB表達(dá)的影響 各組基礎(chǔ)p-CREB陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；坐骨神經(jīng)結(jié)扎后各組大鼠p-CREB陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量均明顯增加，與MM組比較，AS組背根神經(jīng)節(jié)p-CREB陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量明顯降低（P＜0.05）；生理鹽水組與MM組之間p-CREB陽(yáng)性背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2-A、B、C、E）。

Western blot結(jié)果顯示，與MM組比較AS組DRG與脊髓ERK5的含量明顯降低（＞70%）（P＜0.05）；生理鹽水組與MM組之間背根神經(jīng)節(jié)與脊髓ERK5含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2-D、F）。

2.3 鞘內(nèi)注射ERK5反義寡核苷酸對(duì)坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后熱與機(jī)械痛敏的影響 各組基礎(chǔ)TWL和MWT之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后各組TWL與MWT均低于基礎(chǔ)值，與MM組比較，AS組TWL與MWT升高（P＜0.05）；生理鹽水組與MM組TWL與MWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3-A、B）。

圖2 鞘內(nèi)注射反義寡核苷酸抑制ERK5表達(dá)對(duì)CCI大鼠DRG p-CREB表達(dá)的影響

圖3 鞘內(nèi)注射反義寡核苷酸抑制DRG ERK5緩解CCI所致的熱與機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)持久可塑性改變必需有基因表達(dá)水平的改變。傷害性傳入信號(hào)通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系傳遞后，可激活多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)初級(jí)感覺(jué)和脊髓背角神經(jīng)元基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生病理性疼痛狀態(tài)下神經(jīng)系統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間的功能和結(jié)構(gòu)變化[9]。

與其它MAPKs一樣ERK5信號(hào)通路采用高度保守的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)體系進(jìn)行信號(hào)傳遞。被上游激酶磷酸化激活后，p－ERK5—ERK5的活化形式不僅催化多種胞漿蛋白磷酸化，而且迅速轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)直接或間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾發(fā)揮其生物學(xué)作用[10]。本研究中，外周神經(jīng)損傷后DRG p-ERK5表達(dá)明顯增加，鞘內(nèi)注射ERK5反義寡核苷酸抑制ERK5表達(dá)的同時(shí)，明顯減輕了CCI所致的機(jī)械和熱痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)，說(shuō)明DRG ERK5的激活參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展過(guò)程。

對(duì)ERK5信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，p-ERK5核轉(zhuǎn)位后可調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，包括MEF2C、CREB、NF-B、Fos、Zif268、Sap1等[10]。轉(zhuǎn)錄因子CREB由341個(gè)氨基酸殘基組成，CREB存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中serine133的磷酸化是其發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能的基礎(chǔ)，p-CREB先與CREB結(jié)合蛋白（CBP）結(jié)合，再共同結(jié)合到靶基因上的特定序列CRE，即可募集RNA聚合酶Ⅱ組成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。CREB結(jié)合位點(diǎn)CRE存在于許多疼痛相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，包括c-fos、zif268、cox-2、NK-1、強(qiáng)啡肽、降鈣素基因相關(guān)肽、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-de?rived neurotrophic factor BDNF）等[12～14]。研究表明，CREB依賴(lài)的基因表達(dá)是傷害性刺激誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)重塑所必須的，如突觸的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、交感神經(jīng)芽生等。在本研究中鞘內(nèi)注射ERK5反義寡核苷酸在減輕炎性痛的同時(shí)有效地抑制了CCI所致的DRG神經(jīng)元CREB的磷酸化。因此，p－ERK5參與了神經(jīng)損傷誘導(dǎo)所致的CREB活化過(guò)程，而ERK5的部分功能可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CREB依賴(lài)的基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

傷害性刺激不僅能增強(qiáng)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的興奮性，而且可增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的敏感化都參與了痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生和維持過(guò)程。Mizushima等[15]證實(shí)，ERK5在DRG的短暫（60min）活化僅參與了熱痛敏和外周敏感化產(chǎn)生，而與機(jī)械痛敏無(wú)關(guān)。本研究中，鞘內(nèi)注射ERK5反義寡核苷酸大鼠CCI后熱和機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏均明顯減輕。導(dǎo)致機(jī)械痛敏的主要原因是中樞敏化。初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的傳入信號(hào)在中樞敏感化過(guò)程中同樣起重要的作用。許多神經(jīng)遞質(zhì)的編碼基因包含CRE，例如BDNF[12]。在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元BDNF表達(dá)增加，并通過(guò)軸漿運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)脊髓背角，進(jìn)而調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元的興奮性。Obata等[3]證實(shí)背根神經(jīng)節(jié)ERK5參與了BDNF表達(dá)的調(diào)節(jié)。因此，DRG中ERK5－CREB信號(hào)通路的活化可能通過(guò)突觸傳遞間接地參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的敏感化過(guò)程。

綜上所述，DRG ERK5參與了神經(jīng)病理性疼痛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，其部分作用是通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子CREB實(shí)現(xiàn)的。

［1］LaMotte RH，Shain CN，Simone DA，etal.Neurogenic hyper?algesia:Psychophysical studies of underlying mechanisms［J］.JNeurophysiol，1991，66（1）:190-211.

