膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對股骨頭缺血壞死的保護(hù)作用

喻鈞倫 唐曦 肖文 黃雨 羅天友* 吳少平*

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016 2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科，四川 成都 610500

激素性股骨頭壞死屬于股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head, ANFH)的一種，其發(fā)生機(jī)制涉及多種因素，既往認(rèn)為激素在體內(nèi)長期蓄積造成血液粘稠度增加，血脂增高，脂肪栓塞，造成骨的微細(xì)血管阻塞，以及骨質(zhì)合成減少，鈣質(zhì)吸收障礙，發(fā)生骨質(zhì)疏松及微細(xì)骨折，最后導(dǎo)致股骨頭缺血壞死[1,4]。隨著激素在臨床中的廣泛使用，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率也越來越高，是嚴(yán)重危害人類健康的慢性病[3]。

激素性股骨頭壞死早期股骨頭壞死區(qū)域少，變形小，治療效果較好[3,4]，目前包括物理、藥物治療及外科手術(shù)等多種治療技術(shù)[4,6]，在激素性股骨頭壞死的早期治療有積極效應(yīng)，但遠(yuǎn)期效果并不理想。因此，尋找積極有效的干預(yù)措施，防治早期股骨頭缺血壞死的發(fā)生及發(fā)展是國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。

正常股骨頭內(nèi)存在肽能神經(jīng)元，股骨頭壞死后感覺神經(jīng)損傷，調(diào)節(jié)骨內(nèi)微循環(huán)的神經(jīng)肽分泌減少，可導(dǎo)致破骨與成骨活動失衡，破骨細(xì)胞作用增強(qiáng)，骨細(xì)胞死亡，骨礦物質(zhì)含量降低，從而使骨形成減弱，造成骨質(zhì)疏松、骨小梁細(xì)微骨折等嚴(yán)重后果，故股骨頭神經(jīng)內(nèi)分泌與骨內(nèi)微循環(huán)相關(guān)研究漸受重視[7,8]。

1993年Lin[9,12]提出從大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系B49的培養(yǎng)液提純并命名——膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員之一。GDNF在體內(nèi)分布廣泛，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生長、損傷及修復(fù)過程中都具有重要神經(jīng)營養(yǎng)作用[9,12]。GDNF應(yīng)用于股骨頭壞死動物模型的研究目前尚無報(bào)道，故我們假設(shè)，股骨頭壞死發(fā)生后，GDNF可否通過對受損的神經(jīng)進(jìn)行營養(yǎng)、修復(fù)，改變其內(nèi)部微循環(huán)系統(tǒng)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)骨質(zhì)形成、穩(wěn)定骨小梁的目的。

綜上，本實(shí)驗(yàn)利用GDNF干預(yù)早期激素性股骨頭壞死兔模型，探討GDNF對激素性股骨頭壞死的保護(hù)作用，并為激素性股骨頭壞死的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級新西蘭大白兔購于成都達(dá)碩生物科技有限公司；GDNF購于美國RICKY公司；SOMATOM Definition AS+64排螺旋CT出自德國SIEMENS公司，顯微CT出自廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司，組織切片機(jī)出自美國Thermo Scientific公司，正置顯微鏡出自德國Lecia公司。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型:SPF級新西蘭大白兔，雄性，10月齡，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，按動物實(shí)驗(yàn)3R原則給予人道關(guān)懷。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用激素聯(lián)合脂多糖改良技術(shù)建立激素性股骨頭壞死兔模型[13]。建模第1、2周，隨機(jī)選取1只處死，取股骨頭組織作病理學(xué)觀察，驗(yàn)證是否發(fā)生壞死。

骨壞死診斷標(biāo)準(zhǔn)為：骨小梁內(nèi)見彌漫性骨細(xì)胞空陷窩或核皺縮，伴有周圍骨髓細(xì)胞壞死[14]。

1.2.2 藥物干預(yù)：建模完成后，采用數(shù)字表法隨機(jī)分組并標(biāo)記，分為實(shí)驗(yàn)組(n=12)、對照組(n=12)。實(shí)驗(yàn)組給予髖周肌肉注射GDNF(8.0 μg/只)，對照組相同部位注射等體積生理鹽水，干預(yù)1周。分別于第5、10、15、20 天兩組各隨機(jī)選取3只，依次進(jìn)行以下指標(biāo)的觀察。

