五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬對外源性脂肪的敏感性觀察

陳 亮，潘永明，朱科燕，徐孝平，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬對外源性脂肪的敏感性觀察

陳 亮，潘永明，朱科燕，徐孝平，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

目的 觀察五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬對外源性脂肪的敏感性。方法 取雄性五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬各5只，分別采用靜脈注射脂肪乳和飼喂高脂飼料，分別檢測靜脈注射脂肪乳后0.5、1、1.5、2、2.5、3 h和飼喂高脂飼料后12、24、36、48、60、72、84、120 h的血清膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三酯(TG)水平，并計算曲線下面積變化ΔAUC值。結果 注射脂肪乳后3種小型豬甘油三酯(TG)均明顯升高(P<0.01)，在注射后0.5 h達到峰值，其升高程度和ΔAUC值高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬，而TC、LDL-C和HDL-C則無明顯變化(P>0.05)；高脂飼料飼喂飲食誘導后3種小型豬TC、LDL-C、HDL-C和TG均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其中，五指山小型豬TC、LDL-C在飼喂后36 h、HDL-C在飼喂后48 h、TG在飼喂后24 h達到峰值，巴馬小型豬和西藏小型豬TC、LDL-C、HDL-C在飼喂后48-60 h、TG在飼喂后36 h達到峰值，TC、LDL-C、HDL-C的ΔAUC值高低依次為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬。結論 靜脈注射脂肪乳3種小型豬對TG敏感，脂耐量值高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬；高脂飼料飼喂對3種小型豬TC、LDL-C、HDL-C敏感，脂耐量值高低依次為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬。

小型豬；血脂代謝；脂耐量；敏感性

血脂異常是引起動脈粥樣硬化、心腦血管疾病和高血壓的重要危險因素。隨著人類物質生活水平和生活方式的改變，血脂異常的患病率呈逐漸上升趨勢，已成為21世紀人類健康普遍關注的問題[1]。血脂代謝異常主要包括膽固醇和甘油三酯水平的異常改變，其敏感性可能與遺傳因素有關。

小型豬是研究心腦血管疾病的一個重要模型，其循環(huán)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)與人類極為相似[2]。在脂質成分的比例與人類十分接近，如小型豬血脂中LDL-C成分比例占主導，而兔和大小鼠LDL-C成分所占比例極少，與人類差異較大[3]。我國有豐富的小型豬種質資源，如五指山小型豬、廣西巴馬小型豬、西藏小型豬、版納小型豬、貴州香豬等，但在許多生理及其應用特點尚未清楚，在人類疾病動物模型復制和評價中具有較好的應用價值。當前除采用糖耐量和胰島素耐量篩選評價糖代謝和胰島素代謝的敏感性外，未見小型豬血脂耐量的相關研究方法。選擇和篩選對某些指標易感性強的實驗動物，關系到疾病動物模型是否成功的關鍵因素之一。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)在同樣的高脂環(huán)境下，巴馬小型豬、西藏小型豬、五指山小型豬的血脂水平和動脈粥樣硬化斑塊的形成進度存在差異，推測可能與血脂的敏感性和耐量有關。目前有采用糖耐量和胰島素耐量篩選評價糖代謝和胰島素代謝的敏感性。為此，本實驗采用注射脂肪乳和飼喂高脂飼料，觀察巴馬小型豬、西藏小型豬、五指山小型豬在血脂代謝敏感性，為這3種小型豬在心腦血管疾病模型中的應用和動物選擇提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級五指山小型豬(WZS)和西藏小型豬(Tibetan)各5只，雄性，體重為(14～18) kg，分別購于廣東大華動物保健品股份有限公司提供【SCXK(粵)2008-0022】和南方醫(yī)科大學實驗動物中心 【SCXK(粵)2011-0015】；普通級巴馬小型豬5只，雄性，體重為14～18 kg，購于上海市南匯區(qū)老港鎮(zhèn)華新特種養(yǎng)殖場提供【SCXK(滬)2012-0013】。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級實驗室【SYXK(浙)2008-0116】，環(huán)境溫度為(22±1)℃，相對濕度為45%～65%。飼喂全價營養(yǎng)飼料和自由飲水，12 h/12 h明暗交替，所有小型豬在實驗過程中按實驗動物使用的“3R”原則給予人道的關懷，并在適應性恢復8周后開始正式試驗。

