星形膠質(zhì)細(xì)胞與GnRH神經(jīng)元共培養(yǎng)可通過(guò)谷氨酸受體介導(dǎo)促進(jìn)GnRH神經(jīng)元分泌

陳 勇

星形膠質(zhì)細(xì)胞與GnRH神經(jīng)元共培養(yǎng)可通過(guò)谷氨酸受體介導(dǎo)促進(jìn)GnRH神經(jīng)元分泌

陳 勇

目的 探討下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)GnRH神經(jīng)元的影響及其可能的相關(guān)機(jī)制。 方法 利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，將GnRH神經(jīng)元細(xì)胞株GT1-7與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)10 d。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GnRH神經(jīng)元中谷氨酸受體(GluR)的分布，蛋白免疫印跡法檢測(cè)GluR在GnRH神經(jīng)元中的表達(dá)，并分別通過(guò)高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的谷氨酸(Glu)和GnRH的濃度變化。 結(jié)果 共培養(yǎng)組的GnRH神經(jīng)元發(fā)生mGluR5和GluR1/2/3/4從胞質(zhì)到胞核的移位，在胞核中的表達(dá)較單純GT1-7培養(yǎng)組顯著增加(P<0.05)，且Western-blot檢測(cè)與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果一致。HPLC和ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組上清中的Glu濃度顯著減少，而GnRH的分泌則明顯增加(P<0.05)。 結(jié)論 GnRH神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)可通過(guò)改變GluR(代謝型或離子型)在細(xì)胞內(nèi)的定位與表達(dá)，從而增加GnRH的分泌。

神經(jīng)元； 促性腺激素釋放激素； 神經(jīng)膠質(zhì)； 星形細(xì)胞； 共同培養(yǎng)技術(shù)； 受體，谷氨酸

下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神經(jīng)元是生殖內(nèi)分泌調(diào)控的中樞，在性別分化、性腺發(fā)育以及生殖過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，是性生理和性行為的重要介導(dǎo)者。GnRH神經(jīng)元的分泌受各種內(nèi)外因素的影響，但其分泌調(diào)控機(jī)制迄今尚未完全明確。星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為僅限于為神經(jīng)元提供支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)。近年來(lái)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用越來(lái)越受到人們重視，相關(guān)研究也取得了很大進(jìn)展。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的活性和分泌來(lái)影響生殖生育已成為研究熱點(diǎn)，但其機(jī)制并未完全闡明。本研究利用GnRH神經(jīng)元細(xì)胞株即GT1-7與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，旨在探討星形膠質(zhì)細(xì)胞如何影響GnRH神經(jīng)元的分泌活動(dòng)，并對(duì)可能機(jī)制做初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞及動(dòng)物：GT1-7細(xì)胞株(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌研究所李小英教授贈(zèng)送)；C57BL/6J小鼠清潔級(jí)[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]。試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司)；RIPA和PMSF(上海申能博采生物科技有限公司)；BCA Protein Assay Kit(美國(guó)Pierce公司)；ECL試劑盒和PVDF膜(英國(guó)Amersham Biosciences公司)；mGluR5(N-14)抗體、GluR1/2/3/4(H-180)抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；Lamin B1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG抗體(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)；GnRH檢測(cè)試劑盒(Cat no:S-1217，美國(guó)半島實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 方法

