音猬因子信號通路與骨質疏松癥關系的研究進展

許周媚 王清輝 查旋 徐道華,2 *

1. 廣東醫(yī)科大學藥理學教研室，廣東 東莞 523808 2. 廣東醫(yī)科大學中藥與新藥研究所，廣東 東莞 523808

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨顯微結構退化為特征，致使骨脆性增加、易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。其病理機制主要是成骨細胞的骨形成能力下降，成脂分化增強，破骨細胞的骨吸收活動增強，導致骨代謝平衡被打破，由此產(chǎn)生一系列的骨質疏松癥狀。 Hedgehog家族是一組分泌性的信號蛋白，最早在1980年從果蠅體內發(fā)現(xiàn)并分離得到，因Hedgehog的突變可使果蠅胚胎發(fā)育成毛團狀，酷似刺猬，故稱為刺猬基因[1]。在哺乳動物體內有3種同源Hedgehog信號，Shh在Hedgehog家族中表達最廣泛，與細胞在肢體、體節(jié)、神經(jīng)管發(fā)育中的分化建立有關[2]，與多種器官如腦、脊髄、肺臟、毛發(fā)、眼、頜面、牙和四肢等的形態(tài)形成有關，與腫瘤發(fā)生也有關系[3-6]。研究證明，隨著衰老進程的推進，骨骼中Shh信號表達水平也降低，Shh信號通路在骨質疏松發(fā)病過程中具有重要作用[7]。因此，本文擬對Shh信號通路與骨代謝的關系進行綜述，為Shh信號通路在骨質疏松癥防治藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 Sonic hedgehog 信號通路發(fā)生和轉導

1.1 Sonic hedgehog 蛋白的自動修飾

Shh蛋白是Shh信號通路的啟動蛋白，是該通路的重要組成部分之一。Shh最初被編碼成一個45-kDa的前體蛋白，經(jīng)過分子內裂解成Shh-C(26-kDa)和Shh-N(19-kDa)兩個部分[8]，其中Shh-N為活性調節(jié)部分，Shh-N經(jīng)膽固醇或棕櫚酸(又稱軟脂酸)的共價修飾成為可溶解可擴散的脂質雙分子形式“M-Shh-N”，即Shh蛋白發(fā)揮誘導作用的活性形式[9-10]。

1.2 Sonic hedgehog 信號通路的激活

Shh信號通路的激活首先是“M-Shh-N”與Ptc-Smo異二聚體復合物受體結合。Patched(Ptc)是一個12次跨膜蛋白，對Hedgehog信號通路起負性調節(jié)作用；Smoothened(Smo)是一種特殊的7次跨膜蛋白，是激活 Hedgehog信號傳遞必需的受體。當Shh與Ptc結合時，Smo的抑制效應被解除，活化的Smo通過編碼一些類似G蛋白偶聯(lián)受體的跨膜蛋白啟動Shh信號通路下游的一系列信號流，或者直接編碼Shh信號的受體[11]，其產(chǎn)生的細胞內信號將通過調節(jié)幾種蛋白酶激活一類核內轉錄因子，Cubitus interrupts(Ci)蛋白和下游鋅指轉錄因子glioblastoma(Gli) 蛋白[12]，由此通路被激活。

