抗纖維化短肽Ac-SDKP對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的調(diào)控作用與機(jī)制

靳馥宇， 張 惠， 李 倩， 徐 洪， 楊 方， 張麗娟

抗纖維化短肽Ac-SDKP對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的調(diào)控作用與機(jī)制

靳馥宇， 張 惠， 李 倩， 徐 洪， 楊 方， 張麗娟

目的 探討抗纖維化短肽N-乙酰基-絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)對(duì)血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的調(diào)控作用與機(jī)制。 方法 采用AngⅡ誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，并予以纈沙坦、Ac-SDKP和PD98059預(yù)處理。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)E-鈣黏蛋白(E-cad)的表達(dá)，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(P-ERK)1/2的共定位表達(dá)。Western-blot法檢測(cè)E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、血管緊張素受體1(AT1)、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達(dá)。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ刺激組細(xì)胞E-cad表達(dá)下降，α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1和P-ERK1/2的表達(dá)增高；而纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059預(yù)處理后，均降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1的表達(dá)升高及E-cad表達(dá)下降(P<0.05)。 結(jié)論 AngⅡ-AT1-ERK1/2通路介導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，而Ac-SDKP可通過(guò)AngⅡ-AT1-ERK1/2通路介導(dǎo)抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。

脯氨酸； 氨； 肺泡/細(xì)胞學(xué)； 成纖維細(xì)胞； 腎素-血管緊張素系統(tǒng)； 血管緊張素Ⅱ； 矽肺； 纖維化

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期受到致纖維化因素的刺激時(shí)，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞將會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)變并分化為肌成纖維細(xì)胞，其收縮、遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于成纖維細(xì)胞，被認(rèn)為是器官纖維化形成過(guò)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞[1-3]。而腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin systems, RAS)穩(wěn)態(tài)失衡可能與矽肺的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在矽肺患者血清中表達(dá)上調(diào)，但其機(jī)制有待進(jìn)一步探討[4-5]。N-乙?；?絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartly-lysyl-proline，Ac-SDKP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有抗器官纖維化作用的短肽，在體內(nèi)可被ACE的N端所清除，其含量下降與纖維化形成有關(guān)[6]。因此，本研究擬以人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549為研究對(duì)象，觀察Ac-SDKP能否通過(guò)對(duì)ACE-血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)-血管緊張素受體1(AT1)軸的調(diào)控，抑制人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及膠原蛋白的合成，探討Ac-SDKP抗矽肺纖維化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；Ham’s-F12培養(yǎng)基，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；AngⅡ,PD98059(美國(guó)Sigma公司)；纈沙坦(日本東京化成株式會(huì)社)；兔抗Ⅰ型膠原(武漢博士德公司)；兔抗E-鈣黏蛋白(E-cad，美國(guó)Abcam公司)；兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，鼠抗ERK1/2及鼠抗磷酸化-ERK1/2(美國(guó)BD公司)；兔抗GAPDH(美國(guó)Santa Cruz公司)；二步法通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV6000)；ECL顯色試劑盒(美國(guó)GE公司)；Rhodamine-山羊抗兔IgG/FITC-山羊抗小鼠IgG(03-1506/02-1806，美國(guó)KPL公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549用含10%胎牛血清的Ham’s-F12培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)次融合狀態(tài)時(shí)，以無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h后進(jìn)行誘導(dǎo)分組：(1)對(duì)照組：無(wú)血清Ham’s-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；(2)AngⅡ刺激組：無(wú)血清培養(yǎng)條件下，給予AngⅡ(10-7mol/L)誘導(dǎo)刺激48 h；(3)AngⅡ+AT1抑制劑(纈沙坦)處理組：無(wú)血清培養(yǎng)條件下，先給予纈沙坦(10-6mol/L)作用1 h后，再給予AngⅡ(10-7mol/L)共同孵育48 h；(4)AngⅡ+Ac-SDKP處理組：無(wú)血清培養(yǎng)條件下，先給予Ac-SDKP(10-8mol/L)作用1 h后，再給予AngⅡ(10-7mol/L)共同孵育48 h；(5)AngⅡ+ERK1/2通路Ⅰ抑制劑(PD98059)處理組：無(wú)血清培養(yǎng)條件下，先給予PD98059(10-5mol/L)作用1 h后，再給予AngⅡ(10-7mol/L)共同孵育48 h。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)E-cad的表達(dá) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞爬片培養(yǎng)至次融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行同步化處理，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)試劑(n=3)，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定。染色步驟按免疫細(xì)胞化學(xué)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色，其中E-cad抗體稀釋度為1∶100。采用顯微數(shù)碼相機(jī)(DP80，奧林巴斯有限公司)進(jìn)行圖像采集。

