3種三唑類殺菌劑對映體對鐮刀菌的選擇性活性

李 納，張麗陽，刁 雪，閉賢鳳，劉承蘭

(天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室/廣東省生物農藥創(chuàng)制與應用重點實驗室/華南農業(yè)大學 農學院，廣東 廣州 510642)

3種三唑類殺菌劑對映體對鐮刀菌的選擇性活性

李 納，張麗陽，刁 雪，閉賢鳳，劉承蘭

(天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室/廣東省生物農藥創(chuàng)制與應用重點實驗室/華南農業(yè)大學 農學院，廣東 廣州 510642)

【目的】研究3種三唑類殺菌劑對映體對3種鐮刀菌Fusarium spp.的殺菌活性。 【方法】采用生長速率法，測定戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑各對映體對串珠鐮刀菌F. moniliforme、再育鐮刀菌F. proliferatum和禾谷鐮刀菌F. graminearum的殺菌活性，并分析各對映體EC50值。 【結果】3種三唑類手性殺菌劑對映體對供試串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌菌株的殺菌活性存在差異，(–)–戊唑醇＞(+)–戊唑醇，二者殺菌活性相差32～208倍；(+)–腈菌唑＞(–)–腈菌唑，二者殺菌活性相差1.4～6.4倍；在苯醚甲環(huán)唑對映體之間，(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑活性最高，4個對映體之間的殺菌活性相差3.7～15.5倍。 【結論】3種三唑類手性殺菌劑對映體對串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的殺菌活性均表現(xiàn)出選擇性差異，(–)–戊唑醇、(+)–腈菌唑和(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出較高的殺菌活性。本研究結果可為篩選活性高的殺菌劑、減少農藥使用提供理論參考。

手性農藥；三唑類殺菌劑；對映體；鐮刀菌；殺菌活性；立體選擇性

Key words:chiral pesticide; triazole fungicide; enantiomer; Fusarium spp.; fungicidal activity; enantioselective

水稻、玉米和小麥是我國三大主要糧食作物，產量占我國糧食總量的90%以上[1]。鐮刀菌屬Fusarium spp. 是農作物最重要的病原真菌之一，嚴重影響谷類作物生長及糧食產量[2]。史曉榕等[3]研究表明，串珠鐮刀菌F. moniliforme是作物穗粒腐病的主要病原菌，占所有分離群落的50%～83%；侯恩慶等[4]對水稻穗腐病原菌進行分離與鑒定發(fā)現(xiàn)，63.4%是再育鐮刀菌F. proliferatum；我國小麥赤霉病病原菌中禾谷鐮刀菌F. graminearum高達94. 5%[5]。同時，上述3種病原鐮刀菌可產生多種真菌毒素。串珠鐮刀菌和再育鐮刀菌可產生伏馬菌素，伏馬菌素可以引起人畜急性中毒和慢性毒性，如馬腦白質軟化綜合征、豬肺水腫和羊肝腎病變等，也可能與人類食管癌有關[6]。而小麥赤霉病致病菌禾谷鐮刀菌可產生單端孢霉烯族毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON，又稱嘔吐毒素)[7]。研究表明，嘔吐毒素能引起豬食欲減退或廢絕、嘔吐、體質量下降、流產、死胎和弱仔，抑制免疫機能和降低機體抵抗力[8]。可見，農作物中鐮刀菌病害的防治具有重要意義。

