冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

韋 斌，王 強(qiáng)，姜 浩，朱志華，陳廣琴，尹 瑋，駱 虹

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

韋 斌1，王 強(qiáng)1，姜 浩2，朱志華1，陳廣琴1，尹 瑋1，駱 虹1

目的 觀察冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的病理變化，進(jìn)一步證實(shí)冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 將48只新西蘭大白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥對(duì)照組、冠通方大劑量組、冠通方中劑量組、冠通方小劑量組，每組各8只。各組分別連續(xù)灌胃14 d，制備左室心肌病理切片。比較各組病理切片在光鏡下心肌細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，使用原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)測(cè)定各組凋亡細(xì)胞指數(shù)。結(jié)果 冠通方大、中劑量組心肌細(xì)胞在光鏡下的結(jié)構(gòu)形態(tài)得到較好的保護(hù)，冠通方大、中劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組顯著下降(P<0.05)。結(jié)論 冠通方可以減輕心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞的損傷，有效減少心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

心肌缺血再灌注損傷；冠通方；機(jī)制研究

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是心臟缺血性病變?cè)偻ê蟪Ｒ?jiàn)的并發(fā)癥，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理等方面發(fā)生進(jìn)一步損傷，并可出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡基因的表達(dá)增高或心肌細(xì)胞凋亡。冠通方的近期藥理研究表明[1]：使用冠通方預(yù)處理可使缺血再灌注損傷(IRI)大鼠模型的損傷心肌組織中白細(xì)胞介素-8(IL-8)表達(dá)下降，白細(xì)胞介素-10(IL-10)表達(dá)增高，有效抑制炎癥機(jī)制及壞死機(jī)制，起保護(hù)心肌的作用。本研究通過(guò)后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量的冠通方干預(yù)兔心臟再灌注損傷后心肌細(xì)胞的凋亡及病理形態(tài)改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 48只新西蘭大白兔，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(桂)2011-0003]，體質(zhì)量2.5 kg～3 kg，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始分組。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 冠通方組成：田七45 g，生曬參100 g，丹參150 g，地龍150 g，全瓜蔞150 g，絞股藍(lán)150 g，麥冬150 g，陳皮100 g。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠按上述配方制成顆粒劑(每包含生藥4 g)，分裝規(guī)格為每包3.5 g。復(fù)方丹參滴丸(每粒27 mg)，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950111，生產(chǎn)批號(hào)101210)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒為德國(guó)Roche公司生產(chǎn)，-20 ℃保存，使用前置于4 ℃溶解混合；DAB顯色液試劑盒為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，4 ℃保存，使用前置于室溫與稀釋液以1∶25稀釋混合，現(xiàn)配現(xiàn)用；蛋白酶K溶液為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，-20 ℃保存，使用前置于4 ℃以1∶25稀釋?zhuān)F(xiàn)配現(xiàn)用；磷酸鹽緩沖液(PBS)為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)，粉劑-4 ℃保存，使用前置于37℃與蒸餾水0.01mol/L稀釋?zhuān)琾H為7.2～7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用；其余甲醛、酒精、二甲苯等均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，室溫避光密封保存。全自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)Leica，ASP300S)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica，RM2245)，奧林巴斯顯微鏡(日本OLYMPUS，BX53)，病理圖文攝像頭(日本OLYMPUS，DP73)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京智鼠多寶生物科技有限公司，DW-3000)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將48只新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥對(duì)照組[復(fù)方丹參滴丸54 mg/(kg·d)]、冠通方大劑量組[3.6 g/(kg·d)]、冠通方中劑量組[1.8 g/(kg·d)]、冠通方小劑量組[0.9 g/(kg·d)]，每組8只。用藥劑量根據(jù)人兔臨床用藥劑量換算公式[2]換算成兔用藥量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行分籠飼養(yǎng)，于每天早上灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組予蒸餾水灌胃。各組均連續(xù)灌胃14 d，于末次給藥1 h后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.4.2 模型建立 經(jīng)耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，背位固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離頸前肌，切開(kāi)氣管，插入Y型氣管插管， 連接微型人工呼吸機(jī)(潮氣量10 mL/kg～15 mL/kg，頻率40次/min)。沿胸骨左緣3～4肋間隙開(kāi)胸，暴露心臟。采用5～0線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)法制備心肌缺血再灌注模型，為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌梗死面積過(guò)大導(dǎo)致死亡，冠狀動(dòng)脈阻斷點(diǎn)應(yīng)在冠狀動(dòng)脈左前降支向下5 mm～10 mm處選擇結(jié)扎位點(diǎn)，以心電圖出現(xiàn)ST段弓背抬高和結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗、局部節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不良為結(jié)扎成功。待結(jié)扎40 min后剪斷手術(shù)線實(shí)現(xiàn)再灌注，灌注時(shí)間為2 h。以缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅并反應(yīng)性充血、收縮活動(dòng)逐漸恢復(fù)、ST段恢復(fù)1/2以上為再灌注成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余操作同上。