1.2.1 GT1-7的傳代培養(yǎng) GT1-7細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，加入培養(yǎng)液(含4.5 g/L葡萄糖的DMEM+10%胎牛血清+100 IU/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，長(zhǎng)滿(mǎn)80%時(shí)按1∶3傳代培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[1]:新生1～3 d的C57BL/6J小鼠，75%酒精噴灑消毒，置無(wú)菌培養(yǎng)皿，斷頭，取全腦，解剖顯微鏡下去除小腦、腦干和嗅球，分離大腦皮層，去除腦膜及血管膜。將大腦皮層移入一干凈離心管，加入含有20 U/mL木瓜蛋白酶的鹽溶液(pH=7.2)4 mL，37 ℃水浴消化20 min，每5 min晃動(dòng)1次[鹽溶液配方：NaCl 137，KCl 5.3，MgCl21，葡萄糖25，HEPES 10，CaCl23(單位：mmol/L)，以及0.5 mmol/L EDTA和0.2 mg/mL L-半胱氨酸]。吸棄鹽溶液，用含10% FBS的培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10% FBS+10 U/mL青霉素+10 U/mL鏈霉素)洗2遍終止消化反應(yīng)。加入2～3 mL培養(yǎng)基吹打(約4～5次)，使組織分散。靜置，待較大組織塊沉淀后，吸取上清，收集于干凈離心管。重復(fù)前兩步，直至組織塊消失。將收集到的細(xì)胞計(jì)數(shù)，若細(xì)胞數(shù)量較多，則稀釋后計(jì)數(shù)，采用臺(tái)盼藍(lán)染色(1∶1)。根據(jù)實(shí)際情況將細(xì)胞稀釋到合適濃度(1×105～5×105mL-1)接種。72 h后換液，之后3～4 d換液1次，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)染色鑒定細(xì)胞陽(yáng)性率超過(guò)90%。

1.2.3 GT1-7與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) 利用Transwell系統(tǒng)(美國(guó)Corning公司)，先將GT1-7常規(guī)消化，每孔1 mL細(xì)胞懸液接種至6孔板中，后每孔加上Transwell板，在Transwell板上接種1.5 mL原代星形膠細(xì)胞懸液，上下孔間的細(xì)胞并不直接接觸但可通過(guò)半透膜進(jìn)行物質(zhì)交流，每2 d半量換液1次，共培養(yǎng)10 d，取細(xì)胞上清液測(cè)GnRH和谷氨酸(glutamate，Glu)水平，對(duì)GT1-7細(xì)胞則抽取核蛋白(進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)的GT1-7細(xì)胞需接種至高壓滅菌過(guò)的蓋片上)，同時(shí)設(shè)單純GT1-7培養(yǎng)組為對(duì)照組。

1.2.4 培養(yǎng)液上清中GnRH濃度的檢測(cè) 共培養(yǎng)10 d時(shí)，先將培養(yǎng)液更換為含0.2% BSA的無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液孵育16 h，而后將培養(yǎng)液更換為L(zhǎng)ocke’s Mediums[NaCl 154，KCl 5.6，CaCl22.2，MgCl21，NaHCO36，葡萄糖10，HEPES 2(單位：mmol/L)，bacitracin 20 μmol/L]孵育1 h，收集上清，-80 ℃凍存，ELISA方法測(cè)定GnRH水平，按GnRH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。具體如下：先配制EIA緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品，而后在96孔板中每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入25 μL抗血清，空白孔加75 μL EIA緩沖液，常溫孵育1 h，每孔加入BT-示蹤劑25 μL，常溫孵育2 h，每孔用300 μL EIA緩沖液洗滌5遍，每孔加入100 μL抗生物素化蛋白鏈菌素的HRP，常溫孵育1 h，用EIA緩沖液洗滌5遍，每孔加100 μL底物TMB，常溫放置40 min，可見(jiàn)形成藍(lán)色產(chǎn)物，每孔加入100 μL 2 mol/L的HCl終止反應(yīng)，立即用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)OD450 nm。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品的GnRH濃度。