1.2.3 免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)α-SMA和P-ERK1/2的共表達(dá) 各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥刺激后，以4%多聚甲醛固定。染色前細(xì)胞水化10 min，高壓修復(fù)20 s，PBS洗3次后，正常山羊血清封閉20 min，滴加α-SMA(1∶200)和P-ERK1/2(1∶300)混合一抗，4 ℃過(guò)夜，洗去一抗后，滴加熒光二抗(1∶200)，37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染，采用顯微數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖像采集。

1.2.4 Western-blot法檢測(cè)E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達(dá) 按照文獻(xiàn)[6]方法提取并測(cè)定蛋白濃度，每孔90 μg上樣，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。一抗(E-cad抗體1∶300稀釋；α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、GAPDH抗體1∶500稀釋；P-ERK1/2及ERK1/2 按1∶800稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；二抗(1∶5 000稀釋)37 ℃孵育30 min；ECL顯色。圖像掃描后，以Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行吸光度(OD)值的定量分析，目的蛋白條帶OD值經(jīng)內(nèi)參平衡后進(jìn)行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞E-cad的表達(dá) AngⅡ刺激后，部分細(xì)胞體積增大，由原來(lái)的鋪路石狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或者紡錘形，細(xì)胞E-cad表達(dá)較對(duì)照組顯著減弱或缺失。予以纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059預(yù)處理后，均明顯減弱了AngⅡ?qū)-cad表達(dá)的抑制作用(圖1)。

A：對(duì)照組細(xì)胞呈鋪路石狀，E-cad陽(yáng)性表達(dá)；B：AngⅡ刺激組細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或者紡錘形，E-cad陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)；C(AngⅡ+纈沙坦處理組)、D(AngⅡ+Ac-SDKP處理組)和E(AngⅡ+PD98059處理組)：細(xì)胞形態(tài)較對(duì)照組變化不明顯，偶見(jiàn)長(zhǎng)梭形或者紡錘形細(xì)胞，細(xì)胞E-cad表達(dá)呈弱陽(yáng)性. A2～E2為A1～E1的局部放大.圖1 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞E-cad的表達(dá)Fig 1 The expression of E-cad in human type Ⅱ alveolar epithelial cells

2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞α-SMA及P-ERK1/2的共定位表達(dá) AngⅡ刺激后，大部分細(xì)胞P-ERK1/2表達(dá)呈陽(yáng)性，同時(shí)細(xì)胞胞體內(nèi)出現(xiàn)了平行或交叉排列的肌絲樣微結(jié)構(gòu)，即α-SMA表達(dá)顯著增強(qiáng)。予以纈沙坦、Ac-SDKP或PD98059的預(yù)處理明顯抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞P-ERK1/2和α-SMA表達(dá)(圖2)。

