實驗樹鼩空腸彎曲菌、沙門氏菌和志賀菌多重?zé)晒舛縋CR方法的建立

馮育芳，王莎莎，邢 進，付 瑞，鞏 薇，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

實驗樹鼩空腸彎曲菌、沙門氏菌和志賀菌多重?zé)晒舛縋CR方法的建立

馮育芳，王莎莎，邢 進，付 瑞，鞏 薇，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

目的 為實驗樹鼩微生物檢測提供一種快速、簡便、靈敏，并且特異性強的空腸彎曲菌、沙門氏菌和志賀菌多重?zé)晒舛縋CR檢測方法。方法 根據(jù)空腸彎曲菌的HipO區(qū)域、沙門菌的inV區(qū)域和志賀菌的ipaH區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，并進行單病原定量PCR檢測驗證；后分析多重PCR的靈敏度和特異性，并使用該多重PCR方法檢測實驗樹鼩樣品。結(jié)果 本研究的PCR要素可用于空腸彎曲菌、沙門氏菌及志賀菌等單種菌的實時熒光定量PCR擴增。多重定量PCR擴增出了空腸彎曲菌、沙門氏菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線；該方法的靈敏度為1×103ng/μL；特異性檢測未從其他參考菌株中檢出陽性。結(jié)論 該多重定量PCR方法在實驗樹鼩微生物檢測中具有很好的應(yīng)用和推廣前景。

實驗樹鼩；空腸彎曲菌；沙門氏菌；志賀菌；多重定量PCR；

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)，是彎曲桿菌屬的一種，是近十年來受到國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病原菌[1]。沙門氏菌(Salmonella)也是一種在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的，常見的人畜共患病的病原菌，廣泛分布于自然界[2]。志賀氏菌(Shigella)是人類細(xì)菌性痢疾的病原體，主要引起急性直腸結(jié)腸炎和痢疾[3]?？諒?、沙門和志賀均屬于腸道病原菌，對人和動物都可以致病，引起的癥狀也很類似，三種菌都可引起急性腸炎和食物中毒癥狀[4]，為實驗動物需要排除的病原體。

樹鼩作為新型的實驗動物，來源于自然環(huán)境，其實驗動物化首先要排除人獸共患病[5]，如空彎、沙門和志賀等腸道病原菌。為了提高日常檢測的效率，適應(yīng)送檢單位的需求，滿足國際交流與合作的需要，急需建立同時檢測這三種菌的多重PCR方法，為保證實驗動物微生物檢測質(zhì)量提供技術(shù)支撐。同時，為了提高檢測方法的靈敏度和特異性，本研究擬建立多重?zé)晒舛縋CR方法，用于實驗樹鼩空腸彎曲桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：本實驗所用菌種、編號及來源見表1。

1.1.2 樣本：隨機抽取了56份樹鼩腸道樣本，全部進行了沙門、志賀和空彎菌的檢測。

1.1.3 引物：根據(jù)沙門氏菌的inV區(qū)域、志賀菌的ipaH區(qū)域和空腸彎曲菌的HipO區(qū)域，分別設(shè)計了探針和引物，序列見表2

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品：根據(jù)3種菌的特異基因序列，由Takara公司進行質(zhì)粒制備，將制備的質(zhì)粒作為本實驗的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.5 所用試劑：Qiagen DNA提取試劑盒(51304，54161)購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司。OXIOD哥倫比亞血瓊脂(CM0031B)、OXIOD胰蛋白胨大豆瓊脂(CM00131B)、胰蛋白胨大豆肉湯(CM0129B)、BD公司SS瓊脂(212118)、OXIOD XLD培養(yǎng)基(CM0469B)以及添加劑(SR0109E)均購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司。Takara Probe qPCR Mix(RR391A)購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.1.6 儀器設(shè)備：所用PCR儀為美國ABI 7500 fast Real-Time PCR儀；微量分光光度計為美國Thermo Nanodrop 2000；自動核酸提取儀為德國Qiagen QIAcube；德國Hettich 22R冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 空彎、沙門和志賀菌的培養(yǎng)：參照國標(biāo)GB/T 14926.1-2001、GB/T 14926.47-2001和GB/T 14926.49-2001中的方法進行培養(yǎng)。

