不同濃度氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)的影響

張夢(mèng)媛，莊 魯，萬小娟，束 剛，王麗娜，朱曉彤，高 萍，王松波，江青艷

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

不同濃度氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)的影響

張夢(mèng)媛?，莊 魯?，萬小娟，束 剛，王麗娜，朱曉彤，高 萍，王松波，江青艷

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】研究不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)的影響及其機(jī)理。【方法】5日齡仔豬門靜脈灌流后從中分離純化出肝細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的氨基酸(分別為豬血液中氨基酸生理濃度的1、2和4倍)，24 h后收集上清和細(xì)胞。用比色法檢測(cè)上清中尿素、底物氨和細(xì)胞中氨的濃度以及谷氨酰胺酶(Glutaminase, GLS)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)的活性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamyl phosphate synthetase 1, CPS1)、精氨基琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase, ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase, ASL)、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(Omithine transcarbamylase, OTC)和精氨酸酶(Arginase, ARG)等尿素循環(huán)相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)?！窘Y(jié)果】4倍氨基酸組顯著提高了仔豬原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中氨和尿素的濃度，增強(qiáng)了細(xì)胞中GLS的活性。熒光定量PCR結(jié)果表明，4倍氨基酸組顯著提高了細(xì)胞中CPS1、ASS和ASL等基因mRNA的表達(dá)。1.0和2.0 mmol·L–1的NH4Cl顯著促進(jìn)細(xì)胞尿素的合成?！窘Y(jié)論】在仔豬原代肝細(xì)胞中，高濃度氨基酸可以通過提高GLS的活性等途徑加速氨的積累，促進(jìn)CPS1、ASS、ASL等尿素循環(huán)相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)尿素的生成。

仔豬；原代肝細(xì)胞；氨基酸；尿素循環(huán)；氨；基因表達(dá)；酶活性

尿素循環(huán)本質(zhì)上是一個(gè)將神經(jīng)毒素氨轉(zhuǎn)化為水溶性尿素的過程，是精氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸的內(nèi)源性生產(chǎn)的唯一來源，也是清除蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)造成的廢氮的主要機(jī)制[1]，從而避免高氨血癥的發(fā)生。該循環(huán)是包括6 個(gè)步驟的系列生化反應(yīng)[2]，有6 種酶參與調(diào)控，依次為N–乙酰谷氨酸合成酶(N-acetyl glutamate synthetase, NAGS)、氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamyl phosphate synthetase 1, CPS1)、精氨基琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase, ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase, ASL)、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(Omithine transcarbamylase, OTC)和精氨酸酶(Arginase, ARG)[1-2]。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，尿素的合成幾乎都是發(fā)生在肝臟中，動(dòng)物肝臟通過提高對(duì)氨基酸的利用，合成更多的能夠促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育的功能性蛋白，可提高日糧氮素的利用效率[3]。尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，能較準(zhǔn)確反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡情況。動(dòng)物機(jī)體將氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨轉(zhuǎn)化成尿素，其中在靠近門靜脈的肝細(xì)胞通過谷氨酰胺酶(Glutaminase, GLS)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)的作用可以控制氨的去向[4]。高蛋白日糧下，門靜脈游離氨基酸濃度會(huì)上升2～4倍左右，導(dǎo)致氨基酸代謝加強(qiáng)，氨的累積增多，而氨是一種有毒性的代謝產(chǎn)物，影響機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)，如不能及時(shí)轉(zhuǎn)化成尿素，會(huì)影響機(jī)體正常代謝[5-6]。