1.3 Sonic hedgehog 信號通路的轉導

Sonic hedgehog信號的轉導主要通過調節(jié)以下4部分極性因子實現(xiàn)信號的轉導，包括Ptc，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Fused(Fu)，類運動蛋白costal-2(Cos-2)，Ci。該信號通路的靶基因是分子量為155kDa，具有細胞質鋅指結構的Ci蛋白[13]。在脊椎動物中，Ci蛋白又稱Gli蛋白，分Gli1，Gli2，Gli3共3種，其中Gli1和Gli2對Shh通路起正性調節(jié)作用，而Gli3起負性調節(jié)作用[14]。Cos-2是一種能與微管蛋白結合并能水解ATP的驅動蛋白樣蛋白[15]，當其與微管蛋白結合時，則阻止了全長Ci進入細胞核內。Fu可以磷酸化結合Cos-2，其抑制形式SuFu(suppressor of fused)可結合在Ci的SuFu結合位點上，實現(xiàn)對Shh通路的負性調節(jié)[16-17]。由此，當通路中編碼的Shh蛋白不存在時，F(xiàn)u，Cos-2分別與Ci結合成復合物并結合在微管上，其中Cos-2將全長Ci155水解為非活性形式的Ci75，導致Ci下游的轉錄受到抑制。當編碼的Shh蛋白存在時，Shh蛋白結合Ptc受體結合，從而釋放其對Smo的抑制效應，活化的Smo將與Fu, Cos-2形成復合物，同時抑制PKA的活性，使得活性形式的全長Ci155進入細胞核，激活下游靶基因(Ptch、Wg、Dpp等)的表達[18-19]。并且全長Ci還可下調原本有助于分別位于兩細胞上的Hedgehog蛋白與受體Ptc結合的iHog和CDO在細胞膜上的表達，從而對Hedgehog蛋白有負反饋作用。值得注意的是，Hedgehog信號的轉導需要初級纖毛的參與，因為纖毛內蛋白在該通路的跨膜蛋白Ptc和Smo的轉移以及靶基因Ci的表達中也同等重要[20-21]。見圖1。

圖1 Sonic hedgehog 信號通路激活與轉導Fig.1 The activation and transduction of sonic hedgehog signal pathway

2 Sonic hedgehog信號通路對成骨作用的影響

2.1 Sonic hedgehog對未分化的細胞及前體成骨細胞成骨分化的影響

目前，越來越多的實驗證明，Shh對多種細胞的成骨分化有促進作用，而抑制其成脂作用。如含轉染能編碼N-Shh基因的質粒的多能間充質細胞系C3H10T1/2細胞，其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和成骨標記基因骨鈣素(osteocalcin, OCN)的表達水平升高，并且這種成骨分化的促進作用主要是通過上調骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMPs)產(chǎn)生[22]。用Shh處理C3H10T1/2細胞發(fā)現(xiàn)ALP表達增強，同時Hedgehog信號通路中的必需受體 Ptc、Smo以及靶基因Gli的表達明顯增強[23]，說明Shh信號通路參與促進C3H10T1/2細胞成骨分化的過程。研究表明[24]，重組人Shh蛋白促進了未分化的KS483細胞系向成骨細胞分化。Shh也能促進前體成骨細胞MC3T3-E1的增殖和分化[25]。

2.2 Sonic hedgehog對成骨細胞成骨分化的影響

Hedgehog信號通路與成骨細胞的增殖和分化過程密切相關。韓磊等[26]在體外分離和培養(yǎng)新生大鼠顱頂骨成骨細胞，發(fā)現(xiàn)Hedgehog N端重組蛋白(N-Shh)能促進原代成骨細胞的增殖和S期細胞比例增加，增強ALP的活性并促進Hedgehog通路特異性受體Ptch和Smo的表達，該通路抑制劑環(huán)巴胺則抑制原代成骨細胞的增殖和分化。Horikiri等[25]發(fā)現(xiàn)，加入Shh可促使骨缺損部位進行骨重建，可能是因為Shh對成骨細胞的增殖和分化有促進作用。Jemtland等[27]在原代成骨細胞的培養(yǎng)基中加入N-Shh，可上調甲狀旁腺相關肽(parathyroid hormone-related peptide, PTHrP)的表達及免疫PTHrP(immunoreactive parathyroid hormone-related peptide, iPTHrP)的分泌，從而誘導成骨分化；N-Shh還可以增加ALP表達, 礦化結節(jié)的形成增多，說明N-Shh可促進原代成骨細胞的骨形成作用，這個作用是通過上調PTHrP實現(xiàn)的。

2.3 Sonic hedgehog對人骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs) 的影響

與上述實驗研究結果不同，Shh對人MSCs細胞的成骨誘導作用存在爭議。Warzecha 等[28]發(fā)現(xiàn)用Shh處理人的MSCs細胞時，細胞表達出多種軟骨分化階段特征的標志：Sox9，CEP-裂能力，并且只有經(jīng)過r-Shh處理的人MSCs細胞表現(xiàn)出較強的分裂能力和更高的溴脫氧核苷尿嘧啶含量。Beloti等[29]也發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路激動劑purmorphamine能促進人MSCs細胞的成骨分化，增強ALP活性。 然而也有研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號的活化會抑制MSCs成骨分化。Plaisant等[30]在培養(yǎng)人MSCs時，發(fā)現(xiàn)在成骨過程中Smo受體及Gli轉錄因子的表達明顯減少，其作用機制可能與成骨分化標記轉錄因子Runt-related transcription factor 2 (Runx2)的下調有關。