三唑類殺菌劑是目前應用范圍廣、防治效果好、使用量最大的一類殺菌劑，對多種作物病原菌具有良好的防治效果，可用于對擔子菌、子囊菌及半知菌三大菌綱真菌引起的多種病害的防治[9]。目前，三唑類殺菌劑也已廣泛用于作物中鐮刀菌病原菌的防治。同時，大多數(shù)三唑類殺菌劑是手性農藥，分子中一般均有1～2個手性中心，存在2或4個對映異構體。研究表明，手性農藥各對映體對靶標生物的生物活性、非靶標生物的毒性及在動植物體和環(huán)境中的降解行為都存在很大差異[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，某些三唑類手性殺菌劑對映體對多種病原菌如立枯絲核菌Rhizoctonia solani、番茄早疫病菌Alternaria solani、番茄葉霉病菌Cladosporium fulvum、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、玉蜀黍赤霉菌Gibberella zeae等表現(xiàn)出明顯的活性差異[12]。三唑類手性殺菌劑對映體對串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌這3種產毒性病原鐮刀菌的活性研究鮮見報道。本研究選取戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑3種三唑類手性殺菌劑為供試藥劑，測定其外消旋體和各對映體對上述3種產毒性病原鐮刀菌的生物活性，以期篩選出高效的對映體，減少農藥的使用量和環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：戊唑醇外消旋體、腈菌唑外消旋體、苯醚甲環(huán)唑外消旋體和各對映體(+)–戊唑醇、(–)–戊唑醇、(+)–腈菌唑、(–)–腈菌唑、(2S,4S)–苯醚甲環(huán)唑、(2S,4R)–苯醚甲環(huán)唑、(2R,4S)–苯醚甲環(huán)唑、(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑，均購自于上海勤路生物技術有限公司，w為98%。所有藥劑均用丙酮配制成質量濃度為5 000 μg·mL–1的母液，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?，用無菌水稀釋成不同質量濃度的工作液使用。

供試菌株：串珠鐮刀菌菌株(KU554607.1)和再育鐮刀菌菌株(AF291057.1)由華南農業(yè)大學天然農藥與化學生物學實驗室分離自蘆筍植株上并進行病原菌分離，得到的菌株經過純化，再進行單孢分離，最后進行分子生物學鑒定各選取1株作為本試驗的供試菌株；禾谷鐮刀菌菌株(KK082465.1)由南京農業(yè)大學周明國教授惠贈。

GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、無菌水1 L)。

1.2 不同對映體對供試菌株的毒力測定

采用慕立義[13]的菌絲生長速率法。供試三唑類殺菌劑外消旋體和各對映體用無菌水配置成7個質量濃度梯度，添加到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分震蕩混勻，然后倒入90 mm培養(yǎng)皿中制成含藥平板，各藥劑的質量濃度梯度(0～500 mg·L–1)，根據(jù)預試驗結果設定預試驗以加入丙酮的培養(yǎng)基做空白對照，試驗表明丙酮對菌絲生長無影響。以加入等體積無菌水的培養(yǎng)基做空白對照，每個濃度3次重復。首先將供試菌株接到PDA平板上，25℃培養(yǎng)4 d，再用直徑為4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔，將菌餅朝下轉接到含藥PDA平板中央；將接菌后的平板置于 25 ℃下倒置培養(yǎng)一定時間(串珠鐮刀菌培養(yǎng)6 d，再育鐮刀菌培養(yǎng)4 d，禾谷鐮刀菌培養(yǎng)3 d)后，測量菌落生長量。

采用十字交叉法測定菌落生長直徑[5]，求出平均值，計算菌絲生長抑制率：

抑制率=[(對照菌落直徑?處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件計算毒力回歸方程、EC50值及 95% 置信限。以藥劑濃度對數(shù)為X軸，菌絲生長抑制率的概率為Y軸，得到毒力回歸方程

計算出各藥劑抑制菌落的EC50值和相關系數(shù)(r)。

2 結果與分析

2.1 戊唑醇對映體對鐮刀菌的殺菌活性

戊唑醇對映體對3種鐮刀菌菌絲生長的抑制效果存在明顯差異(表1)。從表1可以看出，(–)–戊唑醇對3株鐮刀菌菌株的殺菌活性最高，對串珠鐮刀菌菌株(KU554607.1)、再育鐮刀菌菌株(AF291057.1)和禾谷鐮刀菌菌株(KK082465.1)的EC50值分別為0.015、0.131和 0.311 μg·mL–1；(+)–戊唑醇對3種供試鐮刀菌菌株的EC50值分別為3.147、4.223和11.128 μg·mL–1。(–)–戊唑醇的殺菌活性明顯高于(+)–戊唑醇，二者對3種鐮刀菌菌株的殺菌活性相差32～208倍。戊唑醇外消體對3種鐮刀菌菌株的殺菌活性介于(+)–戊唑醇和(–)–戊唑醇之間，EC50值分別為0.041、0.259和0.577 μg·mL–1。

