右美托咪定鞘內注射對慢性神經痛模型大鼠行為能力、疼痛程度和脊髓背角蛋白激酶C表達的影響

孫 虎， 張 亮， 徐志新

(1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科， 海口 570311；2. 廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院麻醉科， 廣州 511447)

右美托咪定鞘內注射對慢性神經痛模型大鼠行為能力、疼痛程度和脊髓背角蛋白激酶C表達的影響

孫 虎1， 張 亮2， 徐志新1

(1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科， ?？?570311；2. 廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院麻醉科， 廣州 511447)

目的 分析右美托咪定鞘內注射對于慢性神經痛模型鼠的行為、疼痛程度脊髓背角蛋白激酶C (protein kinase C，即PKC)的影響，初步探討右美托咪定的鎮(zhèn)痛機制。方法 將50只成功建立模型的大鼠隨機分為觀察組、模型組，另選取25只健康大鼠作為對照組，觀察組和模型組大鼠建立慢性坐骨神經損傷模型，在建模后，觀察組應用右美托咪定鞘內注射干預，模型組應用生理鹽水注射，對照組不接受干預，在建模前、給藥后3、5、7、14 d時分別進行行為能力評價(累積評分法和運動功能評價)和疼痛程度評價 (機械性縮足反射法和熱縮足反射潛伏期法檢測痛閾值)，同時進行PKC免疫染色評分 (免疫組化SABC法)、PKCmRNA檢測(RT-PCR法)和PKC蛋白(Western blot法)表達，利用統(tǒng)計方法分析組間數據。結果 (1)建模前，各組大鼠行為累積評分、運動功能評分、機械性縮足反射法(MWT)、熱縮足反射潛伏期法(TWL)差異無顯著性 (P>0.05)，在建模后，模型組和觀察組大鼠累積評分和運動功能評分顯著升高，MWT和TWL明顯下降，其中觀察組變化幅度顯著低于模型組，建模后，組間累積評分、運動功能評分、MWT、TWL具有明顯差異(P<0.05)；(2)對照組PKC為陰性表達，模型組PKC呈強陽性表達，觀察組建模后初期PKC為強陽性，隨著治療時間延長，PKC表達強度降低，第14天時PKC為弱陽性表達；(3)建模后，觀察組和模型組PKCmRNA和PKC蛋白表達水平顯著高于對照組 (P<0.05)；隨著不斷給藥，觀察組PKCmRNA和PKC下降，在給藥14 d時，PKCmRNA和PKC接近對照組，建模后3 d起，在相同時間點，觀察組PKC表達量顯著低于模型組(P<0.05)。結論 右美托咪定鞘內注射能夠改善慢性神經痛模型大鼠行為能力、降低疼痛程度，可能與其抑制脊髓背角蛋白激酶 C 的表達相關。

鞘內注射；右美托咪定；慢性神經痛；脊髓背角蛋白激酶C

脊髓背角蛋白激酶C(protein kinase C)(PKC)作為細胞內重要信號轉導分子，在細胞中分布極為廣泛，由于組成PKC的同工酶在生物學功能有一定的差異性，因此，PKC的生物學功能極為復雜。近年來，隨著PKC研究的不斷深入，普遍認為[1，2]PKC可能與機體痛敏具有一定關聯，其能夠通過干預激素表達、調節(jié)傳到疼痛活性參與疼痛發(fā)病機制。右美托咪啶作為新型鎮(zhèn)痛藥物，臨床實踐雖然證實了其對于慢性神經痛具有高效鎮(zhèn)痛效果，但是相關作用機制的研究卻十分少見。因此，本實驗通過對不同干預下慢性神經痛模型大鼠的行為能力、痛閾值、PKC表達進行觀察分析，旨在初步確定右美托咪定的鎮(zhèn)痛機制及其對PKC的干預效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物選擇和分組

選取健康清潔級成年雄性SD大鼠，體重(200～250)g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物生產許可證號【SCXK(粵)2013-0034】，使用許可證號【SYXK(粵)2010-0104】，適應性飼養(yǎng)(自由進食、溫度22℃～25℃，濕度55%左右，晝夜比為1∶1) 7 d后，根據隨機原則，選取25只正常對照組不接受任何干預，在建模后將建模成功大鼠隨機選取50只分為2組，每組各25只，模型組和觀察組均需建立慢性神經痛模型并在建模后給予相應干預措施。各組間在鼠齡、體質量、飼養(yǎng)條件方面均無明顯差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器