2.3 Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達(dá) AngⅡ刺激48 h后，上皮標(biāo)志物E-cad蛋白表達(dá)下調(diào)，是對(duì)照組的39.4%；而AngⅡ刺激下α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1和P-ERK1/2的表達(dá)顯著增高，分別是對(duì)照組的19.04，8.67，1.76及5.39倍，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059均能夠顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1的表達(dá)升高，降低AngⅡ誘導(dǎo)的E-cad表達(dá)下降。其中，纈沙坦、Ac-SDKP、PD98059預(yù)處理組的α-SMA蛋白表達(dá)分別為AngⅡ誘導(dǎo)組的16.2%，15.1%及51.1%；Ⅰ型膠原分別為AngⅡ誘導(dǎo)組的52.0%，27.6%及62.2%；AT1蛋白表達(dá)分別為AngⅡ誘導(dǎo)組的65.2%，33.6%及33.4%；P-ERK1/2蛋白表達(dá)分別為AngⅡ誘導(dǎo)組的41.3%，58.2%及19.7%；E-cad蛋白表達(dá)分別為AngⅡ誘導(dǎo)組的2.37，1.63及1.96倍，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖3)。

A：對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)α-SMA、P-ERK1/2表達(dá)陰性；B：AngⅡ刺激組大部分細(xì)胞胞體內(nèi)出現(xiàn)了平行或交叉排列的肌絲樣微結(jié)構(gòu)，P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)；C(AngⅡ+纈沙坦處理組)、D(AngⅡ+Ac-SDKP處理組)和E(AngⅡ+PD98059處理組)：3組少數(shù)細(xì)胞α-SMA、P-ERK1/2共陽(yáng)性表達(dá).圖2 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞α-SMA及P-ERK1/2的共定位表達(dá)Fig 2 The co-expression of α-SMA and P-ERK1/2 in human type Ⅱ alveolar epithelial cells

3 討 論

矽肺是常見(jiàn)的、危害嚴(yán)重的職業(yè)性塵肺病。盡管國(guó)內(nèi)外在矽肺的防治方面做了大量工作，但是由于矽肺發(fā)病的具體機(jī)制尚不十分明確，所以目前控制或減少矽肺病發(fā)生的工作重點(diǎn)仍放在如何采取有效的防護(hù)措施上，而針對(duì)矽肺患者仍缺乏有效的治療手段和藥物來(lái)阻抑矽肺纖維化帶來(lái)的肺部病變和損傷。因此，探討矽肺的發(fā)病機(jī)制和尋求有效的抑制矽肺纖維化治療措施一直是職業(yè)病防治研究領(lǐng)域中的重要課題。

表1 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞E-cad、α-SMA、Ⅰ型膠原、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達(dá)

AngⅡ：血管緊張素Ⅱ； E-cad：E-鈣黏蛋白； α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白； AT1：血管緊張素受體1； P-ERK：磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與AngⅡ刺激組比較，Δ：P<0.05.

AngⅡ：血管緊張素Ⅱ； E-cad：E-鈣黏蛋白； α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白； AT1：血管緊張素受體1； P-ERK：磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶. 1：對(duì)照組；2：AngⅡ刺激組；3：AngⅡ+纈沙坦處理組；4：AngⅡ+Ac-SDKP處理組；5：AngⅡ+PD98059處理組.圖3 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞E-cad、Ⅰ型膠原、α-SMA、AT1、P-ERK1/2及ERK1/2的定量表達(dá)Fig 3 The expressions of E-cad, collagen typeⅠ, α-SMA, AT1, P-ERK1/2 and P-ERK1/2 in human type Ⅱ alveolar epithelial cells

Ac-SDKP是1989年首次從胎牛骨髓中提取的四肽，它廣泛存在于人體的血液和組織中，近年來(lái)的研究證實(shí)，Ac-SDKP具有抗器官纖維化作用，能夠通過(guò)抑制靶器官膠原的沉積，減輕致病因素導(dǎo)致的器官纖維化的程度，具有潛在的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值[7-10]。本課題組首次報(bào)道了Ac-SDKP具有抗矽肺纖維化的作用，證實(shí)矽肺纖維化發(fā)生過(guò)程中，存在上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，Ac-SDKP能夠通過(guò)抑制上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化而發(fā)揮其抗矽肺纖維化的作用，然而其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討[11-13]。