目前氨基酸對(duì)尿素循環(huán)的影響及其分子機(jī)制在細(xì)胞水平上仍有待研究。CPS1基因在人肝癌細(xì)胞系中并不表達(dá)[7]，因此本研究以仔豬原代肝細(xì)胞為研究對(duì)象，研究不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)的影響及其可能機(jī)制，旨在開展氨基酸與尿素循環(huán)相關(guān)規(guī)律的研究，建立氨基酸與尿素循環(huán)相關(guān)規(guī)律的代謝模型，為提高豬體內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)的利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的5日齡二元雜母豬，購(gòu)自廣東省增城市華泰大型養(yǎng)殖場(chǎng)。新生胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶液為GIBCO公司產(chǎn)品，無氨基酸培養(yǎng)基購(gòu)自上海江萊生物有限公司，IV型膠原酶、RIPA蛋白裂解液為百泰克公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑和RT-PCR試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司，血氨測(cè)定試劑盒(比色法)、GLS檢測(cè)試劑盒(比色法)和GS測(cè)定試劑盒(比色法)均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，尿素檢測(cè)試劑盒(比色法)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 根據(jù)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院生理生化實(shí)驗(yàn)室參照Farrell[8]創(chuàng)立的剪切消化法改良的原位2步灌流法分離純化得到5日齡仔豬原代肝細(xì)胞，鋪板于6孔板內(nèi)(接種密度為1×106mL–1，2 mL·孔–1)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%與飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h細(xì)胞貼壁后，用生長(zhǎng)培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS及100 U·mL–1青霉素、100 μg·mL–1鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液)全量換液，盡量去除死細(xì)胞與組織碎片，待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)孔約70%面積時(shí)改用含不同濃度氨基酸(1×、2×和4×)的培養(yǎng)基(含100 nmol·L–1胰島素，100 nmol·L–1地塞米松和1 mg·L–1生長(zhǎng)激素)，其中1倍氨基酸的濃度(相當(dāng)于豬血液中氨基酸的生理濃度)為：L–丙氨酸, 350; L–精氨酸, 100; L–天冬酰胺, 50; L–天冬氨酸, 20; L–胱氨酸, 75; L–谷氨酸, 75; 甘氨酸, 250; L–組氨酸, 100; L–異亮氨酸, 150; L–亮氨酸, 200; L–賴氨酸, 200; L–蛋氨酸, 75; L–苯丙氨酸, 100; L–脯氨酸, 200; L–絲氨酸, 200; ?；撬? 100; L–蘇氨酸, 200; L–色氨酸, 75; L–酪氨酸, 100; L–纈氨酸, 250; L–谷氨酰胺, 500[9]，單位均為μmol·L–1。并在1倍氨基酸組的基礎(chǔ)上，采用 0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mmol·L–1的NH4Cl處理肝細(xì)胞，以檢測(cè)不同濃度的氨對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中尿素濃度的影響。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 尿素通過偶聯(lián)酶促反應(yīng)測(cè)定，有色產(chǎn)物通過比色法(570 nm)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果與樣品中的尿素含量成正比；血氨采用無蛋白濾液法測(cè)定；GLS測(cè)定以37 ℃下每小時(shí)催化谷氨酰胺產(chǎn)生1 μmol氨為1個(gè)酶活性單位(U)；GS測(cè)定以37 ℃條件下15 min內(nèi)催化形成1 μmol γ–谷氨酰氧肟酸所需要的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

仔豬原代肝細(xì)胞總RNA的抽提使用1步法RNA抽提試劑TRIzol，常規(guī)方法抽提，用Oligo(dT)引物和AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq，上、下游引物和cDNA模板，以β-actin為內(nèi)參，熒光定量PCR法檢測(cè)尿素循環(huán)相關(guān)酶基因，即CPS1、ASS、ASL、OTC和ARG基因mRNA的表達(dá)。相關(guān)基因的引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)不同處理組間的數(shù)值進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的氨基酸對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中尿素濃度的影響

如圖1所示，4倍氨基酸組細(xì)胞上清中尿素的濃度顯著高于對(duì)照組(1×)(P＜0.05)，提示4倍氨基酸組肝細(xì)胞向培養(yǎng)液中釋放更多的尿素。

圖1 不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中尿素濃度的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of amino acids on urea concentration in the culture supernatant of primary porcine hepatocytes