表1 戊唑醇對映體對 3 種供試鐮刀菌的毒力測定結果Tab. 1 Toxicity of tebueonazole and its enantiomers against Fusarium spp.

2.2 腈菌唑對映體對鐮刀菌的殺菌活性

腈菌唑外消旋體及2個對映體對3種鐮刀菌的殺菌活性見表2。從表2可以看出，(+)–腈菌唑對3種鐮刀菌的殺菌活性均小于(–)–腈菌唑，(–)–腈菌唑與(+)–腈菌唑之間的毒力相差1.4～6.4倍；(+)–腈菌唑對串珠鐮刀菌菌株(KU554607.1)、再育鐮刀菌菌株(AF291057.1)和禾谷鐮刀菌菌株(KK082465.1)的EC50值分別為0.425、1.703和0.560 μg·mL–1；而(–)–腈菌唑對3種鐮刀菌的EC50值分別為0.578、10.902和2.204 μg·mL–1。腈菌唑外消旋體對3種供試鐮刀菌的EC50值介于(–)–腈菌唑和(+)–腈菌唑之間，EC50值分別為0.426、3.376和0.683 μg·mL–1。

表2 腈菌唑對映體對 3 種供試鐮刀菌的毒力測定結果Tab. 2 Toxicity of myclobutanil and its enantiomers against Fusarium spp.

2.3 苯醚甲環(huán)唑對映體對鐮刀菌的殺菌活性

苯醚甲環(huán)唑外消旋體和4個對映體對鐮刀菌菌株的活性見表3。從表3可知，在4個對映體中，(2R,4R)–苯醚甲環(huán)唑對3種鐮刀菌的殺菌活性最高，EC50值分別為0.242、0.217和0.555 μg·mL–1；(2S,4R)–苯醚甲環(huán)唑和(2R,4S)–苯醚甲環(huán)唑對3種鐮刀菌的活性相差不大，EC50值在0.355～1.535 μg·mL–1之間；(2S,4S)–苯醚甲環(huán)唑對3種供試鐮刀菌的殺菌活性最小，EC50值分別為3.020、3.376和 2.026 μg·mL–1。苯醚甲環(huán)唑4個對映體對3種鐮刀菌的殺菌活性相差3.7～15.5倍。

表3 苯醚甲環(huán)唑對映體對 3 種供試鐮刀菌的毒力測定結果Tab. 3 Toxicity of difenaconazole and its enantiomers against Fusarium spp.

3 討論與結論

三唑類殺菌劑作為目前應用范圍最廣、使用量最大的一類殺菌劑，已用于多種作物病原菌的防治。三唑類殺菌劑對小麥的多種病害，如銹病、白粉病、紋枯病、全蝕病、根腐病以及黑穗病等均有良好的防治效果[14]。本研究表明，三唑類殺菌劑戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑對串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌這3種重要作物病原鐮刀菌表現(xiàn)出較強的生物活性，戊唑醇對3種病原鐮刀菌的EC50值分別達0.041、0.259和 0.577 μg·mL–1；腈菌唑對3種病原鐮刀菌的EC50值為0.426、3.376和 0.683 μg·mL–1；苯醚甲環(huán)唑對3種病原鐮刀菌的EC50值為0.805、0.701和 0.704 μg·mL–1。表明這3種三唑類殺菌劑具有防治鐮刀菌病害的潛力，但需要做進一步的室內和田間研究?？偟膩碚f，戊唑醇對于3種病原鐮刀菌的殺菌活性高于另外2種三唑類殺菌劑腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑。這與張勇等[15]曾報道室內離體條件下戊唑醇對小麥赤霉病菌的殺菌活性高于腈菌唑的結果一致。