已有研究表明，RAS在多種器官(如肝、腎、肺等)的纖維化形成過(guò)程中具有重要作用[14-16]。Ac-SDKP是RAS重要的生理性調(diào)節(jié)肽，在體內(nèi)可被ACE的N端清除，而肺又是RAS的靶器官之一?；谝陨涎芯?，推測(cè)RAS系統(tǒng)在Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用中可能發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激后，A549細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的鋪路石狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或者紡錘形，上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cad表達(dá)下調(diào)，同時(shí)出現(xiàn)Ⅰ型膠原以及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA的表達(dá)，提示在AngⅡ刺激下，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生了向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。此外，在AngⅡ誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的同時(shí)，A549細(xì)胞AT1以及P-ERK1/2的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，而采用AT1抑制劑(纈沙坦)和ERK1/2信號(hào)阻斷劑(PD980589)預(yù)處理后再給予AngⅡ刺激，則AngⅡ的上述作用減弱，提示AngⅡ能夠通過(guò)其受體AT1蛋白活化ERK1/2通路，從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。另一方面，采用Ac-SDKP對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后再給予AngⅡ刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP具有類似纈沙坦和ERK1/2信號(hào)阻斷劑的作用，即Ac-SDKP抑制AngⅡ誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的同時(shí)，抑制了AT1蛋白的表達(dá)以及ERK1/2通路的活化。本研究結(jié)果提示，Ac-SDKP可通過(guò)對(duì)AngⅡ-AT1-ERK1/2通路的調(diào)控而抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，進(jìn)而抑制膠原的合成而發(fā)揮抗矽肺纖維化作用。這為將Ac-SDKP開(kāi)發(fā)為一種有效的抗矽肺纖維化藥物提供了進(jìn)一步的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(編輯：何佳鳳)

Effect and Mechanism of the Anti-fibrotic Tetrapeptide Ac-SDKP on the Differentiation of Human Type Ⅱ Alveolar Epithelial Cell into Myofibroblasts Induced by AngⅡ

JIN Fuyu, ZHANG Hui, LI Qian, XU Hong, YANG Fang, ZHANG Lijuan

Medical Experiment Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China

Objective To investigate the regulation effect and mechanism of the anti-fibrotic tetrapeptide (N-acetyl-seryl-aspartly-lysyl-proline, Ac-SDKP) on the differentiation of human type Ⅱ alveolar epithelial cell into myofibroblasts induced by angiotensin(Ang Ⅱ). Methods Expressions of E-cad and α-SMA cells were detected by immunohistochemistry. Coexpression of SMA and P-ERK1/2 was detected by confocal laser scanning microscopy. Expressions of E-cad, α-SMA, collagen type Ⅰ, AT1, P-ERK1/2 and ERK1/2 were quantitatively analyzed by Western-blot method. Results Compared with the control group, the expression of E-cad in Ang Ⅱ induced cells decreased. At the same time, expressions of α-SMA, type Ⅰ collagen, AT1 and P-ERK1/2 were increased compared with that in control group. However, Ac-SDKP, Valsartan and PD98059 reduced expressions of α-SMA, type Ⅰ collagen, AT1 and P-ERK1/2 which were induced by Ang Ⅱ, while increased the expression of E-cad expression. Conclusion Ang Ⅱ -AT1-ERK1/2 pathway mediates the differentiation of alveolar type Ⅱ epithelial cells into myofibroblasts, and Ac-SDKP can inhibit the differentiation of alveolar type Ⅱ epithelial cells into myofibroblasts by Ang Ⅱ -AT1-ERK1/2 pathway.

proline; ammonia; pulmonary alveoli/cytology; fibroblasts; renin-angiotensin system; angiotensin Ⅱ; silicosis; fibrosis

2016-11-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(81472953)；河北省自然科學(xué)基金(H201609170)；河北省教育廳課題(ZC2016002)；華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201414850126)

華北理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，唐山 063000

靳馥宇，男，華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專業(yè)2014級(jí)本科在讀

張麗娟. Email: 664382330@qq.com

R135.2； R329.24； R341.6； R341.7； R916.3

A

1672-4194(2017)02-0092-05