1.2 主要儀器及試劑

7020全自動生化分析儀，日本日立公司；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)均由上海申能德賽診斷技術有限公司提供。30%脂肪乳注射液(英脫利匹特)，華瑞制藥有限公司生產，批號：80EA153。高脂飼料：15%油脂、10%蛋黃粉、1.5%膽固醇、73.5%基礎飼料。

1.3 方法

1.3.1 靜脈注射脂肪乳對小型豬血脂代謝的影響：實驗前將五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬禁食12 h后，稱重并行頸靜脈穿刺取血1 mL，而后耳緣靜脈注射1 mL/kg的脂肪乳，分別在靜脈注射前、注射后0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時取血，分離血清，測定血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的變化，并計算各指標的變化幅度(Δ)及曲線下面積AUC(脂耐量值)。

1.3.2 高脂飲食對小型豬血脂代謝的影響：實驗前將五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬禁食12 h，稱重并行頸靜脈穿刺取血1 mL，然后按3%體重給予高脂飼料，分別在高脂飲食前、給予后12、24、36、48、60、72、84、120 h時取血，測定血清TG、TC、LDL-C和HDL-C指標的變化，并計算各指標的變化幅度及曲線下面積AUC(脂耐量值)。其中在高脂飲食24 h后開始飼喂基礎飼料300 g/d，分成上午9:00和下午15:00兩次飼喂。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 靜脈注射脂肪乳對3種品系小型豬血脂代謝的影響

注射脂肪乳后，3種小型豬的血清TC、LDL-C和HDL-C水平給藥前后均無明顯變化(P>0.05)，僅見血清TG水平出現(xiàn)顯著性升高(P<0.01)，并在注射0.5 h后達到峰值，隨后開始逐漸降低，且在注射后(2.5～3)h時間點恢復到基礎水平；另外，3種小型豬的AUC_ΔTG的曲線面積從高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬，但各品種間無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

注：與西藏小型豬比較，*P<0.05，**P<0.01；與巴馬小型豬比較，△P<0.05，△△P<0.01；與注射前(0h)比較，#P<0.05，##P<0.01.圖1 靜脈注射脂肪乳對3種品系小型豬血脂代謝的影響Note. Compared with the Tibetan minipigs,*P<0.05,**P<0.01; Compared with the Bama minipigs, △P<0.05,△△P<0.01; Compared with that before injection (0 h),#P<0.05,##P<0.01.Fig.1 Effect of intravenous injection of fat emulsion on lipid metabolism in the three stocks of minipigs

2.2 高脂飲食對3種品系小型豬血脂代謝的影響

飼喂高脂飼料后，五指山小型豬TC水平明顯升高，其中在(24～72)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在36 h時達到峰值，此后開始降低，直至120 h仍高于基礎水平；而西藏小型豬和巴馬小型豬TC水平亦升高顯著，分別在(24～72)h和(24～84)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在48 h時達到峰值，隨后開始降低并直至120 h時仍高于基礎水平；從AUC_ΔTC來看，其高低依次分別為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬，其中西藏小型豬AUC_ΔTC明顯低于五指山小型豬(P<0.05)，見圖2A。另外，五指山小型豬和西藏小型豬的HDL-C水平亦明顯升高，其中(24～120)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在(48～60)h時達到峰值，此后降低并直至120 h；巴馬小型豬HDL-C水平亦有升高，其中(24～84)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在48～60 h左右達到峰值，此后下降直至120 h，從AUC_ΔHDL-C來看，其高低依次分別為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬，但品種間差異不顯著(P>0.05)，見圖2B。此外，五指山小型豬LDL-C水平明顯升高，其中在(24～72)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在36h時達到峰值，此后逐漸降低并至120 h；而西藏小型豬和巴馬小型豬LDL-C水平亦升高顯著，分別在(24～72)h和(24～60)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，且分別在60 h和48 h時達到峰值，隨后開始降低并直至120 h；從AUC_ΔLDL-C來看，其高低依次分別為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬，其中西藏小型豬AUC_ΔLDL-C明顯低于五指山小型豬(P<0.05)，見圖2C。同樣，五指山小型豬的TG出現(xiàn)升高，并在飼喂后(84～120)h時升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在120 h時達到峰值；而西藏小型豬和巴馬小型豬的TG亦有上升，并在飼喂后(24～36)h時升高顯著，且分別在36 h和24 h時達到峰值，此后有所下降，并在48～120 h間維持一定的水平，從AUC_ΔTG來看，其高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬，但品種間無明顯差異(P>0.05)，見圖2D。