1.2.5 培養(yǎng)液上清中胞外Glu濃度的檢測(cè) 方法同1.2.4，培養(yǎng)液更換為含0.2% BSA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液后8 h，收集培養(yǎng)液中的上清各10 μL進(jìn)行Glu的檢測(cè)，胞外Glu含量使用高效液相色譜儀(1525，美國(guó)Waters公司)進(jìn)行檢測(cè)。過(guò)程如下：收取10 μL待測(cè)樣品，加入50 μL OPA標(biāo)記氨基酸，使用一定量0.05 mol/L的NaOH穩(wěn)定氨基酸的OPA衍生物，并將樣品稀釋20倍，然后放置于4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器(2707，美國(guó)Waters公司)。使用Breeze軟件設(shè)置進(jìn)樣體積為10 μL。使用C18色譜柱將樣品中的Glu分離，流動(dòng)相A由25 mmol/L醋酸鈉、0.4% 1,4-二惡烷及4.3% 2-異丙醇組成，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.9；流動(dòng)相B由97%甲醇、1.5% 1,4-二惡烷及1.5% 2-異丙醇組成。激發(fā)光波長(zhǎng)338 nm，發(fā)射光由450 nm熒光檢測(cè)器(2475，美國(guó)Waters公司)。同時(shí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品(5 μmol/L Glu)，換算出樣品的Glu濃度[1]。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)GT1-7細(xì)胞中谷氨酸受體(glutamate receptor，GluR)的定位與表達(dá) 各孔吸棄培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS洗3遍，4%多聚甲醛(每孔0.5 mL)固定10 min，PBS洗3次，每次10 min。封閉液(0.1% PBST+5%驢血清)室溫封閉1 h，各孔加入一抗(mGluR5 1∶50稀釋?zhuān)珿luR1/2/3/4 1∶50稀釋?zhuān)梅忾]液配制)200 μL，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌6次，每次10 min，各孔加入相應(yīng)的二抗(驢抗羊488、驢抗兔488，PBS稀釋1∶1 500)200 μL，室溫孵育1 h，PBST洗滌6次，每次10 min；DAPI復(fù)染5 min(PBS稀釋1∶4 000)，吸棄DAPI，用5 mL注射器針頭挑起蓋片，用眼科鑷夾取邊緣并倒放至多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片上，用指甲油封邊，于暗盒中避光保存，共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)GT1-7細(xì)胞核中GluR的表達(dá)變化

1.2.7.1 提取核蛋白 采用核蛋白提取試劑盒(貨號(hào)P0028，江蘇碧云天生物技術(shù)公司)，具體如下：GT1-7細(xì)胞用PBS洗1遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。每20 μL細(xì)胞沉淀加入200 μL添加了PMSF的細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑A，最高速劇烈Vortex 5 s，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)，冰浴10～15 min；加入細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑B 10 μL，最高速劇烈Vortex 5 s，冰浴1 s；最高速劇烈Vortex 5 s，4 ℃ 15 000 g離心5 min。立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞質(zhì)蛋白。對(duì)于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50 μL添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑，最高速劇烈Vortex 30 s，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)，冰浴，每隔2 min再高速劇烈Vortex 30 s，共30 min。4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料EP管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白，-80 ℃凍存。

1.2.7.2 GT1-7細(xì)胞核中GluR的表達(dá) 采用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，BCA方法測(cè)定GT1-7細(xì)胞的核蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的核蛋白濃度以及上樣蛋白量20 μg計(jì)算上樣的體積。采用8%分離膠，電泳分離目的蛋白(mGluR5和GluR1/2/3/4)及核蛋白內(nèi)參(Lamin B1)，而后采用Bio-rad轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜首先用封閉液(含有0.05% Tween 20和5%脫脂奶粉的TBS緩沖液)于室溫孵育1.5 h，而后用不同一抗(GluR1/2/3/4 1∶250，mGluR5 1∶200，Lamin B1 1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌3次后，膜用交聯(lián)有HRP的相應(yīng)二抗(山羊抗兔二抗 1∶2 000，驢抗山羊二抗1∶1 000)室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，條帶用ECL發(fā)光法進(jìn)行顯色，在暗盒中曝光至膠片(日本柯達(dá)公司)上，掃描后通過(guò)Quantity one軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色鑒定結(jié)果 經(jīng)GFAP免疫熒光染色，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色(箭頭所示)，陽(yáng)性率約為92%(圖1)。

A：GFAP； B：DAPI； C：Merge.圖1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP染色鑒定結(jié)果Fig 1 The GFAP staining of primary astrocyte tested by immunofluorescence