［2］Katsura H，Obata K，Mizushima T，etal.Activation of extra?cellular signal-regulated protein kinases 5 in primary affer?ent neurons contributes to heat and cold hyperalgesia after inflammation［J］.JNeurochem，2007，102（5）:1614-1624.

［3］Obata K，Katsura H，Mizushima T，etal.Roles of extracellu?lar signal-regulated protein kinases 5 in spinal microglia and primary sensory neurons for neuropathic pain［J］.JNeu?rochem，2007，102（5）:1569-1584.

［4］Xie Y，Zhang J，Petersen M，etal.Functional changes in dor?sal root ganglion cells after chronic nerve constriction in the rat［J］.JNeurophysiol，1995，73（5）:1811-1820.

［5］Yaksh TL，Rudy TA.Chronic catheterization of the subarach?noid space［J］.Physiol Behav，1976，7（6）:1032-1036.

［6］NadruzWJ，Kobarg CB，Constancio SS，etal.Load-induced transcriptionalactivation of c-jun in ratmyocardium:regula?tion by myocyte enhancer factor 2［J］.Circ Res，2003，92（2）:243-251.

［7］Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，etal.Quantitative assess?mentof tactile allodynia in the ratpaw［J］.JNeurosciMeth?ods，1994，53（1）:55-63.

［8］Hargreaves K，Dubner R，Brown F，et al.A new and sensi?tivemethod formeasuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia［J］.Pain，1998，32（1）:77-88.

［9］JiRR，Strichartz G.Cell signaling and the genesis of neuro?pathic pain［J］.SciSTKE，2004，（252）:reE14.

［10］Wang X，Tournier C.Regulation of cellular functionsby the ERK5 signaling pathway［J］.Cell Signal，2006，18（6）：753-760.

［11］BonniA，Ginty DD，Dudek H，etal.Serine133-phosphory?lated CREB induces transcription via a cooperativemecha?nism that may confer specificity to neurotrophin signals［J］.MolCellNeurosci，1995，6（2）:168-183.

［12］Lonze BE，Ginty DD.Function and regulation ofCREB fam?ily transcription factors in the nervous system［J］.Neuron，2002，35（4）:605-623.

［13］Ji RR，Rupp F.Phosphorylation of transcription factor CREB in rat spinal cord after formalin-induced hyperalge?sia:relationship to c-fos induction［J］.JNeurosci，1997，17（5）:1776-1785.

［14］Tamura S，Morikawa Y，Senba E.Up-regulated phosphory?lation of signal transducer and activator of transcription 3 and cyclic AMP-responsive elementbinding protein by pe?ripheral inflammation in primary afferent neurons possibly through oncostatin M receptor［J］.Neuroscience，2005，133（3）:797-806.

［15］Mizushima T，Obata K，Katsura H，et al.Intensity-depen?dent activation of extracellular signal-regulated protein ki?nase 5 in sensory neurons contributes to pain hypersensitiv?ity［J］.JPharmacolExp Ther，2007，321（1）:28-34.

Activation of ERK 5/CREB Signaling Pathway in Dorsal Root Ganglia Contributes to Neuropathic Pain

XIAO Chun，LU Bo，YAO Juan，et al.Department of Anesthesiology,the First Hospital of Jiaxing,Jiaxing (314000),China

Objective:To explore the role of dorsal root ganglia(DRG)extracellular signal-regulated protein ki?nase 5(ERK5)signaling pathway in neuropathic pain.M ethods:Chronic constructive injury(CCI)model was made by loose ligation of sciatic nerve by chromic gut in male SD rat.The expression of p-ERK5 was investigat?ed in the DRG following ligation of sciatic nerve by using immunohistochemistry.To examine the functional con?sequences of ERK5 activation,the expression of p-CREB(cAMP response element binding protein)and hyperalge?sia response to nerve injury was test after intrathecal administrating ERK5 antisense oligonucleotides.Results:Li?gation of sciatic nerve produced sustained ERK5 activation in DRG.Knockdown of the ERK5 by antisense oligo?nucleotides suppressed the heat and mechanical hyperalgesia,and phosphorylation of CREB induced by peripher?al inflammation(P＜0.05).Conclusion:Activation of ERK5 DRG contributes to neuropathic pain by activating the transcription factor CREB.

extracellular signal-regulated protein kinase 5 neuropathic pain dorsal root ganglion cAMP re?sponse element binding protein

2012-07-30