Invitrogen公司生產的Trizol試劑；Takara 公司生產的SYB PremixTMII 試劑盒、購自于北京海誠遠宏公司的RIPA蛋白裂解液；美國Sigma公司生產的PKC 單克隆抗體(一抗和二抗)；購自于天津灝洋公司的免疫組化LAB-SA試劑盒和DAB顯色劑(濃縮型); 意大利IITC Life Science Inc 公司制造的l2390 Series von Frey測痛儀；中國醫(yī)學科學院設計制造的熱痛刺激儀(型號為BME-410A)；萊比信生物技術公司制造的石蠟切片機；GAPDH 內參和正反向引物序列合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3 建立慢性神經痛模型

依據臨床公認的Bennet法[3]建立慢性神經痛動物模型，具體步驟如下：經腹腔注射戊巴比妥鈉 (劑量為40 mg/kg)，麻醉起效后，以側臥位(術側在上)固定SD大鼠，常規(guī)消毒術區(qū)，距離股骨下1 cm處沿著股骨走形切開皮膚，通過股二頭肌的肌肉間隙對肌組織進行鈍性分離以充分顯露術側坐骨神經，用玻璃鉤針緩慢、輕輕的分離將坐骨神經和周圍組織， 將坐骨神經主干分叉部位以前神經游離8 mm，并在神經起始點上2 mm位置利用 含鉻羊腸線將坐骨神經結扎(4道，每道相隔1 mm)，局部注射生理鹽水沖洗，將肌肉、筋膜、皮下組織、皮膚進行間斷縫合。為了避免人為因素感染，所有上述操作均由研究者一人獨立完成。實驗以小鼠出現縮足、舔尾等行為學疼痛陽性反應為建模成功標準。

1.4 鞘內注射

參照張世棟等[4]記錄的鞘內注射給藥方法對慢性神經痛模型大鼠進行鞘內置管給藥，所有建模成功的大鼠，在建模后2 h以吸入異氟烷麻醉滿意后，呈俯臥位擺放，觸摸到兩側髂棘，對術區(qū)進行備皮和消毒，選取L3與L4間隙作為切口位置，縱形切口長度為3 cm左右，鈍性分離肌肉組織，顯露示L3-L4的脊突間隙，利用25G 針刺穿黃韌帶和硬脊膜，待清亮液體(即腦脊液)流出后視為穿刺成功。將導管經硬脊膜口緩慢插入8 cm左右，將開口端固定在L1-L2，另一端經皮下隧道在頸背部引出，在外露出2 cm后將導管口夾閉并固定。待大鼠麻醉失效后，微量注射10 μL利多卡因，以10 s內雙肢出現無法負重、無逃避反應且在20 min可恢復為實驗成功。本實驗中未見脫管情況出現。

1.5 觀察指標及評價方法

在建模前、給藥后3 d、5 d、7 d、14 d時分別對各組SD大鼠的行為學效應進行評價，同時在各時間點每組分別處死5大鼠，進行PKC表達水平測定。

1.5.1 行為學能力評分：行為能力評價采用累積評分法(Cumulative scoring)和運動功能評分(Motor function score)進行。累積評分具體方法[5]為：根據大鼠的后爪著地和負重水平進行計分，其中后爪壓迫變白代表負重，采取0-2計分法，2分為后爪不著地且不負重；1分為后爪不負重但可著地；0分為后爪著地且負重，每5 min評鑒一次，將1 h內術側和檢測累積分數差即為最后的累積疼痛評分。運動功能評分依照Hwang法[6]： 0分為運動功能無改變，可以正常行走；1分為運動輕度受限，足底刺激可出現正?？s爪反應；2分為自主運動能力減低，中度運動受限，雖能正常行走，但是足底刺激縮爪反應減弱；3分為自主活動完全受限，無法行走，出現明顯的拖爪現象，足底刺激無反應。

1.5.2 痛閾值檢測： 機械性縮足反射法[7](即MWT)：將大鼠放置在金屬網格網上并蓋上透明有機玻璃罩，升高網格網，適應30 min后，在下方用纖維細絲垂直刺激大鼠的手術側的足底中部，不斷加大刺激力度，記錄大鼠出現抬腿、舔足行為情況是測痛儀顯示的數值，每只動物測5次(間隔60 s)，將取平均值作為最終結果。熱縮足反射潛伏期法[8](即TWL)：把老鼠放置在有機玻璃箱之中，將玻璃箱放置到玻璃板上，適應30 min后，通過儀器中的紅外線光束對大鼠術側足底中部進行照射，從開始照射計時，至大鼠表現出逃避性行為截止，熱刺激基礎強度設定10 s，自動切斷時間設定20 s，每只大鼠分測5次，間隔時間為5 min，將平均值作為結果。