注：與西藏小型豬比較，*P<0.05，**P<0.01；與巴馬小型豬比較，△P<0.05，△△P<0.01；與高脂飼喂前(0 h)比較，#P<0.05，##P<0.01. 圖2 單次飼喂高脂飼料三種品系小型豬血脂代謝的影響Note. compared with the Tibetan minipigs,*P<0.05,**P<0.01; compared with the Bama minipigs, △P<0.05,△△P<0.01; compared with that before fed with high fat diet (0 h),#P<0.05,##P<0.01.Fig.2 Effect of high-fat-diet feeding on lipid metabolism in the three stocks of minipigs

3 討論

疾病動物模型的建立和評價是研究和探討人類疾病病理機制和藥物干預的有效手段。近來，以高脂血癥為主的血脂代謝紊亂和脂質過氧化是動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要因素，其中血脂代謝紊亂主要表現(xiàn)為TC、LDL-C、TG水平升高或HDL-C水平降低[4]。最近Ridker P M[5]提出，餐后甘油三脂濃度的可變性，正是反映了個體代謝水平的相關信息，更能反映心血管疾病的風險，未來在冠心病患者中有必要進行脂耐量試驗，評價其血脂的耐受情況。但目前對于脂耐量試驗的相關研究甚少，包括動物實驗[6]。因此，開展脂耐量試驗相關方法學的研究，有助于篩選和評價機體對脂質代謝的耐受情況，對于疾病的預防具有重要的參考價值。

脂肪乳為復制大小鼠、兔等高脂血癥模型的誘導劑[7]。本研究在靜脈注射脂肪乳后，小型豬TG水平出現(xiàn)明顯的升高，而其它指標則未見明顯的改變。這與脂肪乳中主要含有甘油三酯、磷脂成分有關[8]。同時，注射脂肪乳后可見小型豬機體TG水平迅速在30 min內升高到峰值，在2.5 h后恢復到基礎水平。可見，脂肪乳對小型豬體內TG代謝反應敏感，有助于評估機體對甘油三酯水平的吸收利用情況，且其反應迅速、恢復時間快、是篩選TG水平敏感性較好的研究方法。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，注射脂肪乳后ΔTG曲線面積結果表明，相比巴馬小型豬，西藏小型豬和五指山小型豬對脂肪乳的耐受能力較差，其中西藏小型豬對甘油三酯的排泄能力最差，注射脂肪乳半小時后血清TG水平上升最高，且下降也較為緩慢。

高脂飲食在形成高脂血癥、動脈粥樣硬化、脂肪肝以及相關疾病并發(fā)癥等動物模型中是最常見和重要的誘導劑。本研究結果表明，單次飼喂高脂飼料后小型豬體內血脂代謝水平均出現(xiàn)明顯的升高，其中膽固醇指標在誘導12 h后即可升高，(24 h～72)h時出現(xiàn)顯著性變化，72 h后逐漸下降，并至120 h后恢復到基礎水平，而HDL-C成分的升高可能與TC整體水平的升高有關。同時，發(fā)現(xiàn)五指山小型豬的循環(huán)中膽固醇代謝指標曲線下面積最高，西藏小型豬則最低，同樣本結果也發(fā)現(xiàn)，高脂飲食后3種小型豬機體TG水平的升高，其中巴馬小型豬和西藏小型豬升高相對迅速，五指山升高相對緩慢，但ΔTG曲線下面積也證實西藏小型豬最高，巴馬小型豬較低，這與本試驗注射脂肪乳的反應結果較為一致。

綜合上述結果，注射脂肪乳和飼喂高脂飼料均可觀察到小型豬脂質耐受性的變化，其中脂肪乳側重于反映TG水平的變化，高脂飲食則可同時反映TG和TC的變化，兩種方式均可用于評估小型豬脂質代謝反應的敏感性。但是，不同品系的小型豬對脂質敏感性存在明顯的差異，其中，靜脈注射脂肪乳3種小型豬對TG敏感，TG脂耐量值高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬；高脂飼料飼喂對3種小型豬TC、LDL-C、HDL-C敏感，脂耐量值高低依次為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬。因此，在選擇小型豬時，可根據實驗要求和目的進行選擇。

[1] 張慶國. 血脂異常的藥物治療進展 [J]. 臨床進展，2011，23(5): 5-6.