大多數(shù)三唑類殺菌劑是手性農藥，分子中均有1個或多個手性中心。研究表明，手性農藥對映體之間對靶標生物的活性表現(xiàn)出立體選擇性差異[16]。本研究采用菌絲生長速率法，分別測定了戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑3個手性殺菌劑對映體對3種鐮刀菌的殺菌活性，結果表明，對映體間存在立體選擇性差異，其差異大小與殺菌劑種類和靶標生物有關。在戊唑醇的2個對映體之間，(–)–戊唑醇的殺菌活性遠高于(+)–戊唑醇，對串珠鐮刀菌、再育鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的殺菌活性相差分別達208、32和35倍，表現(xiàn)出明顯的立體選擇性差異，同時其差異大小與目標菌株也相關。同樣，腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑各對映體間也表現(xiàn)出選擇性差異，對3種菌株的殺菌活性差異分別為1.4～6.4和3.7～15.5倍。有研究報道，在手性殺菌劑對映體間，往往一個對映體具有強的活性，而另一個對映體活性卻很低。Dong等[12]報道，2R,4S–苯醚甲環(huán)唑對灰葡萄孢菌的活性高于2S,4S–苯醚甲環(huán)唑，二者相差24.2倍；Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，(–)–已唑醇對褐腐病菌、芒果炭疽病菌和鏈格孢菌等的活性遠高于(+)–已唑醇；Stehmann等[18]研究結果表明，(–)–戊唑醇的生物活性比(+)–戊唑醇高出100多倍；Sun等[19]報道，(+)–腈菌唑對番茄晚疫病菌、褐斑病菌和番茄葉霉病菌的活性高于(–)–腈菌唑，二者相差1.79～1.90倍。本研究結果與前人研究結果相一致，手性農藥對映體對靶標生物的活性存在立體選擇性差異，其原因或許在于結合了結構敏感生物受體或有天然存在的手性生物分子。今后將進一步開展室內生物測定和田間試驗，為篩選高活性殺菌劑單體，減少農藥使用和保護環(huán)境提供參考。

[1]趙倩倩. 中國主要糧食作物農藥使用現(xiàn)狀及問題研究[D]. 北京: 北京理工大學, 2015.

[2]林鎮(zhèn)躍, 闕友雄, 劉平武, 等. 植物致病鐮刀菌的研究進展[J]. 中國甜菜, 2014(1): 58-64.

[3]史曉榕, 白麗. 不同類型玉米群體穗粒腐病病原菌的調查研究[J]. 植物保護, 1992, 18(5): 28-29.

[4]侯恩慶. 水稻穗腐病鐮刀菌及相關毒素研究[D]. 南寧: 廣西大學, 2013.

[5]全國小麥赤霉病研究協(xié)作組. 我國小麥赤霉病穗部鐮刀菌種類、分布及致病性[J]. 上海師范學院學報(自然科學版), 1984(3): 69-82.

[6]王少康. 伏馬菌素污染情況及其毒性研究進展[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學, 2003, 20(2): 129-131.

[7]史建榮, 劉馨, 仇劍波, 等. 小麥中鐮刀菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染現(xiàn)狀與防控研究進展[J]. 中國農業(yè)科學, 2014, 47(18): 3641-3654.

[8]SWAMY H V L N, SMITH T K, MACDONALD E J, et al. Effects of feeding a blend of grains naturally contaminated with Fusarium mycotoxins on swine performance, brain regional neurochemistry, and serum chemistry and the efficacy of a polymeric glucomannan mycotoxin adsorbent[J]. J Anim Sci, 2002, 80(12): 3257-3267.

[9]周子燕, 李昌春, 高同春, 等. 三唑類殺菌劑的研究進展[J]. 安徽農業(yè)科學, 2008, 36(27): 11842-11844.

