鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型的建立及表型分析

韋榮飛，李夢媛，徐大模，高 苒

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型的建立及表型分析

韋榮飛，李夢媛，徐大模，高 苒

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

目的 建立鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型。方法 先用5% NaHCO3溶液灌胃，中和部分胃酸，提高鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium的感染能力，隨后進行鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium灌胃攻毒。觀察小鼠的臨床癥狀，對小鼠的生存情況及體重進行統(tǒng)計學分析，并通過組織病理切片分析小鼠腸道組織病理變化等。結果 鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium攻毒后C57BL/6小鼠出現(xiàn)體重下降、萎靡不振、寒顫及死亡等表型，解剖學水平顯示小鼠腸道充血膨脹。病理分析結果顯示小鼠小腸絨毛間質水腫、腸粘膜層壞死及炎性細胞浸潤等。結論 成功建立鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型，該模型在研究相關免疫分子或細胞因子在S.Typhimurium引發(fā)腸炎過程中的生物學功能及治療等方面具有重要的科學意義。

腸道感染；S.Typhimurium；C57BL/6；組織病理

鼠傷寒沙門氏菌是一種能夠感染多種宿主的革蘭氏陰性病原體，能夠躲避宿主的天然免疫系統(tǒng)，在宿主體內(nèi)進行復制并引發(fā)疾病[1]。鼠傷寒沙門氏菌感染畜禽造成巨大的經(jīng)濟損失，同時嚴重威脅人類健康，沙門氏菌是經(jīng)食物傳播的疾病中主要的病原菌。鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium與沙門氏菌Paratyphi感染人類的途徑相似，S.Typhimurium感染能夠引起急性腸胃炎。目前，對于鼠傷寒沙門氏菌引發(fā)腸炎的發(fā)病機制及免疫、病理生理特征等方面的研究尚淺，需要構建合適的小鼠模型進行深入研究。然而，鼠傷寒沙門氏菌入侵小鼠體內(nèi)后可造成類似人類傷寒樣全身系統(tǒng)性感染，因此，構建鼠傷寒沙門氏菌急性感染模型將為研究沙門氏菌感染疾病的發(fā)病機制等提供便利。前期已有報道基于使用鏈霉素預處理方法建立鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型[2]，然而模型建立時間較長，容易導致腸道免疫系統(tǒng)損傷而影響實驗結果。本研究利用5% NaHCO3溶液灌胃中和胃酸從而減少胃酸對鼠傷寒沙門氏菌的影響，避免對腸道免疫系統(tǒng)的影響，同時增加了鼠傷寒沙門氏菌的感染活性，且有效縮短了建模周期。

利用S.Typhimurium建立C57BL/6小鼠腸道感染模型對于研究沙門氏菌病原體入侵宿主的作用機制和疾病治療，以及相關免疫調控分子在沙門氏菌感染過程中的免疫學功能及其C57BL/6轉基因小鼠在沙門氏菌感染引發(fā)疾病過程中的病理變化分析等具有重要的科學意義，同時也為抗沙門氏菌感染藥物的臨床前試驗提供保障[3-6]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及菌種：SPF級C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物實驗室【SYXK(京)2014-002】。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，S.Typhimurium)標準菌種為英國格拉斯哥大學惠贈。

1.1.2 主要試劑：胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂購自英國Oxiod公司，NaCl、NaHCO3購自國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精、伊紅購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PCNA抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)：鼠傷寒沙門氏菌劃線接種于固體無抗LB平板，37℃，過夜培養(yǎng)。隨后挑取單菌落培養(yǎng)于無抗液體LB培養(yǎng)基，37℃，過夜靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期后，5 000 r/min，10 min，離心收集菌體，用PBS緩沖液調節(jié)濃度至108cfu/mL，用于小鼠攻毒。

1.2.2 鼠傷寒沙門氏菌S.Typhimurium感染小鼠模型的建立: PBS組和實驗組各9只C57BL/6小鼠，鼠傷寒沙門氏菌攻毒前，每只小鼠灌胃5% NaHCO3溶液100 μL，中和胃酸后，采用PBS緩沖液調節(jié)濃度至108cfu/mL的鼠傷寒沙門氏菌，每只小鼠灌胃200 μL，對照組小鼠給予相同體積5% 的NaHCO3溶液和PBS緩沖液。正常條件飼養(yǎng)小鼠8 d。本研究相關實驗均在生物安全2級(P2，BSL-2)實驗室開展，IACUC批準號GR2016001。

1.2.3 動物表型分析：鼠傷寒沙門氏菌灌胃時(即0 d)和3 d后每天稱量小鼠體重并觀察小鼠的臨床癥狀和死亡情況。并解剖瀕臨死亡小鼠，觀察腸道病理形態(tài)，并進行石蠟切片和病理分析。