[2] Svendsen O. The minipig in toxicology [J]. Exp Toxicol Pathol, 2006, 57: 335-339.

[3] Kawaguchi H, Miyoshi N, Miura N, et al. Microminipig, a non-rodent experiment animal optimized for life science research: novel atherosclerosis model induced by high fat and cholesterol diet [J]. J Pharmacol Sci, 2011, 115(2): 115-121.

[4] 王特，劉運海. Ox-LDL與動脈粥樣硬化的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥指南，2011，9(29): 230-231.

[5] Ridker PM. Fasting versus nonfasting triglycerides and the prediction of cardiovascular risk: do we need to revisit the oral triglyceride tolerance test？ [J]. Clin Chem, 2008, 54(1): 11-13.

[6] 王宇輝，劉國慶. 膽固醇和甘油三酯代謝紊亂與代謝性心血管病的研究進展 [J]. 中國醫(yī)學前沿雜志，2012，4(8): 19-22.

[7] 韓榮，王茜，張海英，等. 阿魏膠囊對高脂血癥大鼠及家兔的預防作用 [J]. 北京中醫(yī)藥大學學報, 2009, 32(3): 174-177.

[8] 陳潔. 脂肪乳的特點及臨床應用 [J]. 中國醫(yī)學創(chuàng)新, 2012, 9(4): 158-161.

Observation on the sensitivity of Wuzhishan, Tibetan and Bama minipigs to exogenous fats

CHEN Liang, PAN Yong-ming, ZHU Ke-yan, XU Xiao-ping, XU Jian-qin, CHEN Min-li

(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To observe the sensitivity of Wuzhishan, Tibetan and Bama minipigs to exogenous fats. Methods A total of 15 male minipigs including 5 WZS minipigs, 5 Tibetan minipigs and 5 Bama minipigs, were used in this study. The minipigs were intravenously injected with fat emulsion and fed with high-fat diet, and the changes of serum total cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL-C), high density lipoprotein (HDL-C) and triglyceride (TG) levels were detected at 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h and 3 h after intravenous injection of fat emulsion and at 3 h and 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h, 72 h and 84 h after fed with high-fat diet, respectively, and calculated the changes of area under the curve (ΔAUC) values. Results The triglyceride (TG) in the three kinds minipigs were significantly increased (P<0.01), and reached a peak at 0.5 h after injection. The degree of elevation of ΔAUC values were different showing on increasing order: Tibetan minipig > Wuzhishan minipig > Bama minipig, while TC, LDL-C and HDL-C showed no significant changes (P>0.05). Moreover, TC, LDL-C, HDL-C and TG were significantly increased in the three stocks of minipigs induced by feeding with high-fat diet (P<0.05,P<0.01). Among them, the TC and LDL-C of Wuzhishan minipigs peaked at 36 h, HDL-C peaked at 48 h and TG peaked at 24 h after feeding, respectively. TC, LDL-C and HDL-C in the Bama minipigs and Tibetan minipigs peaked at 48-60 h and TG peaked at 36 h after feeding, and the ΔAUC values of TC, LDL-C and HDL-C were in an increasing order of Wuzhishan minipigs > Bama minipigs > Tibetan minipigs. Conclusions The three stocks of minipigs are sensitive to TG after intravenous injection of fat emulsion, and the lipid tolerance values are in an order of Tibetan minipig > Wuzhishan minipigs > Bama minipigs. Meanwhile, the three stocks of minipigs are also sensitive to TC, LDL-C and HDL-C after feeding with high-fat diet, and the lipid tolerance values are in an increasing order of Wuzhishan minipig > Bama minipigs > Tibetan minipigs.

Minipig; Blood lipid metabolism; Lipid tolerance; Sensitivity

浙江省科技廳實驗動物科技計劃項目(2012C37078)，浙江中醫(yī)藥大學比較醫(yī)學創(chuàng)新團隊(XTD201301)。

陳亮(1982-)，男，助理研究員，研究方向為實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail: chl810@foxmail.com。

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向為實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail: cmli991@ aliyun.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0012-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.003

2016-12-27