2.4 Sonic hedgehog對體內骨組織形成的影響

有研究證實在骨重建的位點上發(fā)現(xiàn)成骨細胞中的Shh信號通路被活化，Shh信號通路通過調節(jié)成骨細胞的增殖、分化以及破骨細胞的形成影響骨折的愈合[30-31]。在頭頂缺陷的兔子模型中移植經(jīng)Shh轉換的細胞可發(fā)現(xiàn)缺損處骨再生[33]。Krishnan等[34]研究亦發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路中的Shh-N可通過BMP-4和核心結合因子(core binding factor alpha 1, Cbfa1) 介導新生小鼠跖骨中軟骨內骨形成，促進骨的生長發(fā)育。史堅強[35]等證實MSCs復合Shh修飾的納米晶膠原基骨(nano hydroxyapatite/collagen, nHAC) 修復同種異體SD大鼠股骨缺損的效果明顯優(yōu)于單純的MSCs/nHAC修復的效果，前者成骨較早且骨痂生成較多，能更快更有效地促進骨缺損的愈合，其成骨方式主要為軟骨內成骨。最近研究表明[36]，在小鼠脛骨骨折發(fā)生后，可檢測到Hedgehog信號通路的組成成分表達增加，從而增多骨痂的形成，促進骨折愈合。也有人發(fā)現(xiàn)Gli單倍劑量不足的小鼠表現(xiàn)出骨量的減少和成骨細胞分化的減弱，而破骨細胞的分化增加[37]。以上研究均表明了Shh對骨折愈合的重要性，但其具體作用機制未作具體探討。

2.5 Sonic hedgehog信號通路影響成骨分化的作用特點

在Hedgehog信號通路中，印度刺猬因子(indian hedgehog, Ihh)及Shh是調控肢體發(fā)育及成骨細胞分化的重要信號分子。Shh是成骨細胞分化早期的關鍵信號之一，而Ihh主要參與分化晚期的調控，說明Shh信號的發(fā)揮是有時限性的[38-39]。Shh和Ihh都能刺激C3H10T1/2間充質細胞系向成骨細胞方向分化，但和Ihh相比，Shh的誘導活性明顯較強[40]。韓磊等[26]在體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞，發(fā)現(xiàn)在成骨細胞體外生長過程中，Shh的表達逐漸減弱，而Ihh的表達逐漸增強。進一步研究認為Hedgehog蛋白主要在成骨細胞分化的早期有促進作用，由于隨著成骨細胞的成熟Hedgehog信號逐漸減弱并在成骨細胞分化的晚期出現(xiàn)抑制作用[29]。但是以Shh及Runx2處理MC3T3-El細胞后，其多種成骨相關蛋白的表達明顯提高，而沉默Runx2基因后，這些因子的表達明顯降低，表明在Runx2的介導下Shh也可促進成骨細胞的晚期成熟分化[41]。

另外，Hedgehog 蛋白的功能在不同物種間可能會存在較大差異。人類骨髓間充質干細胞的Shh信號對成骨分化作用顯示出與動物種屬不同的抑制效應，同一種屬的細胞表現(xiàn)出促進或抑制的成骨分化作用，說明培養(yǎng)條件的不同也可能影響其作用結果。

此外，有研究表明，Shh只是Hedgehog通路中的啟動因子，不是作為成骨、成軟骨的誘導劑發(fā)揮作用，而在其他成骨相關因子協(xié)助下可發(fā)揮作用。有人將 Shh-N直接植入裸鼠發(fā)現(xiàn)植入部位既沒有骨形成, 也沒有軟骨形成。Yuasa等[42]發(fā)現(xiàn)重組N-Shh是依賴BMP-2來誘導MSCs 和C3H10T1/2細胞的成骨分化，將BMP-2移植到小鼠肌肉內可產(chǎn)生異位成骨，而單獨移植N-Shh不出現(xiàn)此現(xiàn)象，表明 N-Shh必須在BMP-2參與下才能誘發(fā)MSCs的成骨分化。進一步驗證發(fā)現(xiàn)，加入外源性的重組鼠N-Shh能提高小鼠胚胎 C3H10T1/2細胞對BMP-2 的反應，成骨分化標記ALP活性增強；而給予 BMP 抑制劑Noggin解除BMP-2的誘導活性后，共轉染 N-Shh和Noggin卻對Shh誘導的ALP表達無明顯影響，說明 Shh 可直接作用于成骨細胞分化，但BMP-2對N-Shh的協(xié)同誘導作用具有一定的時效性[43-45]。