表1 實驗用菌株

表2 多重定量PCR實驗所用引物序列

1.2.2 模板DNA的提?。荷抽T菌、志賀菌和空彎菌等21株參考菌株用Qiagen DNA提取試劑盒，按照使用說明提取基因組DNA。經(jīng)微量分光光度計檢測，所提取的細(xì)菌DNA濃度均不低于50 ng/μL。

1.2.3 PCR體系和反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系為20.4 μL，包括：Mix 10 μL，Rox II 0.4 μL，沙門探針+引物1 μL，空彎、志賀引物及探針各1 μL，模板DNA 3 μL，見表3。94℃ 5 min；94℃ 30 sec，58℃ 30 min，72℃ 1.5 min，共35個循環(huán)；72℃ 7 min。

表3 PCR反應(yīng)體系

根據(jù)上述體系對待檢樣本DNA進行Real-Time PCR檢測，同時設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照和陰性對照。

反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；然后95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)延伸結(jié)束時進行熒光信號檢測。

1.2.4 特異性檢測：用所建立的Real-time PCR體系分別擴增肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嚙齒類檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、假結(jié)核耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等來檢測所建方法的特異性。

1.2.5 敏感性檢測：將合成的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度進行換算，得出質(zhì)粒的拷貝數(shù)均為1×1011copies/μL數(shù)量級，將1010copies/μL濃度的質(zhì)粒按1:1:1合并，并做10倍系列稀釋至101copies/μL，分別為1010copies/μL、109copies/μL、108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL，同時設(shè)置陰性對照，檢測所建方法的敏感性。

1.2.6 應(yīng)用：用所建立的real-time PCR檢測方法對樹鼩的56份糞便樣本進行檢測。

2 結(jié)果

為建立實驗樹鼩空腸彎曲菌、沙門氏菌和志賀菌多重定量PCR方法，首先需要分別設(shè)計針對3種細(xì)菌的PCR引物和探針，以及合適的PCR體系和擴增條件，為此，本研究首先分別設(shè)計了針對3種細(xì)菌的PCR引物和探針，并進行單細(xì)菌實時熒光定量PCR檢測，以檢測所有的定量PCR的實驗要素，包括引物對、探針、實驗體系及擴增條件等。

2.1 空腸彎曲菌TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法建立

本研究測試了針對空腸彎曲菌的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，該real-time PCR能有效地擴增空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)品，其檢測靈敏度下限為1×102copies/μL(圖1A)。該擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.391，相關(guān)系數(shù)為0.999，擴增效率為97.196%(圖1B)。用所建立的real-time PCR方法擴增表1中除空彎之外的12株菌，結(jié)果見圖1C，所測樣品均未見擴增，說明該體系特異性良好。此外，使用該方法對空腸彎曲菌進行了擴增，可得到特異性擴增，結(jié)果見圖1D。上述結(jié)果說明，本研究的實驗要素可用于空腸彎曲菌的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR擴增。

2.2 沙門氏菌TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法建立

本研究測試了針對沙門氏菌的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，該real-time PCR能有效地擴增沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品，其檢測靈敏度下限為1×102copies/μL(圖2A)。該擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.39，相關(guān)系數(shù)為1，擴增效率為97.247%(圖2B)。用所建立的real-time PCR方法擴增表1中除沙門氏菌之外的12株菌，結(jié)果見圖2C，所測樣品均未見擴增，說明該體系特異性良好。此外，使用該方法對本實驗室的9株空腸彎曲菌進行了擴增，均可得到特異性擴增，只是菌株間載量存在差異，結(jié)果見圖2D。上述結(jié)果說明，本研究的實驗要素可用于沙門氏菌的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR擴增。

2 志賀菌TaqMan實時熒光定量PCR方法建立3

首先，本研究測試了針對志賀菌的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，該real-timePCR能有效地擴增志賀菌標(biāo)準(zhǔn)品，其檢測靈敏度下限為1×102copies/μL(圖3A)。該擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.316，相關(guān)系數(shù)為0.999，擴增效率為100.244%(圖3B)。用所建立的real-time PCR方法擴增表1中除沙門氏菌之外的11株菌，結(jié)果見圖3C，所測樣品均未見擴增，說明該體系特異性良好。此外，使用該方法對本實驗室的痢疾志賀菌和宋內(nèi)志賀菌進行了擴增，均可得到特異性擴增，只是菌株間載量存在差異，結(jié)果見圖3D。上述結(jié)果說明，本研究的實驗要素可用于志賀菌的TaqMan實時熒光定量PCR擴增。