1.2.3 螺旋CT掃描：采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(4.0 mL/kg)新西蘭大白兔，行64排螺旋CT掃描，俯臥位，選用成人胸骨序列，0.6 mm骨重建算法掃描雙髖關(guān)節(jié)，由兩名醫(yī)師共同閱片，觀察兔股骨頭形態(tài)及骨質(zhì)密度等影像學(xué)表現(xiàn)。

1.2.4 顯微CT掃描：采用空氣栓塞法處死新西蘭大白兔，解剖出股骨頭，行顯微CT掃描，冠狀位，管電壓60 kvp，功率40 W，電流0.67 mA。CT閾值切割取225～700 HU的全骨組織[15]，感興趣區(qū)選擇骨皮質(zhì)下與骺板之間，半徑為1.0～1.5 mm的圓形區(qū)域。觀察骨小梁的形態(tài)、分布，骨皮質(zhì)厚度，并測定骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density, BMD)、組織礦物質(zhì)密度(tissue mineral density, TMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/total volume, BV/TV)值。

1.2.5 H&E染色：骨組織標(biāo)本經(jīng)4.0%多聚甲醛固定48小時(shí)，酸性脫鈣液脫鈣36小時(shí)。冠狀位取材，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，作4.0 μm切片，H&E染色后正置顯微鏡下觀察股骨頭內(nèi)骨小梁、骨細(xì)胞形態(tài)及壞死情況，并計(jì)算骨細(xì)胞空陷窩百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 SANFH兔模型構(gòu)建

為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展，采用激素聯(lián)合脂多糖改良技術(shù)建立激素性股骨頭壞死兔模型，在建模第1、2周分別選取兔股骨頭，切片后H&E染色觀察發(fā)現(xiàn)：第2周股骨頭軟骨下骨小梁變細(xì)、稀疏，不連續(xù)；骨細(xì)胞沿骨小梁成串分布，細(xì)胞核不均一，形態(tài)變扁，數(shù)目減少，空骨細(xì)胞呈空泡狀，散在分布，脂肪細(xì)胞增多(圖1)。以上結(jié)果符合股骨頭壞死病理學(xué)改變，說明早期激素性股骨頭壞死兔模型構(gòu)建成功。

圖1 SANFH兔模型構(gòu)建成功[13]Fig.1 SANFH rabbit model has been successfully constructed[13](a) (b) (c) (d) H&E staining after 1 week of modeling; (e) (f) (g) (h) H&E staining after 2 weeks of modeling; (a) (b) (e) (f) Anterolateral area of femoral head (coronal); (c) (d) (g) (h) Posterolateral area of femoral head (coronal) (BT, bone trabecula; O, osteoblast; A, adipocyte)

2.2 GDNF可使骨密度增加

為了觀察GDNF對激素性股骨頭壞死兔骨質(zhì)密度的影響，在給藥后第5、10、15、20天分別對實(shí)驗(yàn)組、對照組進(jìn)行雙髖關(guān)節(jié)螺旋CT掃描，觀察發(fā)現(xiàn)：兩組股骨頭形態(tài)保持完整，關(guān)節(jié)面較光滑，骨皮質(zhì)厚度相當(dāng)；與對照組相比，第15、20 天實(shí)驗(yàn)組骨松質(zhì)呈磨玻璃樣影，骨質(zhì)密度增高，尤以第20天明顯；對照組股骨頭骨質(zhì)密度欠均勻，骨質(zhì)密度減低，以第10天骨質(zhì)密度最低(圖2)。以上結(jié)果表明，GDNF可保持股骨頭形態(tài)完整，增加骨松質(zhì)密度。