1.5.3 PKC免疫染色： 獲取L5節(jié)段進行固定、石蠟包埋、切片等處理后，應用免疫組化SABC法進行組織染色處理，將PKC單克隆抗體作為一抗(配比為1:50)，將PBS作為陰性對照，利用電子顯微鏡和醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。在高倍鏡下(×200)抽取6個視野，分別計數PKC陽性細胞數(計數100個)，陽性者在胞漿內可見黃色或棕黃色顆粒，根據參照文獻[9]通過雙盲法，依照陽性細胞比(10%以下計0分，10%～30%計1分，31%～50%計2分，51%～70%計3分，70%以上計4分)和染色強度(未見黃色顆粒0分，黃色1分，深黃色2分，棕黃色3分)進行PKC免疫組化評分(二者相乘)，其中0分代表(-)，1～4分代表(+)，5～8分代表(++)，9～12分代表(+++)。

1.5.4 RT-PCR(實時定量PCR檢測)： 在各檢測點，分別提取大鼠脊髓背角組織，通過液氮冷凍法進行碾磨之后，添加Trizol試劑進行總RNA提取，嚴格依照試劑盒完成反轉錄制取cDNA，添加SYBR green I，對組織PKC mRNA進行RT-PCR檢測。

1.5.5 Western blot：取新鮮脊髓背角組織，無需固定處理，直接進行冷凍碾磨，添加蛋白裂解液，高速離心去除沉淀，高溫煮10 min完成蛋白質變性，接受電泳、轉膜、封閉處理后，添加PKC一抗(配比1:500)在 4℃環(huán)境中孵育12 h，取出后添加二抗(配比為1:2000)，在室溫下再次孵育45 min，利用TBS進行洗膜，添加ECL進行化學發(fā)光。內參為Tubulin (配比為1:1000)。

1.6 統(tǒng)計學方法

雙輸入方法建立實驗電子數據信息，利用SPSS 19.0統(tǒng)計程序完成數據分析，方差檢驗齊性后，組間計量資料比較為單因素方差分析，組內前后比較為配對t檢驗，若P<0.05，則差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組間行為學能力評分和痛閾值比較

建模前，各組大鼠的行為學評價指標差異無顯著性 (P>0.05)，在建模后，模型組和觀察組大鼠的行為能力顯著降低，且模型組大鼠的行為能力破壞更為嚴重，組間累積評分、運動功能評分、MWT、TWL差異顯著(P<0.05)，(表1)。

2.2 三組PKC免疫染色結果

建模前，各組均未見明顯的PKC陽性表達，且對照組的神經元細胞在實驗無明顯變化，PKC陽性細胞極少，為陰性表達，模型組在建模后，細胞內可見大量棕黃色顆粒，PKC呈強陽性表達，觀察組在建模后雖然PKC同樣為強陽性，但是隨著治療時間遞增，表達強度不斷降低，在第14 天時轉變?yōu)槿蹶栃员磉_，與模型組PKC表達強度差異具有顯著性 (P<0.05)。詳見圖1和表2。

A：對照組3 d;B：模型組3 d; C：觀察組3 d; D：對照組14 d; E：模型組14 d; F：觀察組14 d(200×,標尺=10 μm)圖1 PKC免疫染色結果A:Group C 3 d.B:Group M 3 d.C:Group O 3 d. D:Group C 14 d. E:Group M 14 d. F:Group O 14 d(200×,Bar=10μm) Fig.1 Expression of PKC in the brain tissues in the groups of Immunohistochemical staining

2.3 三組PKC表達水平比較

對照組可檢測到極少量PKC蛋白表達，觀察組和模型組在建模后，PKC表達水平顯著升高，與對照組相比，差異明顯(P<0.05)；但是，隨著不斷的給藥，觀察組的PKC表達量不斷下降，且在給藥14 d時，PKC表達量降至接近對照組水平，在相同時間點(給藥3 d之后)，觀察組PKC表達量顯著低于模型組(P<0.05)。詳見表3，圖2，圖3。