2.2 不同濃度的氨基酸對(duì)底物氨濃度的影響

為了探究肝細(xì)胞尿素釋放差異的原因，我們進(jìn)一步檢測(cè)了尿素生成的底物氨的濃度。結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中4倍氨基酸顯著促進(jìn)了氨的濃度，而不同濃度的氨基酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨的濃度無顯著影響(P＞0.05)。提示高濃度氨基酸組能夠代謝產(chǎn)生更多的氨，從而促進(jìn)了尿素的生成。氨在肝細(xì)胞內(nèi)不會(huì)形成累積，多余的氨會(huì)被釋放到胞外用于尿素的合成。

表1 熒光定量PCR所用引物序列Tab. 1 The primer sequences used for real-time quantitative PCR

圖2 不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中氨濃度的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of amino acids on ammonia concentration in primary porcine hepatocytes and in the culture supernatant of primary porcine hepatocytes

2.3 不同濃度的氨基酸對(duì)尿素循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

為了探究氨的主要來源，我們檢測(cè)了仔豬原代肝細(xì)胞內(nèi)GLS和GS的活性水平，結(jié)果顯示4倍氨基酸顯著促進(jìn)了GLS活性(圖3A)，但氨基酸濃度對(duì)GS活性無顯著影響(圖3B)，提示氨基酸濃度的提高會(huì)選擇性的促進(jìn)GLS的表達(dá)。

圖3 不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of amino acids on activities of the key enzymes involved in urea cycle in primary porcine hepatocytes

2.4 不同濃度的氨基酸對(duì)尿素循環(huán)相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

為了研究不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)影響的分子機(jī)制，采用熒光定量PCR法檢測(cè)了參與尿素循環(huán)相關(guān)酶基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果如圖4顯示，4倍氨基酸可以顯著提高CPS1、ASS和ASL基因mRNA的表達(dá)，而各組間OTC和ARG基因mRNA的表達(dá)水平無顯著差異。

2.5 不同濃度的氨對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中尿素濃度的影響

如圖5所示，在1倍氨基酸組的基礎(chǔ)上，1.0 和2.0 mmol·L–1的NH4Cl顯著促進(jìn)細(xì)胞上清中尿素的生成，而氨濃度達(dá)到4.0和8.0 mmol·L–1的高濃度組和對(duì)照組(0 mmol·L–1)相比無顯著差異，提示氨基酸調(diào)節(jié)尿素循環(huán)的主要因素是氨，而氨的濃度如果超出肝細(xì)胞所能承受生理范圍，會(huì)造成肝細(xì)胞尿素循環(huán)紊亂。

圖4 不同濃度的氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)相關(guān)酶基因表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of amino acids on the mRNA expression of the enzymes involved in urea cycle in primary porcine hepatocytes

3 討論與結(jié)論

豬活體中，當(dāng)氨基酸平衡合適時(shí)，氨基酸可以更好的發(fā)揮功能，提高了氨基酸的利用效率，血清尿素氮濃度才會(huì)下降。研究表明過高的日糧蛋白質(zhì)會(huì)加重消化道和肝臟的負(fù)擔(dān)，影響其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如碳水化合物等)的吸收和代謝，導(dǎo)致代謝性酸中毒，影響心血管功能[10]。也有研究表明，日糧蛋白質(zhì)水平每下降1個(gè)百分點(diǎn)，糞、尿氮的釋放量就下降10%[11]。

圖5 不同濃度的氨對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中尿素濃度的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of ammonia on urea concentration in the culture supernatant of primary porcine hepatocytes