2.3 GDNF可促進(jìn)骨小梁的形成

為進(jìn)一步觀察GDNF對激素性股骨頭壞死兔骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，在給藥后第5、10、15、20 天分別取實(shí)驗(yàn)組、對照組行顯微CT掃描，觀察發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組與對照組第5、10天骨小梁分布稀疏，間距增寬，部分?jǐn)嗔?，骨密度較低；實(shí)驗(yàn)組第15、20天骨小梁逐漸豐富、密集，間距變窄，骨皮質(zhì)厚度增加，骨質(zhì)密度增高；與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)量更多，骨皮質(zhì)更厚，骨質(zhì)密度更高(圖3)。以上結(jié)果表明，GDNF可促進(jìn)股骨頭內(nèi)部骨小梁的修復(fù)，骨皮質(zhì)的形成。

圖2 GDNF可增加骨密度Fig.2 GDNF increased the bone density of the femoral headBone density of SANFH rabbits detected by CT images at 5, 10, 15 and 20 days post treatment. (arrows, femoral head)

圖3 GDNF可促進(jìn)骨小梁的形成Fig.3 GDNF promoted trabeculae formationThe trabeculae of SANFH rabbits detected by Micro-CT images at 5, 10, 15 and 20 days post treatment. (arrows, femoral head)

圖4 BMD、TMD和BV/TV值的變化Fig.4 The variation of BMD, TMD and BV/TVBony masses detected by Micro-CT scanning analysis. *P < 0.05 compared with the control group

2.4 GDNF可影響骨相關(guān)參數(shù)的改變

為進(jìn)一步驗(yàn)證GDNF對激素性股骨頭壞死的影響，分析顯微CT相關(guān)參數(shù)顯示：實(shí)驗(yàn)組、對照組的股骨頭BMD、TMD變化趨勢近乎一致，除第10天數(shù)值較低外，基本上呈上升趨勢；隨著觀察時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組BV/TV值逐步增高，而對照組BV/TV值總體趨勢變化不明顯；與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組在第15、20天BMD、TMD、BV/TV值均明顯高于對照組(P<0.05)(圖4)。以上結(jié)果表明，GDNF可增高股骨頭內(nèi)部骨質(zhì)密度，保持骨小梁完整性。

2.5 GDNF可抑制骨細(xì)胞的病理學(xué)檢測結(jié)果

病理學(xué)研究GDNF對激素性股骨頭壞死的影響。在給藥后第5、10、15、20 天分別取實(shí)驗(yàn)組、對照組行兔股骨頭切片、H&E染色，觀察發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)骨小梁分布較稀疏，骨細(xì)胞分布廣泛，隨觀察時(shí)間延長，骨細(xì)胞核著色增多，脂肪細(xì)胞分布減少；對照組骨小梁形態(tài)不完整，部分?jǐn)嗔?，分布稀疏，隨時(shí)間延長，骨細(xì)胞空陷窩和脂肪細(xì)胞逐漸增多，骨細(xì)胞和造血細(xì)胞逐漸減少；兩組比較，實(shí)驗(yàn)組第15、20天骨細(xì)胞空陷窩百分率顯著低于對照組(P<0.05)(圖5、表1)。以上結(jié)果表明，GDNF可通過抑制骨細(xì)胞壞死，保持骨小梁完整，對早期激素性股骨頭壞死有潛在的保護(hù)作用。

圖5 GDNF抑制骨細(xì)胞壞死(×100)Fig.5 GDNF inhibits bone cell necrosis (×100)Histologic results of femoral head detected by H&E staining (×100). (OT, osseous tissue; AT, adipose tissue)

組別5 d10 d15 d20 d實(shí)驗(yàn)組26.3±7.925.3±3.513.3±3.2*10.6±2.4*對照組29.7±7.426.0±2.871.0±7.578.6±5.3

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組第15，20天股骨頭骨細(xì)胞空陷窩率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)

Compared with the control group, the percentage of empty bone lacunae of femoral head in the experimental group was significantly lower at 15 and 20 days.(*P<0.05)