1.4.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.3.1 IRI心肌組織HE染色病理切片 造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，取左心室心肌(包括缺血邊緣區(qū)、心肌缺血區(qū)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎區(qū)心肌組織)。將標(biāo)本置于10%中性甲醛液中固定，經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水14 h，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行HE染色、封片，鏡下觀察心肌組織基本病理改變。

1.4.3.2 TUNEL法染色 參考羅氏TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用0.3%過(guò)氧化氫溶液封閉30 min；20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；加入TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育60 min；加入FITC標(biāo)記抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。

1.4.3.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)量 在光鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，電鏡下呈棕色顆粒者為染色陽(yáng)性的凋亡心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)觀察：每只兔子觀察4張切片，每張切片在高倍鏡下(400×)隨機(jī)觀察5個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)算凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞個(gè)數(shù)，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)的百分比為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌組織HE染色病理形態(tài)比較 假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯病理?yè)p傷。MIRI模型組心肌細(xì)胞質(zhì)增多，細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞排列紊亂、橫紋不清，并呈現(xiàn)點(diǎn)片狀壞死灶，提示細(xì)胞壞死程度嚴(yán)重。冠通方小劑量組可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫，排列紊亂，細(xì)胞漿增多，有明顯的病理?yè)p傷。對(duì)照組和冠通方大、中劑量組心肌細(xì)胞腫脹較輕，心肌細(xì)胞偶有壞死，細(xì)胞排列有序。詳見(jiàn)圖1。

假手術(shù)組 模型組 中藥對(duì)照組

冠通方大劑量組 冠通方中劑量組 冠通方小劑量組

2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較 光鏡下呈棕色的心肌細(xì)胞核為凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞，呈藍(lán)色則為非凋亡的陰性細(xì)胞。本研究結(jié)果表明：冠通方大、中劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少。詳見(jiàn)圖2。各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較見(jiàn)表1。

假手術(shù)組 模型組 中藥陽(yáng)性對(duì)照組

冠通方大劑量組 冠通方中劑量組 通方小劑量組

組別n凋亡指數(shù)假手術(shù)組80.91±0.32模型組828.13±7.62 中藥對(duì)照組812.83±4.611)冠通方大劑量組813.02±5.831)冠通方中劑量組816.37±5.281)冠通方小劑量組821.22±6.14 與模型組比較,1)P<0.01。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，其參與缺血再灌注損傷的病理過(guò)程，是缺血再灌注損傷引起心肌細(xì)胞死亡的主要原因，成為缺血再灌注損傷影響組織心臟功能的重要途徑和表現(xiàn)形式。已有許多研究表明，MIRI與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[3-5]。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡是減少缺血再灌注心肌損傷的有效途徑。

MIRI中醫(yī)病機(jī)包括氣虛、血瘀、痰飲不同的病理過(guò)程。謝連娣等[6]指出，氣虛導(dǎo)致血瘀和痰飲的形成，血瘀和痰飲導(dǎo)致氣虛程度進(jìn)一步加重。急性心肌梗死時(shí)血液供應(yīng)驟然停止，失去了血液的濡養(yǎng)和運(yùn)載；急性心肌梗死時(shí)，血栓堵塞血液的正常運(yùn)行，邪正交爭(zhēng)，正氣損傷；再灌注時(shí)突然過(guò)多的血液等待運(yùn)送到組織遠(yuǎn)端，增加心臟的負(fù)擔(dān)，均導(dǎo)致氣虛的形成。心氣虛無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，造成微血管栓塞，形成“血瘀”。氣虛血瘀可以導(dǎo)致水液代謝受到影響，水液留聚，形成“痰飲”。 多數(shù)學(xué)者亦認(rèn)為缺血再灌注損傷的過(guò)程涉及氣虛、血瘀、痰飲、痰瘀化熱化毒；以氣虛為本，血瘀痰飲為標(biāo)。