[10]李遠播. 幾種典型手性三唑類殺菌劑對映體的分析、環(huán)境行為及其生物毒性研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2013.

[11]孫明婧. 四種三唑類手性農藥的環(huán)境行為研究[D]. 北京: 中國農業(yè)大學, 2014.

[12]DONG F, LI J, CHANKVETADZE B, et al. Chiral triazole fungicide difenoconazole: Absolute stereochemistry, stereoselective bioactivity, aquatic toxicity, and environmental behavior in vegetables and soil[J]. Environ Sci Technol, 2013, 47(7): 3386-3394.

[13]慕立義. 植物化學保護研究方法[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 1994: 76-81.

[14]劉傳德, 王培松, 王繼秋, 等. 三唑類殺菌劑及其在小麥病害防治中的應用研究進展[J]. 山東農業(yè)大學學報(自然科學版), 2005, 36(1): 157-160.

[15]張勇, 馬嚴明, 徐勁鋒, 等. 幾種三唑類殺菌劑對小麥赤霉病菌毒力的測定及藥效試驗[J]. 安徽農業(yè)科學, 2004, 32(2): 248-249.

[16]李晶. 三唑類手性殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的立體選擇性生物活性與環(huán)境行為研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2012.

[17]HAN J, JIANG J, SU H, et al. Bioactivity, toxicity and dissipation of hexaconazole enantiomers[J]. Chemosphere, 2013, 93(10): 2523-2527.

[18]STEHMANN C, DE WAARD M A. Relationship between chemical structure and biological activity of triazole fungicides against Botrytis cinerea[J]. Pest Manag Sci, 1995, 44(2): 183-195.

[19]SUN M, LIU D, QIU X, et al. Acute toxicity, bioactivity, and enantioselective behavior with tissue distribution in rabbits of myclobutanil enantiomers[J]. Chirality, 2014, 26(12): 784-789.

【責任編輯 周志紅】

Selective bioactivity of enantiomers of three triazole fungicides against Fusarium spp.

LI Na, ZHANG Liyang, DIAO Xue, BI Xianfeng, LIU Chenglan
(Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/Key Laboratory of Bio-pesticide Innovation and Application of Guangdong Province/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To study the activities of enantiomers of three triazole fungicides against Fusarium spp..【Method】Three chiral fungicides included tebuconazole, myclobutanil and difenoconazole. The activities of fungicide enantiomers against F. moniliforme, F. proliferatum and F. graminearum were assessed by mycelial growth rate method, respectively. The EC50values of enantiomers were analyzed. 【Result】The activities of different enantiomers against three kinds of Fusarium spp. were different. The activity of (–)-tebuconazole was higher than (+)-tebuconazole, and the EC50difference of two enantiomers was 32–208 times. The inhibitory activity of (+)-myclobutanil was higher than (–)-myclobutanil, and the EC50difference of two enantiomers was 1.4–6.4 times. (2R,4R)-difenoconazole showed the maximum activity among four enantiomers of difenoconazole, and the EC50difference of four enantiomers was 3.7–15.5 times. 【Conclusion】For Fusarium spp., the activities of three fungicides show selective difference. (–)-tebuconazole, (+)-myclobutanil and (2R,4R)-difenoconazole show higher activities. These results might contribute to screening higher active fungicides and reducing the use of pesticides.

S511；S502

A

1001-411X(2017)05-0056-05

李納, 張麗陽, 刁雪, 等. 3種三唑類殺菌劑對映體對鐮刀菌的選擇性活性[J]. 華南農業(yè)大學學報, 2017, 38(5): 56-60.

2016-10-01 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0856.020.html

李 納(1992—)，女，碩士研究生，E-mail: 1272807635@qq.com； 通信作者： 劉承蘭(1976—)，男，副教授，博士，E-mail: liuchenglan@scau.edu.cn

國家自然科學基金(31371959)