A: 空腸彎曲菌Real-time PCR方法敏感性結(jié)果(圖中曲線上所標(biāo)數(shù)字的單位為copies/μL)；B: 空腸彎曲菌real-time PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線；C: 空腸彎曲菌real-time PCR方法特異性結(jié)果；D: 對空彎菌種擴增的結(jié)果圖1 圖1 空腸彎曲菌TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法建立A: Sensitivity of the real-time PCR for Campylobacter jejuni (copies/μL); B: Standard curve of the real-time PCR for Campylobacter jejuni; C: Specificity of the real-time PCR for Campylobacter jejuni; D: Results of amplification of the Campylobacter jejuni strainFig.1 Establishment of the TaqMan-MGB real-time PCR for Campylobacter jejuni.

4 三重TaqMan實時熒光定量PCR方法建立

在建立空彎、沙門及志賀菌單菌實時熒光定量PCR方法后，本研究把3種細(xì)菌引物和探針混合嘗試建立三重TaqMan實時熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，該real-time PCR能有效地擴增空彎、沙門及志賀菌標(biāo)準(zhǔn)品，其檢測靈敏度下限為1×103copies/μL(圖4A)。該擴增中空彎標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.387，相關(guān)系數(shù)為1，擴增效率為97.354%；沙門標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.263，相關(guān)系數(shù)為1，擴增效率為102.528%；志賀標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.294，相關(guān)系數(shù)為1，擴增效率為101.175%(圖4B)。用所建立的real-time PCR方法擴增表1中除空彎、沙門及志賀菌之外的9株菌，結(jié)果見圖4C，所測樣品均未見擴增，說明該體系特異性良好。上述結(jié)果說明，本研究成功建立三重TaqMan實時熒光定量PCR方法。

之后，用本實驗所建立的real-time PCR方法對56份樹鼩腸道樣本進行檢測，結(jié)果顯示，空彎有5份樣本陽性(空彎單重有7份陽性，培養(yǎng)有5份陽性)，志賀有4份樣本陽性(志賀單重有5份陽性，培養(yǎng)有4份陽性)，沙門檢測無陽性，結(jié)果見圖4D。本研究建立的三重TaqMan實時熒光定量PCR方法與經(jīng)典的細(xì)菌培養(yǎng)檢測法結(jié)果一致，說明本方法具有較好的靈敏性和特異性。

A: 沙門氏菌Real-time PCR方法敏感性結(jié)果(圖中曲線上所標(biāo)數(shù)字的單位為copies/μL)；B: 沙門氏菌Real-time PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線；C: 沙門氏菌Real-time PCR方法特異性結(jié)果；D: 對沙門氏菌種擴增的結(jié)果圖2 沙門氏菌TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法建立A: Sensitivity of the real-time PCR for Salmonella (copies/μL); B: Standard curve of the real-time PCR for Salmonella; C: Specificity of the real-time PCR for Salmonella; D: Results of amplification of the Salmonella speciesFig.2 Established of TaqMan-MGB real-time PCR for Salmonella.

A: 志賀菌real-time PCR方法敏感性結(jié)果(圖中曲線上所標(biāo)數(shù)字的單位為copies/μL)；B: 志賀菌real-time PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線；C: 志賀菌real-time PCR方法特異性結(jié)果；D: 對志賀菌種擴增的結(jié)果圖3 志賀菌TaqMan實時熒光定量PCR方法建立A: Sensitivity of the real-time PCR for Shigella (copies/μL); B: Standard curve of the real-time PCR for Shigella; C: Specificity of the real-time PCR for Shigella; D: Results of amplification of the Shigella speciesFig.3 Established of the TaqMan-MGB real-time PCR for Shigella.