尿素循環(huán)利用是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源氮去向最重要的組成部分。動(dòng)物機(jī)體將氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨轉(zhuǎn)化成尿素，通過谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酰胺合成酶(GS)的作用控制氨的去向。GS是將谷氨酸和氨合成為谷氨酰胺，而GLS把谷氨酰胺分解為谷氨酸和氨，占肝臟氨生成量的40%，生成的氨被運(yùn)輸?shù)娇拷戊o脈的肝細(xì)胞中[12]。有研究表明在動(dòng)物活體水平上高蛋白組(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 13.5%)日糧可促進(jìn)日糧氮在動(dòng)物機(jī)體的沉積，高蛋白質(zhì)水平可以提高尿素氮和氨態(tài)氮的濃度[13]，研究結(jié)果與本試驗(yàn)一致。我們研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝細(xì)胞周圍的氨基酸濃度上升到4倍于氨基酸的生理水平，細(xì)胞中谷氨酰胺酶的活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞上清中尿素和氨的濃度也有顯著升高，結(jié)果也表明氨基酸的代謝產(chǎn)物可以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)尿素合成。其原因可能在于活體血液中過高濃度的谷氨酰胺是有毒性的，靠近門靜脈的肝細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)谷氨酰胺酶的表達(dá)，促進(jìn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)化成谷氨酸，從而釋放出氨[14]。高濃度的氨基酸雖然保證了機(jī)體對(duì)氨基酸的需求，但是氨基酸代謝的加強(qiáng)會(huì)選擇性地促進(jìn)谷氨酰胺酶的表達(dá)[15]，加速氨的積累，提高肝臟中尿素的合成，從而降低日糧氮素的利用效率。

為研究氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)影響的分子機(jī)制，我們用不同濃度的氨基酸處理肝細(xì)胞，檢測(cè)了參與尿素循環(huán)相關(guān)酶基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度的氨基酸可以顯著提高CPS1、ASS和ASL基因的mRNA表達(dá)，而各組間OTC和ARG基因的mRNA水平無顯著差異。表明當(dāng)氨濃度超出生理合理范圍(0.2～0.3 mmol·L–1)[16]，就會(huì)刺激CPS1、ASS和ASL基因的mRNA水平上調(diào)，而OTC和ARG是表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的酶，對(duì)外界條件的變化不敏感。CPS1是尿素循環(huán)的第1步，也是該反應(yīng)的限速酶，有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)日糧蛋白供應(yīng)過高或缺少碳水化合物等能量供應(yīng)時(shí)，CPS1基因的mRNA水平會(huì)顯著上調(diào)[17-18]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)ASS可以通過增強(qiáng)精氨酸的再生進(jìn)而促進(jìn)一氧化氮(NO)生成[19]，從而保證尿素循環(huán)的高效性，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。已有研究表明，ASL的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，其活性受氧氣含量變化影響[20]，氧氣越充足，表達(dá)量越高，因此ASL在肝臟中的表達(dá)有位置差異性，這也是高濃度組氨基酸ASL基因mRNA水平被顯著上調(diào)的可能原因之一。另有文獻(xiàn)報(bào)道，高濃度的氨基酸通過抑制ASL乙?；罨竅18]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。精氨酸酶(ARG)是唯一存在2種同工酶的尿素循環(huán)酶，它們被不同的基因編碼，ARG I在肝臟中高度表達(dá)，ARG II在腎臟中高度表達(dá)[21]，本試驗(yàn)中檢測(cè)的是肝細(xì)胞中ARG基因的mRNA水平，腎臟中高度表達(dá)的ARG II并未檢測(cè)。有研究表明，灌流大鼠肝臟后，ARG II可以在靜脈周肝細(xì)胞中與鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶共表達(dá)，以促進(jìn)這些細(xì)胞合成谷氨酰胺[22]，這是本試驗(yàn)中ARG基因的mRNA水平?jīng)]有顯著差異的可能原因之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，去乙酰化酶5(Sirtuin 5, SIRT5)能夠增強(qiáng)CPS1的活性，CPS1在SIRT5的作用下脫去乙?；患せ?，而在敲除了SIRT3、SIRT4或SIRT5的小鼠中，OTC活性均不受影響[23]，提示OTC是表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的酶，對(duì)外界條件的變化不敏感，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