1.2.4 石蠟切片:組織固定：4%甲醛溶液固定48 h以上；酒精梯度脫水：70%、80%、90% Ⅰ、90% Ⅱ、95% Ⅰ、95% Ⅱ各20 min，100% Ⅰ、100% Ⅱ各15 min；透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min；浸蠟：蠟缸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各30 min；包埋：用包埋機操作，將組織包埋于蠟中，制成蠟塊；切片：調整適當厚度(5 μm)，切片機切片；經(jīng)攤片機攤片，后經(jīng)烤片機烤片，制成白片。

1.2.5 免疫組化:白片脫蠟：將白片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min；復水：100% Ⅰ、100% Ⅱ、95%、90%、80%、75%的酒精各放8 min；雙蒸水洗滌3次，每次2 min；3%的雙氧水去除內(nèi)源過氧化物酶15 min，注意避光；PBS洗3次，每次2 min；抗原修復：微波爐中高火將檸檬酸鹽修復液煮沸，將片子浸入煮沸的檸檬酸鹽修復液中，小火13 min，完畢后自然冷卻至室溫；蒸餾水洗1次，PBS洗3次，每次3 min；37℃，10%山羊血清封閉30 min；甩掉山羊血清，加PBS配制的PCNA抗體，4℃過夜；PBS洗3次，每次3 min；加二抗輔助劑，37℃，30 min；PBS洗3次，每次3 min；加辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃，30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，鏡下觀察；蒸餾水沖洗，蘇木素染核10～30 s，自來水沖洗2 min，酒精鹽酸分化5 s，自來水沖洗；脫水：70%、75%、80%、90%、95%、100%各2 min；透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各4 min；中性樹脂封片。

1.2.6 HE染色:按照免疫組化復水步驟將白片進行復水；雙蒸水洗滌3次，每次2 min；蘇木素染色2 min；自來水洗2 min；酒精鹽酸分化10 s；自來水洗2 min；伊紅染色2 min；自來水洗2 min；90%酒精1 min；100%酒精1 min；二甲苯I、II各4 min；中性樹脂封片。

2 結果

2.1 鼠沙門氏菌感染降低C57BL/6小鼠的生存率

200 μL濃度為107cfu/mL的鼠傷寒沙門氏菌攻擊C57BL/6小鼠3 d后，小鼠開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為萎靡不振、寒顫、被毛粗亂等；感染第4天，小鼠開始出現(xiàn)死亡，且8 d內(nèi)全部死亡(圖1)。對照組未見任何異常。

圖1 鼠傷寒沙門氏菌感染降低C57BL/6小鼠的生存率Fig.1 S. Typhimurium decreased the survival rate of the S. Typhimurium-uinfected C57BL/6 mice

2.2 鼠傷寒沙門氏菌感染導致C57BL/6小鼠的體重減少

從鼠傷寒沙門氏菌攻擊C57BL/6小鼠開始(第0天)直至第7天，對小鼠的體重進行統(tǒng)計學分析。結果如圖2所示，對照組在整個實驗過程中體重呈增加趨勢，而鼠傷寒沙門氏菌感染組小鼠體重逐漸減少。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌攻擊C57BL/6小鼠后小鼠的體重隨時間而減輕Fig.2 Loss of body weight of the S. Typhimurium-infected mice

2.3 病理形態(tài)分析結果

鼠傷寒沙門氏菌感染C57BL/6小鼠4或7 d后處死小鼠，體外分離小腸，觀察其形態(tài)變化，并對小腸進行石蠟切片和HE染色。病理組織學檢查結果顯示，鼠傷寒沙門氏菌感染后，腸道出現(xiàn)明顯的充血膨脹(圖3A)。與對照組相比(圖3B)，鼠傷寒沙門氏菌感染C57BL/6小鼠7 d后，小鼠小腸呈現(xiàn)明顯的局部腸粘膜層壞死(圖3C)，且腸絨毛間質水腫嚴重(圖3C和D)。此外，腸粘膜固有層炎性細胞浸潤及小腸腺上皮細胞點狀壞死等(圖3E)。

2.4 小鼠腸道細胞增殖檢測

利用PCNA抗體檢測鼠傷寒沙門氏菌感染C57BL/6小鼠后小腸腺上皮細胞的增殖情況。結果如圖4所示，與對照組相比(圖4A)，鼠傷寒沙門氏菌感染4 d后，小鼠小腸腺上皮細胞增殖明顯減少