2.2 上清中GnRH及Glu的測(cè)定結(jié)果 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，GT1-7與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組GnRH的分泌顯著增加(P<0.05，圖2A)。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組上清中的GluR水平分泌顯著減少(P<0.05，圖2B)。

A：GnRH水平；B：Glu水平. Glu：谷氨酸. 與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，☆：P<0.05.圖2 上清中的GnRH及Glu水平Fig 2 The secretion level of GnRH and the glutamate concention in supernatant

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 GT1-7與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組GT1-7細(xì)胞中的mGluR5和GluR1/2/3/4(即綠色熒光位置，箭頭所示)出現(xiàn)從胞質(zhì)到胞核的移位(圖3)。

2.4 Western-blot檢測(cè)結(jié)果 與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，GT1-7與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組GT1-7細(xì)胞即GnRH神經(jīng)元胞核中mGluR5和GluR1/2/3/4的表達(dá)均顯著增加(圖4～5)。

3 討 論

人類(lèi)生殖活動(dòng)受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，GnRH是由下丘腦弓狀核的GnRH神經(jīng)元合成、分泌，并貯存于正中隆起[2]，以脈沖式分泌的方式進(jìn)入垂體門(mén)脈系統(tǒng)或經(jīng)腦脊液進(jìn)入血液。GnRH能促進(jìn)垂體前葉促性腺激素細(xì)胞分泌卵泡刺激素和黃體生成素，再通過(guò)血液循環(huán)調(diào)節(jié)外周靶性腺性激素的產(chǎn)生和配子發(fā)生，從而調(diào)節(jié)生殖活動(dòng)[3]。GnRH神經(jīng)元的分泌受各種內(nèi)外因素的影響，如Glu能促進(jìn)GnRH的分泌，γ-氨基丁酸對(duì)GnRH分泌有抑制作用，GPR54對(duì)GnRH神經(jīng)元有直接的刺激作用[4-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的活性和分泌過(guò)程中的作用也至關(guān)重要[8]。如星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和前列腺素E2，作用于GnRH神經(jīng)元并影響其功能，也可借助黏附分子與GnRH神經(jīng)元結(jié)合，通過(guò)旁分泌影響GnRH神經(jīng)元功能，此外，也可通過(guò)結(jié)構(gòu)重塑影響GnRH神經(jīng)元的活性和分泌[9-13]。

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)mGluR5及GluR1/2/3/4在GT1-7細(xì)胞中的定位和表達(dá)Fig 3 The location and expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in GT1-7 tested by immunofluorescence

A：mGluR5的表達(dá)；B：GluR1/2/3/4的表達(dá).圖4 Western-blot分析GT1-7細(xì)胞胞核中的mGluR5和GluR1/2/3/4的表達(dá)Fig 4 The expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in the nucleus of GT1-7 detected by Western-blot