表1 組間行為學評價結果比較

Tab.1 Comparison of behavioral evaluation results between the groups

組別Groups建模時間Time累積評分(分)Cumulativescoring(score)運動功能(分)Motorfunction(score)機械性縮足反射(g)MWT(g)熱縮足反射潛伏期(s)TWL(s)對照組建模前Beforemodeling0014.52±1.1227.32±2.26GroupC給藥后3d(D3)0014.38±1.0928.42±2.32給藥后5d(D5)0014.63±1.1127.95±2.37給藥后7d(D7)0014.71±1.1428.16±2.41給藥后14d(D14)0014.61±1.1328.37±2.59模型組建模前(BM)005.25±1.3627.15±2.31GroupM給藥后3d(D3)4.21±1.05ac2.85±1.13ac4.63±1.29ac14.59±2.64ac給藥后5d(D5)4.02±1.02ac2.62±1.21ac4.74±1.32ac13.57±2.58ac給藥后7d(D7)3.37±1.03ac2.59±0.99ac4.59±1.31ac12.62±2.57ac給藥后14d(D14)3.41±1.01ac2.24±1.10ac4.62±1.28ac11.95±2.71ac觀察組建模前(BM)0014.59±1.3027.34±2.28GroupO給藥后3d(D3)3.31±1.02abc2.15±1.14abc10.12±1.21abc17.62±2.54abc給藥后5d(D5)2.55±0.89abc1.72±1.20abc9.69±1.23abc19.57±2.69abc給藥后7d(D7)2.03±0.88abc1.59±0.98abc8.03±1.18abc20.87±2.82abc給藥后14d(D14)1.19±0.86abc0.94±0.62abc7.11±1.16abc21.63±2.72abc

注：相同點，與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與組內建模前比較，cP<0.05。

Note. The same time points, compared with the control group,aP<0.05; compared with the model group,bP<0.05； compared with the same group before modeling,cP<0.05.

表2 三組免疫PKC免疫組化評分比較

注：相同點，與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與組內建模前比較，cP<0.05。

Note. The same time points, compared with the control group,aP<0.05; compared with the model group,bP<0.05；compared with the same group before modeling,cP<0.05.

表3 三組PKC表達量比較

注：相同點，與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與組內建模前比較，cP<0.05。

Note. The same time points, compared with the control group,aP<0.05; compared with the model group,bP<0.05；compared with the same group before modeling,cP<0.05.

圖2 各組PKC mRNA表達水平比較Fig.2 Comparison of PKC mRNA expression levels in the 3 groups

圖3 各組PKC蛋白的Western blot檢測結果Fig.3 Western blotting results of PKC protein in the different groups

3 討論

PKC作為磷脂依賴性重要酶類，能夠被Ca2+活化，活化后的PKC能夠參與細胞增殖、凋亡、骨架蛋白重塑、離子通道調節(jié)等多種生物學效應[10，11]。PKC在中樞神經傳導通路中具有第二信使的作用，刺激信號經過活性NMDA受體能夠開啟Ca2+通道，導致Ca2+在細胞內不斷聚集增多，PKC受控區(qū)域與Ca2+結合后其構象發(fā)生轉變而啟動催化區(qū)，從而PKC活性被激活，此外有害神經刺激能夠刺激P物質釋放，激活脊髓髓背角NK1受體進而PLC(磷脂酶C)的活性，而活化后的PLC能夠通過對膜磷脂進行水解而釋放DAG (即二酰甘油)，而DAG是公認的PKC活化因子，因此，在神經遭受有害刺激后，體內PKC能夠通過多種途徑被活化，而活性PKC能夠導致NMDAR等鈣調節(jié)蛋白發(fā)生磷酸化，從而導致脊髓可塑性轉變，增加中樞敏感性。國內學者楊勇等[9]銅鼓實驗發(fā)現PKC陽性細胞主要分布于脊髓背角淺層，其能夠參與中樞傷害信號傳遞，參與中樞敏感化機制。