注： A:S. Typhimurium感染4 d后小腸病理形態(tài)觀察；B:對照組(100×)；C和D:鼠傷寒沙門氏菌感染7 d(100×)；E圖為鼠傷寒沙門氏菌感染4 d(400×)，紅色箭頭指示炎性細胞。圖3 鼠傷寒沙門氏菌感染C57BL/6小鼠后小腸組織學及病理學分析結果Note. A. Small intestine of a normal control mouse (upper) and a mouse at 4 days after S. Typhimurium infection (lower). B. Histological changes in the intestine of a normal control mouse, ×100); C and D indicate the histological changes in the intestine of mice at 7 days after S. Typhimurium infection, ×100; E. indicates histological changes in the intestine of a mouse at 4 days after S. Typhimurium infection. The red arrows indicate inflammatory cell infiltration. ×400.Fig.3 Pathological changes in the intestine of S. Typhimurium-infected mice. HE staining 。

注： A圖為對照組(400×)；B圖為鼠傷寒沙門氏菌感染4 d(400×)。圖4 鼠傷寒沙門氏菌感染C57BL/6小鼠后小腸腺上皮細胞增殖減少Note. A: A control mouse. B: A mouse at 4 days after S. Typhimurium infection. Immunohistochemical staining with PCNA antibody. ×400.Fig.4 Proliferation of intestinal glandular epithelial cells is reduced in the C57BL/6 mice after S. Typhimurium infection.

3 討論

鼠傷寒沙門氏菌具有沙門氏菌的普遍特性，能夠引起諸多宿主特異性的感染性疾病，包括感染小鼠導致類似人類傷寒的系統(tǒng)性疾病[7]。鼠傷寒沙門氏菌是對人類健康產(chǎn)生威脅的重要傳染病源，其感染引起的沙門氏菌病對于人畜共患病的研究具有重要的意義[8]。

為更好地研究鼠傷寒沙門氏菌感染引起的疾病及后續(xù)研究相關免疫分子在沙門氏菌感染過程中的免疫學功能，我們成功構建了鼠傷寒沙門氏菌感染C57BL/6小鼠模型。為提高C57BL/6小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染的敏感性，鼠傷寒沙門氏菌攻毒前，先對小鼠進行5% NaHCO3溶液灌胃處理，中和部分胃酸。隨后，每只小鼠灌胃107cfu/mL的鼠傷寒沙門氏菌200 μL。統(tǒng)計分析小鼠的生存情況及體重變化情況。病理分析小腸組織結構變化及免疫組化分析小腸細胞增殖情況。我們發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌感染后，C57BL/6小鼠萎靡嗜睡，第4天開始出現(xiàn)死亡，且8 d內(nèi)全部死亡；小鼠體重逐漸減少；小腸絨毛間質水腫、腸粘膜層壞死及炎性細胞浸潤；小腸腺上皮細胞增殖減少等。該模型可為臨床研究奠定基礎，同時，該模型也可用于抗沙門氏菌藥物臨床前試驗藥效評價等。此外，本研究為基于相關免疫分子C57BL/6基因敲除或轉基因小鼠建立鼠傷寒沙門氏菌感染模型奠定了重要的基礎，對于研究相關免疫分子在鼠傷寒沙門氏菌感染過程中發(fā)揮的免疫生物學功能具有重要的科學意義和價值。

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Etablishment and phenotypic analysis of a C57BL/6 mouse model ofS.Typhimuriuminfection

WEI Rong-fei, LI Meng-yuan, XU Da-mo, GAO Ran

( Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To establish a C57BL/6 mouse model of intestinal infection induced byS.Typhimurium. Methods In order to improve the infectious sensitivity ofS.Typhimurium, C57BL/6 mice were intragastrically given 5% (w/v) NaHCO3.Then mice were challenged withS.Typhimurium. The health condition, survival and body weight of mice were observed from day 0 to day 7 after the bacterial infection. The pathological changes were also examined. Results the mice challenged withS.Typhimuriumshowed decreased body weight and typical clinical signs, including in appetence, piloerection and low survival rate. Macroscopic dissection revealed that intestinal hyperemia and swelling were founded in the mice challenged withS.Typhimurium. Histopathology showed intestinal epithelial and mucosal damages. Conclusions We have successfully established a C57BL/6 mouse model ofS.Typhimuriuminfection. This model may be of crucial significance for studying the biological functions of associated immunological molecules or cytokines in the process of inflammatory bowel disease induced byS.Typhimurium.

Intestinal infection;S.Typhimurium; C57BL/6 mouse; Histopathology

國家自然科學基金(81601375)，協(xié)和青年基金資助，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(3332016077)，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所基本科研業(yè)務費專項資助(2016ZX310033)。

韋榮飛(1990-)，女，助理研究員，研究方向：免疫與腫瘤。E-mail: weirongfei2010@163.com。

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤學、免疫學。E-mail: gaoran26@Hotmail.com。

研究報告

【文獻標識碼】 A 【文章編號】1671-7856(2017) 06-0033-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.007

2017-02-15