5 結(jié)論

空腸彎曲桿菌主要可引起人體急性腸炎和食物中毒，并伴發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利綜合癥等免疫性損傷性疾病。也可引起動物流產(chǎn)不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎。沙門氏菌不僅能導(dǎo)致雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒、鼠傷寒、動物流產(chǎn)、死亡等，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎、感染性腹瀉和食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙門菌引起的中毒病例占首位或第二位。志賀氏菌是人類細(xì)菌性痢疾的病原體之一，主要引起急性直腸結(jié)腸炎和痢疾?？諒?、沙門和志賀均屬于腸道病原菌，對人和動物都可以致病，引起的癥狀也很類似，三種菌都可引起急性腸炎和食物中毒癥狀[6]。

唐夢君等人建立空腸彎曲桿菌PCR-ELISA檢測方法，用于家禽泄殖腔樣本的檢測[7]。陽成波等人先后建立基于SYBR Green I或TaqMan探針的real-time PCR定量檢測空腸彎曲桿菌[8, 9]。劉俊華等[10]人建立實時熒光PCR快速檢測食品中的空腸彎曲菌?？追钡碌萚11]人進行了沙門菌PCR快速檢測試劑盒的研制，并進行了初步應(yīng)用。鄭友限等人建立實時熒光定量PCR法用于沙門菌的檢驗，用鼠傷寒標(biāo)準(zhǔn)菌和60份食品樣本進行檢測方法的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗，并與常規(guī)法和科瑪嘉平板分離法做比較[12]。趙雪濤等人也建立了鑒定沙門菌的熒光定量PCR方法[12]。陳峰等人利用二聚體蝎型熒光探針法，建立檢測志賀菌的熒光定量PCR技術(shù)，可應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)管以及傳染病診斷等[13]。高春燕等人建立一種檢測志賀菌屬快速敏感的熒光定量PCR方法。

為方便快速檢測，也有部分聯(lián)合檢測方法的建立，如王晨等人建立了沙門菌和志賀菌二聯(lián)實時熒光PCR檢測方法，實驗結(jié)果與權(quán)威檢驗機構(gòu)的結(jié)果符合率達(dá)100%，適用于CDC體檢等同時對沙門菌和志賀菌的快速臨床檢測[14]。陳萍等人基于SYBR Green I染料建立沙門菌、志賀菌和金黃色葡萄球菌的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，該方法能快速、靈敏、特異檢出沙門菌、志賀菌和金黃色葡萄球菌。石曉路等[15]人建立改良分子信標(biāo)-多重實時PCR同時檢測沙門菌和志賀菌的快速方法，應(yīng)用于食源性致病菌的快速診斷。于新芬等[16]人建立多重實時熒光 PCR 檢測沙門菌侵襲蛋白A 基因(invA)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)不耐熱腸毒素基因(elt)、志賀菌和腸侵襲性大腸埃希菌侵襲力基因(ipaH)的方法，可用于臨床腹瀉糞便標(biāo)本的快速篩檢。但未見空彎、沙門和志賀三種腸道病原菌的熒光定量PCR檢測方法的建立，而且上述檢測都是針對臨床樣品或食品檢測，與本研究針對的實驗樹鼩存在一定的差異。

本研究通過引物、探針的設(shè)計，及實驗體系、擴增條件的優(yōu)化，成功建立了沙門志賀空彎菌多重qPCR檢測方法，所建方法特異性良好，敏感性可以檢測到1×103copies/μL(與單重比低一個數(shù)量級)，而且特異性好，對非目標(biāo)菌株未見陽性擴增。并對該方法進行了初步的應(yīng)用，其中56份樹鼩樣本中空彎有5個陽性，志賀有4個陽性，沙門無陽性，與分離培養(yǎng)相比檢測結(jié)果完全一致，與單重?zé)晒舛勘嚷缘停嵌嘀乜梢怨?jié)省檢測試劑，節(jié)約檢測時間。因此，該多重PCR方法在實驗動物微生物檢測具有很好的應(yīng)用和推廣前景。

[1] 吳蜀豫, 張立實, 冉陸. 彎曲菌及彎曲菌病的流行現(xiàn)狀 [J]. 中國食品衛(wèi)生雜志， 2004, 16(1): 58-61.

[2] 賀奮義. 沙門氏菌的研究進展 [J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2006, 33(11): 91-95.

[3] 丁建強. 志賀氏菌屬感染若干方面的研究進展 [J]. 國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，1997, 24(2): 56-60.

[4] 劉新銘. 彎曲菌屬(Campylobacter)耶森氏菌屬、沙門氏菌屬和志賀氏菌屬引起的腸道傳染病[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進展，1981, 9(1): 61-65

[5] 沈培清, 鄭紅, 劉汝文, 等. 中國樹鼩實驗動物化研究進展和展望 [J]. 動物學(xué)研究， 2011, 32(1): 109-114.