3 Sonic hedgehog通路對脂肪組織形成的影響

在脂肪細胞中，Hedgehog信號通路的多種組成成員，如受體Ptc、Smo及核內轉錄因子Gli均有表達，而且早期研究發(fā)現(xiàn)激活果蠅和線蟲的hedgehog信號通路，體內的脂肪生長受到抑制，脂肪量下降。經(jīng)Shh轉基因的果蠅，肥胖不容易發(fā)生[46]。Pospisilik等[47]通過建立sufu基因突變鼠發(fā)現(xiàn)激活hedgehog信號通路會特異性地抑制該鼠白色脂肪組織的發(fā)育，白色脂肪細胞的數(shù)量和大小明顯下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Shh通路的活化會抑制多種間充質干細胞向脂肪細胞方向分化成熟，而有利于成骨細胞的分化。用Shh處理鼠間充質干細胞KS384和C3H10T1/2，發(fā)現(xiàn)Shh能促進該細胞向成骨細胞方向分化，抑制其向脂肪細胞方向分化[40]；James等[48]發(fā)現(xiàn)在成骨分化過程中，Hedgehog 信號通路的相關蛋白Shh, Ptc1和Gli1的表達增加，而在脂肪分化過程中，上述通路蛋白的表達減少。并且N-Shh作用于脂肪來源的基質干細胞(mouse adipose-derived stromal cells，mASCs)可通過上調成骨標記基因Runx2，最終導致ALP活性的增加和鈣結節(jié)數(shù)量的增多，促使mASCs向成骨方向分化。

4 Sonic hedgehog通路對破骨細胞的影響

研究表明[49-50]，激活成年大鼠成熟的成骨細胞Hedgehog通路，可同時使成骨細胞和破骨細胞增多，骨形成活躍的同時骨吸收作用也明顯加強，最終出現(xiàn)骨質疏松；而抑制Hedgehog通路則使大鼠骨質丟失減少，表明Hedgehog信號參與調節(jié)破骨細胞的生成。Hedgehog對破骨細胞的調節(jié)可通過多種途徑作用，如核因子κβ受體活化因子配體(Ligand of receptor activator of nuclear factor kappaβ, RANKL)依賴途徑，RANKL是破骨細胞分化因子，Hedgehog可通過上調PTHrP來調節(jié)RANKL的表達，從而誘導破骨細胞的成熟，促進重吸收的過程[51]。另外有實驗證明，Shh通過上調成骨特異性轉錄因子(Osterix, OSX)的表達來促進成骨細胞的形成，同時也間接地增加破骨細胞的活性，從而促進骨重吸收，導致骨強度的降低[52-53]。

5 Sonic hedgehog信號通路異常可能導致的相關骨骼疾病

大量的研究證明，Hedgehog信號通路在促進成骨細胞的增殖[54]、分化[55-57]，抑制脂肪細胞的形成[58]中扮演重要的角色，這就暗示了Hedgehog通路有調節(jié)骨強度的作用并可能對骨質疏松患者起到針對性的治療作用。而當Hedgehog信號通路中的某個組件發(fā)生了突變，各種骨骼疾病也就應運而生。Shh發(fā)生突變可能導致史李歐綜合征，病人多以并指或多指為特征的骨骼畸形[59]。Patched homolog 1(Ptch1)突變可能導致多發(fā)性基底細胞痣綜合征，其發(fā)病主要以多指、異位骨形成、脊柱裂為特征的骨骼畸形[60-62]。而VACTERL綜合征也被證明與Gli2和Gli3突變的突變有關，該病會引起脊柱缺損，四肢畸變[63]。全基因組關聯(lián)研究已經(jīng)證明Hedgehog信號對人的身高起著重要的調節(jié)作用，同時揭示Shh是多指癥的一個重要調節(jié)信號[64-65]。