右美托咪定作為臨床常用的鎮(zhèn)痛藥物，其能夠通過增強信號轉導通路的背角神經元抑制作用、抑制鈣內流、減少神經遞質釋放等發(fā)揮生物效應。國內實驗發(fā)現右美托咪定能夠抑制脊髓背角處神經元的凋亡程度，影響神經性疼痛的痛敏機制[12]。但是目前關于PKC表達在慢性神經痛中的臨床價值研究以及右美托咪定對于神經痛PKC影響的研究仍然十分少見，相關生物學機制更是存有較大空白。本實驗中，在利用坐骨神經損傷法建立慢性神經痛模型后，通過對不同干預方法下，各組大鼠的行為學效應進行觀察發(fā)現，模型組和觀察組的運動功能評分、累積疼痛評分顯著高于對照組，MWT痛閾值、TWL痛閾值結果均顯著低于對照組，說明與對照組相比，慢性神經痛模型大鼠均出現中樞痛敏化效應，其已經形成痛覺超敏，進一步對比模型組和觀察組數據顯示，觀察組行為學效應異常情況顯著輕與模型組，說明右美托咪定對于痛敏效應形成能夠產生一定的抑制作用。利用現代化研究技術對脊髓PKC進行檢測，發(fā)現對照組僅有極少量PKC陽性細胞存在，其PKC mRNA相對表達量和PKC蛋白表達水平顯著低于其他兩組，說明在正常生理情況下，脊髓內PKC含量極低，但是當發(fā)生神經損傷后，脊髓內PKC含量顯著升高，在脊髓背角處呈明顯的陽性表達，表明PKC不僅參與了神經損傷、疼痛信息的傳遞過程，而且可能參與痛敏形成過程，對疼痛敏感性具有重要影響。此外，本實驗結果還顯示，觀察組PKC陽性表達強度、PKC mRNA、PKC蛋白水平顯著低于對照組，且上述指標的表達水平隨著右美托咪定使用時間增加而降低，說明右美托咪定對于PKC形成具有顯著的抑制作用，其可能通過抑制PKC釋放發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。PKC在動物體內具有12種亞型，每種亞型的功能、結構也不盡相同，本實驗雖然證實了PKC參與了慢性神經痛病理機制，但是尚未設計PKC不同亞型表達水平、作用效應的研究，且觀察時間有限，對于右美托咪定對于慢性神經痛遠期干預效果未進行分析總結，實驗仍存在一定缺陷，需要進一步改進和深入研究?？偠灾?，PKC參與了慢性神經痛痛敏形成過程，是對于慢性神經痛發(fā)病機制具有重要影響，右美托咪定作為常用鎮(zhèn)痛藥物，經鞘內注射給藥能夠減輕慢性神經痛痛敏程度，其鎮(zhèn)痛機制可能為抑制脊髓背角PKC表達。

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Effect of intrathecal injection of dexmedetomidine on the behavioral activity, pain degree and expression of protein kinase C in the spinal dorsal horn in rat models of chronic neuropathic pain

SUN Hu1,ZHANG Liang2,XU Zhi-xin1

(1.Depatment of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570311, China； 2. Department of Anesthesiology, Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 511447)

Objective To analyze the effect of intrathecal injection of dexmedetomidine on the behavioral activity, pain degree and expression of protein kinase C in spinal dorsal horn of rat models of chronic neuropathic pain, and to investigate the analgesic mechanism of dexmedetomidine. Methods 75 healthy male rats were randomly divided into observation group, model group and control group, 25 rats in each group. Chronic sciatic nerve injury model was established in the observation group and model group. After modeling, intrathecal dexmedetomidine intervention was used in the observation group. The model group was treated with saline injection and there was no intervention in the control group. Before the modeling (BM)and at 3(D3), 5(D5), 7(D7), and 14 (D14)days after medicine administration, the behavioral capacity was evaluated by cumulative evaluation method and movement function evaluation, and the assessment of pain degree (mechanical withdrawal method and thermal withdrawal latency pain threshold detection method), PKC staining score (immunohistochemical SABC method), PKC mRNA assay (RT-PCR method) and PKC protein expression (Western blot) were conducted and the data were statistically analyzed. Results ① Before modeling, the behavior, the cumulative scores of motor function, MWT, and TWL showed no significant differences between the different groups (P>0.05). After modeling, the model group and observation group showed that the cumulative scores and motor function scores were increased significantly, MWT and TWL decreased significantly, and the changes in the observation group were significantly lower than those in the model group (P<0.05). After modeling, the cumulative scores, motor function scores, MWT, and TWL were significantly different between the groups (P<0.05). ② The expression of PKC was negative in the control group and positive in the model group. In the observation group, after the initial establishment of model, the PKC was strongly positive, and along with the prolonged treatment, the PKC expression intensity was decreased, and only weakly positively expressed at 14 d. ③ After modeling, the observation group and model group showed that the PKC mRNA and PKC protein expression levels were significantly higher than that of the control group (P<0.05). With the continuous drug administration, the PKC mRNA and PKC in the observation group were decreasing, and reached a level close to that of the control group at 14 d of drug administration. From the third day after modeling, at the same time points, the amount of PKC expression in the observation group was significantly lower than that in the model group (P<0.05). Conclusions Intrathecal injection of dexmedetomidine can improve the behavior of rat models with chronic neuropathic pain, and reduce the degree of pain. It may be related to the inhibition of protein kinase C expression in the spinal dorsal horn.

Dexmedetomidine; Intrathecal injection; Chronic neuropathic pain; Spinal dorsal horn; Protein kinase C; Sprague-Dawley rats

孫虎(1980-)，男，主要研究方向：臨床麻醉與疼痛治療，E-mail： sunhu09@163.com。

徐志新(1963-)，男，博士研究生，主任醫(yī)師，麻醉學教授,碩士生導師。E-mail： droxuzhixin@tom.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0006-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.002

2016-11-23