[6] 王傳清, 何磊燕, 王愛敏 等. 上海地區(qū)急性細(xì)菌性腸炎兒童中沙門菌彎曲菌及志賀菌感染臨床及分子流行病學(xué)研究 [D]. 中國臨床微生物學(xué)大會暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇， 2012.

[7] 唐夢君, 周生, 張小燕, 等. 空腸彎曲桿菌PCR-ELISA檢測方法的建立 [J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013, 35(3): 340-345.

[8] 陽成波, 蔣原, 黃克和, 等. 基于TaqMan探針的Real-time PCR定量檢測空腸彎曲桿菌 [J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2003, 25(3): 183-187.

[9] 陽成波, 蔣原, 黃克和, 等. 應(yīng)用SYBR Green I的Real-time PCR方法定量檢測空腸彎曲桿菌 [J]. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2003, 24(1): 74-78.

[10] 劉俊華, 張欣強, 陳守義, 等. 實時熒光PCR方法快速檢測空腸彎曲菌方法的建立 [J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2009, 9(7): 729-731.

[11] 孔繁德, 徐淑菲, 陳瓊, 等. 沙門菌PCR快速檢測試劑盒的研制與應(yīng)用 [J]. 中國獸醫(yī)科學(xué),2007, 37(2): 103-107.

[12] 鄭友限, 楊育紅, 陳培蓉, 等. TaqMan探針法實時熒光定量PCR快速檢測沙門菌的探討 [J]. 中國食品衛(wèi)生雜志,2006, 18(4): 311-313.

[13] 陳峰, 吳爾翔, 丁鎖順, 等. 二聚體蝎型探針熒光定量PCR快速檢測志賀菌方法的建立及初步應(yīng)用 [J]. 中國人獸共患病學(xué)報,2013, 29(9): 886-890.

[14] 王晨, 吳暉, 肖性龍, 等. 沙門菌和志賀菌二聯(lián)實時熒光定量PCR的臨床檢測應(yīng)用研究 [J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008, 18(7): 1397-1399.

[15] 石曉路, 扈慶華, 張佳峰, 等. 多重實時PCR快速同時檢測沙門菌和志賀菌 [J]. 中華流行病學(xué)雜志,2006, 27(12): 1053-1056.

[16] 于新芬, 潘勁草, 孟冬梅, 等. 多重實時PCR檢測沙門菌、志賀菌和致瀉性大腸埃希菌 [J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 41(6): 461-465.

Establishment of a multiplex real-time PCR method for quantitative detection ofCampylobacterjejuni,SalmonellaandShigellain tree shrews

FENG Yu-fang, WANG Sha-sha, XING Jin, FU Ru-in, GONG Wei, YUE Bing-fei

(Institute for Laboratory Animal Resources, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To establish a rapid, simple, sensitive, and specific multiplex real-time PCR method for quantitative detection ofCampylobacterjejuni,SalmonellaandShigellain tree shrews. Methods Specific primers and probes were designed, according to the HipO gene ofCampylobacterjejuni, inV gene ofSalmonellaand ipaH gene ofShigella. The primers were confirmed by single pathogen quantitative PCR, and the sensitivity and specificity of the multiplex PCR were analyzed. Finall, the samples of experimental tree shrews were detected by this multiplex PCR method. Results The PCR element of TaqMan-MGB real-time PCR assay was able to quantitatively amplify theCampylobacterjejuni,SalmonellaorShigella. Appropriate standard amplification curves ofCampylobacterjejuni,SalmonellaandShigellain the multiplex quantitative PCR were obtained. The sensitivity of this method was 1×103ng/μL. There was no false positive detection from other bacterial strains. Conclusions This multiplex quantitative real-time PCR method has good application and development prospects in the detection of microorganisms in tree shrews.

Tree shrew;Campylobacterjejuni;Salmonella;Shigella; Multiplex Real-time PCR, Quantitative detection

國家科技支撐計劃項目(編號：2014BAI01B01)。

馮育芳(1981-)，女，碩士，副研究員，研究方向：實驗動物細(xì)菌學(xué)。E-mail: fyf307@126.com。

岳秉飛(1960-)，男，博士，研究員，研究方向：實驗動物遺傳學(xué)。E-mail: y6784@126.com。

技術(shù)方法

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0056-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.012

2016-11-29