冠通方方中田七善于活血化瘀，消腫止痛，其化瘀血而不傷新血；丹參性寒涼血，又善活血化瘀，清瘀熱，消癰腫，除煩安神；地龍咸寒，善于活血祛瘀通絡(luò)，同時(shí)又能清熱化痰；瓜蔞甘寒微苦，善于清熱化痰，理氣寬胸，消腫散結(jié)，同時(shí)又具有潤(rùn)腸通便，瀉腑安臟之功；生曬參善于大補(bǔ)元?dú)?，同時(shí)又有生津之功；絞股藍(lán)甘苦性寒具有益氣養(yǎng)陰，消熱解毒，清熱祛痰之功；麥冬甘苦微寒，清熱養(yǎng)陰生津；陳皮辛散溫通，善于行氣燥濕化痰。諸藥合用則具有益氣養(yǎng)陰，清熱解毒化痰，行氣活血化瘀通絡(luò)之功[7]。田七又名三七，主產(chǎn)于云南、廣西等地?，F(xiàn)代基礎(chǔ)研究表明：三七中含有三七總皂苷(PNS)，三七的主要成分是三七總皂苷，已經(jīng)有報(bào)道關(guān)于PNS有良好的抗氧化作用[8]，并能抵抗自由基對(duì)心肌缺血再灌注后導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。此外，三七皂苷可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞的受損情況，增強(qiáng)抗氧化效果，并具有抑制血小板聚集，促進(jìn)纖維蛋白溶酶的活性，降低血液黏度，促進(jìn)血栓溶解，改善血液流動(dòng)的作用。顧國(guó)嶸等[9]通過(guò)酶學(xué)、形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)等研究表明，PNS缺血預(yù)處理24 h后能明顯減少缺血-再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死和凋亡，對(duì)缺血-再灌注心肌起到延遲保護(hù)作用，證明三七治療缺血性心臟病的基礎(chǔ)。PNS能擴(kuò)張冠脈，增加心肌營(yíng)養(yǎng)血流量，改善心肌微循環(huán)，明顯降低心肌耗氧量。同時(shí)PNS的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用也是其保護(hù)缺血-再灌注心肌的重要方面。丹參的抗氧化成分有丹參酮類(lèi)、丹參素、丹酚酸類(lèi)化合物、原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸，有研究指出[10-11]，丹參酮ⅡA可抑制細(xì)胞膜上的NADH/NADPH氧化酶的激活，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，清除氧自由基并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。研究表明[12]丹參凍干粉對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后MIRI有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是抑制炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮功能。

本研究通過(guò)冠通方對(duì)兔MIRI心肌細(xì)胞凋亡研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，冠通方可有效發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，使MIRI細(xì)胞凋亡趨勢(shì)下降、減少心肌病理?yè)p傷，為心肌細(xì)胞后期修復(fù)打好了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。冠通方對(duì)MIRI損傷心肌的保護(hù)作用是多機(jī)制、多靶點(diǎn)、綜合作用，因此冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制依然需要后續(xù)探索研究。

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Guantong Decoction on Pathologic Morphology and Myocardial-Cell Apoptotic Index in Rabbits with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Wei Bin，Wang Qiang，Jiang Hao，Zhu Zhihua，Chen Guangqin，Yin Wei，Luo Hong

Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，Guangxi，ChinaCorresponding Author:Wang Qiang

Objective To observe the effect of Guantong decoction(GTD) on pathologic morpho logy in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury .Methods Forty-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into 6 groups，namely sham group，normal control group，GTD high dose group，GTD moderate dose group，GTD low dose group and drug control group.The rabbits were taken medicine for 14 days with designated drugs.GTG groups were taken different dose medicine of GTD，and sham operation group and normal control group were pretreated by distilled water.The model of myocardial ischemia-reperfusion injury were established by ligating the left anterior descending artery of New Zealand rabbits for forty minutes after taken medicine for one hour and no coronary artery injury were in sham group.The heart were made into pathological sections and stained with HE and TUNEL.Apoptotic index was detected with electron microscope in times of four hundreds.Results Myocardial injury cells and apoptotic index of GTD high dose group and moderate dose group were less than normal control group and GTD small dose group (P<0.05).Conclusion GTD can effectively protect myocardial cell in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury.

myocardial ischemia reperfusion injury；Guantong decoction；mechanism research

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81160436)

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院(南寧530011)；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

王強(qiáng)，E-mail: wq7212@163.com

信息：韋斌，王強(qiáng)，姜浩，等.冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(13)：1569-1572.

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.13.008

1672-1349(2017)13-1569-04

2017-02-16)