本研究結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞與GnRH神經(jīng)元共培養(yǎng)時(shí)，上清中的Glu顯著減少，GnRH分泌增多，且GnRH神經(jīng)元胞內(nèi)的mGluR5和GluR1/2/3/4被激活，出現(xiàn)從胞質(zhì)向胞核的移位。Western-blot也證實(shí)，二者共培養(yǎng)時(shí)，上述GluR在GnRH神經(jīng)元胞核內(nèi)的表達(dá)增加。GluR分為2類(lèi)：一類(lèi)為離子型受體，包括N-甲基-D-天冬氨酸受體、海人藻酸受體和α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(該受體家族包括4個(gè)結(jié)構(gòu)極為相似的亞基GluR1/2/3/4，它們與離子通道偶聯(lián)，形成受體通道復(fù)合物，介導(dǎo)快信號(hào)傳遞)；另一類(lèi)屬于代謝型受體(mGluR)，通過(guò)G-蛋白偶聯(lián)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使，從而導(dǎo)致代謝改變，包括8個(gè)亞型(mGluR1～8)。這些受體被激活后產(chǎn)生較緩慢的生理反應(yīng)。本研究顯示，二者共培養(yǎng)10 d時(shí)，GnRH神經(jīng)元內(nèi)2類(lèi)GluR均發(fā)生定位與表達(dá)的變化，說(shuō)明GluR介導(dǎo)的急慢性效應(yīng)均參與星形膠質(zhì)細(xì)胞促GnRH分泌的作用。原因可能有2個(gè)：(1)星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過(guò)活化GnRH神經(jīng)元胞內(nèi)mGluR5和GluR1/2/3/4，促進(jìn)Glu的利用，而適宜濃度的Glu可促進(jìn)GnRH的分泌，即直接增強(qiáng)Glu的促分泌效應(yīng)；(2)Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性氨基酸，但過(guò)高濃度的Glu卻有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)元的損傷或死亡[14]。二者共培養(yǎng)時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)攝取一定量的Glu[15-16]，本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為共培養(yǎng)時(shí)上清中的Glu水平明顯下降，解除了過(guò)高濃度的Glu對(duì)神經(jīng)元造成的毒性作用，即恢復(fù)了GnRH神經(jīng)元對(duì)Glu作用的敏感性，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)GnRH分泌的效應(yīng)。但是該效應(yīng)是由何因素(如星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的何種細(xì)胞因子)促發(fā)，且在GnRH神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)該效應(yīng)通過(guò)下游何信號(hào)通路發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步深入研究。

A：mGluR5的表達(dá)；B：GluR1/2/3/4的表達(dá). 與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，☆：P<0.05.圖5 GT1-7細(xì)胞胞核中的mGluR5和GluR1/2/3/4的表達(dá)變化Fig 5 The histogram of expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in the nucleus of GT1-7

總之，GnRH神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，能改變GnRH神經(jīng)元2類(lèi)GluR在胞內(nèi)的定位與表達(dá)，且增加GnRH的分泌。該機(jī)制可能是通過(guò)GnRH神經(jīng)元GluR的移位等變化，增強(qiáng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu對(duì)GnRH神經(jīng)元的促分泌作用，或星形膠質(zhì)細(xì)胞消耗多余Glu后，GnRH神經(jīng)元的生理功能得到恢復(fù)。該研究結(jié)果可對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控GnRH神經(jīng)元分泌的理論提供補(bǔ)充，并為GnRH神經(jīng)元分泌調(diào)節(jié)提供一種新的調(diào)控靶點(diǎn)和方式，進(jìn)而為生育調(diào)節(jié)提供一個(gè)新的途徑和思路。

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(編輯：何佳鳳)

The Secretion of GnRH Neuron can be Enhanced by the Coculture with AstrocyteinvitroVia the Change in GluR

CHEN Yong

Department of Anatomy and Histology & Embryology, School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China

Objective To explore the effect of coculture GnRH neuron (GT1-7) with astrocyte on the function of GnRH neuron and the mechanism associated with it. Methods GnRH neurons were cocultured with primary astrocyte for 10 days in the Transwell system. The distribution of GluR in GnRH neuron were detected by immunofluorescence. The expression of GluR in GnRH neuron were tested by Western-blot. The concentration of Glu and GnRH were measured through HPLC and ELISA respectively. Results It was observed that transfer of mGluR5 and GluR1/2/3/4 into nucleus form cytoplasm took place in the coculture group. The expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in the nucleus were increased. The results of Western-blot coincided with the results of IF. The concentration of Glu in supernatant decreased but the secretion of GnRH increased in the coculture group. Conclusion The coculture of GnRH neuron with astrocyte can benefit the secretion of GnRH via the change of GluR. The distribution and expression of GluR in the GnRH neuron can be changed if GnRH neuron were cocultured with astrocyte.

neurons; gonadotropin-releasing hormone; neuroglia; astrocytes; coculture techniques; receptors, glutamate

2017-01-11

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014J01123)

福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福州 350122

陳 勇，男，副教授，理學(xué)博士. Email: fjmucy@163.com

R322.8； R347.512； R977.1

A

1672-4194(2017)02-0097-06