6 Sonic hedgehog信號通路的興奮劑和抑制劑

目前研究發(fā)現(xiàn)，Shh通路特異性的興奮劑和抑制劑主要是作用于Hedgehog信號通路Smo受體及其下游的核內轉錄因子Gli1這兩大類。20(S)-羥膽固醇和22(R)-或22(S)-羥膽固醇作用于骨髓基質干細胞表現(xiàn)出明顯的成骨誘導作用，這種作用是通過增加成骨標記基因Runx2、OCN的表達，進而增加ALP活性以及礦化結節(jié)的形成[66-67]；Hh-Ag 1.3 和Hh-Ag 1.7均能特異性地激活內生性Gli1的表達，激活Shh通路從而劑量依賴性地增加ALP活性以及成骨標記基因的表達，最終促進間充質干細胞系C3H10T1/2的成骨分化作用[68]。這些通路激活劑將有望開發(fā)成為臨床上可用的治療骨質疏松癥的有效藥物。

Shh通路抑制劑中研究得比較多的是環(huán)巴胺類藥物。其作用機制是通過與Smo受體結合，阻止Smo的磷酸化而阻斷了下游完整 Gli 蛋白的產(chǎn)生，從而抑制Hedgehog信號通路，因此當Smo發(fā)生突變或者Gli 蛋白下游有改變，環(huán)巴胺將無效。由于環(huán)巴胺的毒副作用比較多以及溶解度小、穩(wěn)定性差等問題，限制了其在臨床上的開發(fā)應用，因此人們進一步研究發(fā)現(xiàn)了有著更好酸穩(wěn)定性和水溶性的環(huán)巴胺的半合成類似物IPI-269609，此后，又經(jīng)體內活性評價和藥代評價優(yōu)化合成了有望進入臨床試驗階段的IPI-926[69]。GDC-0449是第一個合成并在I 期臨床試驗中顯示出良好的藥效和藥代動力學特征的Smo的抑制劑。在1例26歲轉移性髓母細胞瘤患者治療前獲得的腫瘤樣本中，發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路被激活，而經(jīng)GDC-0449治療后，腫瘤體積縮小，癥狀也得到改善[70]。Hedgehog信號通路抑制劑目前主要用于該信號過度表達時導致的腫瘤的治療。

7 其他

目前，關于Shh通路與其他骨代謝相關的通路共同影響骨代謝的研究多集中在BMPs通路，BMPs通路通常作為Sonic hedgehog信號通路的下游來調節(jié)軟骨細胞的成骨分化[71]。也有人通過建立Ptch1和β-Catenin雙重突變鼠發(fā)現(xiàn)此突變鼠的骨形成作用遭到破壞，說明作為Hedgehog信號通路下游，Wnt/β-Catenin信號通路在軟骨內成骨過程中也可調節(jié)成骨分化[72]。另外，Hedgehog信號通路的活化主要通過上調包括Runx2、BMPs、SMADs、多種生長因子和整合素等與成骨分化相關的基因[73]來影響骨代謝的過程。

8 小結

總之，隨著人口老齡化進程的推進，骨質疏松發(fā)病率越來越高。對Shh信號通路研究的深入，不僅闡釋了骨質疏松發(fā)生、發(fā)展以及修復的機制，而且為骨質疏松癥的預防與治療提供新途徑。目前Shh信號通路對于是否有利于成骨細胞的分化成熟尚存在爭議，但Shh信號通路在骨代謝平衡中的重要作用毋庸置疑，這可能與實驗的條件、實驗對象種屬來源、給藥劑量等有關；另一方面其也可能促進破骨分化的進程，因此在調節(jié)骨形成作用的同時是否會影響破骨的進程，仍需要進一步研究。但是Shh信號通路作用于MSCs細胞抑制成脂分化的作用較為確定，是否可通過利用間充質干細胞作為研究載體，研制出調節(jié)間充質干細胞向成骨細胞方向分化，促進骨形成作用，使骨重建重新達到平衡的藥物，可能是未來骨質疏松治療藥物研發(fā)的一個重要研究思路。這也是當前Hedgehog信號通路的一個研究熱點，然而對其具體作用機制以及體內整體藥效學和藥動學還有待進一步研究。