值得注意的是，血氨的生理濃度是0.2～0.3 mmol·L–1[16]，但在本次處理肝細(xì)胞的試驗(yàn)中，濃度為1.0和2.0 mmol·L–1的氨才顯著促進(jìn)尿素的生成，4.0 mmol·L–1氨條件下肝細(xì)胞尿素合成受到阻礙，原因很可能是活體的血液中含有豐富的內(nèi)分泌因子(如生長(zhǎng)激素)，它能顯著降低尿素循環(huán)的中間產(chǎn)物氨基酸(如瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸)的濃度，減弱CPS1、ASS、ASL等酶的活性，從而抑制尿素的生成[24]。所以體外肝細(xì)胞可以比體內(nèi)更適應(yīng)高濃度的氨。其結(jié)果也表明氨基酸的代謝產(chǎn)物可以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)尿素的合成，但過量的氨會(huì)造成尿素循環(huán)紊亂，導(dǎo)致尿素合成的降低。

綜上所述，氨基酸可以通過升高谷氨酰胺酶的水平加速氨的積累，促進(jìn)CPS1、ASS、ASL等尿素循環(huán)相關(guān)酶基因的mRNA表達(dá)，從而提高尿素的生成。研究結(jié)果為開展氨基酸與尿素循環(huán)相關(guān)規(guī)律的研究，建立氨基酸與尿素循環(huán)相關(guān)規(guī)律的代謝模型提供了直接的試驗(yàn)依據(jù)。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Effects of different concentrations of amino acids on urea cycle in primary porcine hepatocytes

ZHANG Mengyuan?, ZHUANG Lu?, WAN Xiaojuan, SHU Gang, WANG Lina, ZHU Xiaotong, GAO Ping, WANG Songbo, JIANG Qingyan
(College of Animal Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To investigate the effects of different concentrations of amino acids on urea cycle in primary hepatocytes isolated from piglet, and explore the potential mechanism.【Method】Primary hepatocytes isolated from 5-day old piglet were cultured in medium containing different concentrations of amino acids (AA)(1, 2, or 4 times of physiological concentration in serum). After 24 h, the supernatant and cells were collected. Urea and ammonia concentrations in the supernatant, glutaminase(GLS) and glutamine synthetase(GS) activities and ammonia concentration in cells were examined by colorimetry. The mRNA expression of genes involved in urea cycle, including carbamyl phosphate synthetase 1(CPS1), Argininosuccinate synthetase(ASS), Argininosuccinate lyase(ASL), Omithine transcarbamylase (OTC), Arginase (ARG) were detected by qRT-PCR.【Result】Urea and ammonia concentrations in the supernatant, and GLS activity in cells were significantly elevated in 4×AA group. Meanwhile, 4×AA remarkably increased the mRNA expression of CPS1, ASS and ASL genes in hepatocytes. NH4Cl at 1.0 and2.0 mmol·L–1concentrations significantly promoted urea synthesis in the cell.【Conclusion】High concentration of AA might accelerate ammonia accumulation by GLS and enhance the expression of the urea cycle enzymes (CPS1, ASS and ASL), which contribute to increased production of urea.

piglet; primary hepatocyte; amino acid; urea cycle; ammonia; gene expression; enzyme activity

S828

A

1001-411X(2017)05-0001-06

張夢(mèng)媛, 莊魯, 萬小娟, 等. 不同濃度氨基酸對(duì)仔豬原代肝細(xì)胞尿素循環(huán)的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 38(5): 1-6.

2017-03-04 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0855.002.html

張夢(mèng)媛(1994—)，女，碩士研究生，E-mail: 563508886@qq.com；莊 魯(1989—)，男，碩士，E-mail: 823614382@qq.com；?對(duì)本文貢獻(xiàn)相同； 通信作者： 江青艷(1966—)，男，教授，博士，E-mail: qyjiang@scau.edu.cn

973項(xiàng)目(2013CB127304)