3 討論

糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的股骨頭壞死是非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死最重要的發(fā)病機(jī)制之一，長期或短期過量使用糖皮質(zhì)激素常作為獨(dú)立的高危因素[16,17]，它可導(dǎo)致股骨頭局部血運(yùn)障礙，引起骨細(xì)胞缺血、缺氧和壞死，進(jìn)一步發(fā)生骨小梁斷裂及股骨頭塌陷。在股骨頭壞死發(fā)展過程中，股骨頭變形塌陷，藥物治療效果很難令人滿意，髖關(guān)節(jié)成形手術(shù)治療成了必然選擇[18]。因此，在股骨頭壞死早期針對性的有效干預(yù)，誘導(dǎo)骨再生，保護(hù)骨細(xì)胞，有望成為防治股骨頭缺血壞死的有效治療手段[19]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過建立激素性股骨頭壞死動物模型，探索GDNF對兔早期激素性股骨頭壞死的影響。

GDNF屬于TGF-β超家族成員，可被神經(jīng)末梢攝取，逆向運(yùn)輸致胞體，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生長、損傷和修復(fù)中都具有重要的神經(jīng)營養(yǎng)作用[10,20]。研究報(bào)道，GDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可特異性作用于多巴胺能神經(jīng)元，在腦缺血、缺氧中對神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)。因此，GDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元損傷所致的帕金森病研究較多[9,21]。另有學(xué)者提出GDNF對周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有營養(yǎng)和保護(hù)作用, 可促使神經(jīng)元再生、減少細(xì)胞凋亡及促進(jìn)存活作用[9,12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GDNF對早期股骨頭壞死具有潛在保護(hù)作用。一方面，GDNF可保持股骨頭形態(tài)完整，增大股骨頭骨質(zhì)密度。在股骨頭CT檢測結(jié)果中，兩組股骨頭形態(tài)完整，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨密度較對照組增高。由于螺旋CT分辨率不及顯微CT高，在兔股骨頭內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)顯示效果欠佳，我們進(jìn)一步通過顯微CT檢測，觀察GDNF對激素性股骨頭壞死兔骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)量更多，骨皮質(zhì)更厚，骨質(zhì)密度更高，結(jié)果表明GDNF可促進(jìn)股骨頭內(nèi)部骨小梁的修復(fù)，骨皮質(zhì)的形成，表現(xiàn)為骨礦物質(zhì)密度的增加。

同時(shí)有研究證實(shí)，激素性股骨頭壞死可對骨代謝諸多環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響，如成骨細(xì)胞分化、骨細(xì)胞凋亡，以及脂質(zhì)代謝、鈣代謝、微循環(huán)紊亂。對照組骨小梁分布稀疏，間距增寬，部分?jǐn)嗔?，可能原因是破骨?xì)胞作用增強(qiáng)，骨小梁發(fā)生微細(xì)骨折，表現(xiàn)在骨小梁數(shù)目和厚度的減少[22,23]。GDNF可能通過營養(yǎng)骨內(nèi)神經(jīng)，抑制破骨細(xì)胞作用，增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能，對股骨頭內(nèi)骨小梁進(jìn)行修復(fù)、重建，促進(jìn)了骨質(zhì)形成。

另一方面，GDNF可抑制骨細(xì)胞壞死，保持骨小梁完整。病理學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，對照組股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞空陷窩數(shù)均高于實(shí)驗(yàn)組，骨小梁形態(tài)不規(guī)則，斷裂，脂肪細(xì)胞變大、增多，造血細(xì)胞減少，壞死發(fā)生明顯嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)骨小梁形態(tài)完整，骨細(xì)胞分布廣泛，脂肪細(xì)胞較少。該結(jié)果表明注射GDNF對兔股骨頭缺血壞死早期促進(jìn)了骨質(zhì)修復(fù)，保持了骨小梁的完整性，阻斷了骨細(xì)胞壞死的進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GDNF可能通過營養(yǎng)股骨頭內(nèi)損傷的神經(jīng)，進(jìn)而增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)骨內(nèi)微循環(huán)平衡，從而促進(jìn)骨質(zhì)修復(fù)，調(diào)節(jié)骨的形成，保持骨小梁完整，是否對早期股骨頭壞死具有潛在的保護(hù)作用還需要進(jìn)一步研究。

雖然本研究取得了一定成果，但仍存在諸多缺陷。接下來，本研究將繼續(xù)加大樣本量，通過CT、核磁共振、骨活檢等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及Western blot、免疫組化、鈣鹽沉積等體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討GDNF干預(yù)激素性股骨頭壞死早期病程的研究。