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    建立雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型的方法學(xué)研究

    2017-08-06 06:35:50孫巖陳冉王小琦張洋蔣罡胡敏趙宏斌李文輝
    中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志 2017年4期
    關(guān)鍵詞:藥組半乳糖雄性

    孫巖 陳冉 王小琦 張洋 蔣罡 胡敏 趙宏斌* 李文輝

    1. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650032 2. 昆明學(xué)院,云南 昆明 650032 3. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所,云南 昆明 650032

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosisi,OP)是以單位骨量減少和骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征,并導(dǎo)致骨脆性增加、發(fā)生骨折及相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加的一種全身性骨骼疾病[1]。由于人口老齡化加速,骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率預(yù)計(jì)將增加,骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題[2]。現(xiàn)在骨質(zhì)疏松研究對(duì)象多選擇雌性動(dòng)物,模擬絕經(jīng)后婦女由于雌激素分泌的減少導(dǎo)致的骨量丟失[3],但是忽視了男性骨質(zhì)疏松的研究。隨著年齡的增加,男性性腺功能減退,雄激素分泌減少,會(huì)導(dǎo)致男性骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生[4]。目前全球有15%的60歲以上男性患有骨質(zhì)疏松癥[5]。在臺(tái)灣,骨質(zhì)疏松后骨折男性發(fā)病率42.3%大于女性發(fā)病率38.8%[6]。在我國(guó),流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)60歲以上男性吸煙、飲酒、受教育程度低是骨質(zhì)疏松獨(dú)立因素[7-8]。被忽視的男性骨質(zhì)疏松問題及后續(xù)發(fā)生的嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松后骨折帶來(lái)了更高的死亡率、社會(huì)成本,男性骨質(zhì)疏松癥的研究迫在眉睫。

    目前骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建造使用雌性動(dòng)物去卵巢手術(shù)造?;蛘咚幬镌炷#恍坌詣?dòng)物的骨質(zhì)疏松模型建造方法相關(guān)內(nèi)容很少。本研究參考雌性動(dòng)物造模方法,擬使用10月齡雄性SD大鼠,采取雙側(cè)睪丸切除手術(shù)造模和皮下注射D-半乳糖造模兩種方法建立雄性骨質(zhì)疏松模型,探尋雄性骨質(zhì)疏松模型的可靠建造方法,為進(jìn)一步研究男性骨質(zhì)疏松提供動(dòng)物模型。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    40只3月齡雄性SD大鼠,購(gòu)買自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(大鼠生產(chǎn)許可證號(hào):sc川-2013-24),飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所(溫度22±4℃,濕度65%±5%,晝夜周期12 h)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)分組

    飼養(yǎng)期間無(wú)大鼠死亡。飼養(yǎng)28周后,隨機(jī)平均分為4組(每組10只):A組空白對(duì)照組,不做處理;B組手術(shù)組,行經(jīng)陰部雙側(cè)睪丸切除術(shù);C組給藥組,每日頸部皮下注射100 mg/kg的D-半乳糖水溶液(1 g∶100 mL生理鹽水);D組共處理組,同時(shí)行手術(shù)和藥物皮下注射。

    手術(shù)組和共處理組動(dòng)物行經(jīng)陰部雙側(cè)睪丸切除術(shù),術(shù)前12 h禁食禁水,使用10%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉,深度麻醉后固定、脫毛、消毒,嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。于陰囊小切口暴露睪丸,結(jié)扎后切除,止血,逐層縫合。經(jīng)病理檢查證實(shí)睪丸切除完全。術(shù)后當(dāng)日到術(shù)后5天予青霉素1萬(wàn)單位/只,采用無(wú)菌醫(yī)用棉墊作為飼養(yǎng)墊料。術(shù)后7天傷口愈合,不拆線。手術(shù)組術(shù)后大鼠死亡1只,第8周骨密度測(cè)量后死亡大鼠2只,尸檢未見明確死因。

    1.3 DXA雙能射線骨密度度測(cè)定

    于術(shù)前、術(shù)后第8周使用7%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔麻醉后,俯臥位于檢測(cè)臺(tái)上,脊柱拉直,行雙能射線DXA骨密度測(cè)定(GE-Lunar 公司DXA 骨密度儀Prodigy 型及附帶的小動(dòng)物骨密度測(cè)定軟件測(cè)量)。

    1.4 數(shù)據(jù)收集與分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0分析,相關(guān)數(shù)值表示使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差,精確到小數(shù)點(diǎn)后三位。組間比較選擇單因素(ANOVA)方差分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2 結(jié)果

    2.1 體重第8周,空白對(duì)照組、手術(shù)組、共處理、給藥組體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。空白對(duì)照組體重較第1周體重高,同時(shí)其余三組實(shí)驗(yàn)組體重較第1周體重降低,共處理組大鼠體重絕對(duì)值最低。見圖1。

    圖1 SD大鼠體重Fig.1 Body weight of SD rats

    2.2 骨密度及骨礦鹽含量

    第8周,手術(shù)組、共處理組與對(duì)照組骨密度存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),均低于對(duì)照組全身骨密度;給藥組與對(duì)照組骨密度無(wú)差異(P>0.05),但給藥組骨密度絕對(duì)值低于對(duì)照組骨密度。共處理組骨密度低于手術(shù)組骨密度,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。四組間骨礦鹽含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

    表1 第8周各組全身骨密度、骨礦鹽含量Table 1 BMD and BMC of each group at 8 weeks

    注:與對(duì)照組比較,△△P<0.01,即兩組存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;△P<0.05,即兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;未標(biāo)注表示不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

    2.3 組織、脂肪、肌肉含量

    對(duì)照組與三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的組織含量、肌肉含量絕對(duì)值不同,但是互不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。對(duì)照組脂肪含量高于手術(shù)組、共處理組、給藥組脂肪含量,且存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);三組實(shí)驗(yàn)組之間脂肪含量不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2。

    圖2 各組組織、脂肪、肌肉含量Fig.2 Tissue, fat and muscle content of each group

    3 討論

    在骨質(zhì)疏松的研究中,動(dòng)物模型被廣泛運(yùn)用,理想的動(dòng)物模型是研究者開展骨質(zhì)疏松疾病相關(guān)研究的基礎(chǔ)。成年大鼠具有充足的皮質(zhì)骨重建,運(yùn)用于骨骼研究,其在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可保持穩(wěn)定,從而表現(xiàn)骨形成與吸收的動(dòng)態(tài)平衡。以往多選用雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型,手術(shù)去勢(shì)或藥物誘導(dǎo)后,骨量減少且骨密度降低明顯。

    本實(shí)驗(yàn)著眼于雄性骨質(zhì)疏松相關(guān)研究較少,通過(guò)建立雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型對(duì)了解雄性骨質(zhì)疏松具有重要的意義。參考雌性骨質(zhì)疏松模型的手術(shù)建模與藥物建模方法,選用雙側(cè)睪丸切除法及D-半乳糖皮下注射法建立雄性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型并加以比較,研究有效的雄性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立方法;并聯(lián)合兩種方法對(duì)雄性大鼠進(jìn)行處理,觀察去勢(shì)和給藥對(duì)于雄性動(dòng)物骨質(zhì)疏松是否存在協(xié)同作用。

    結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)第8周各組骨密度均高于第1周。已有研究表明,大鼠10個(gè)月~12個(gè)月才能達(dá)到骨密度峰值[9],骨密度峰值過(guò)后進(jìn)入衰老期。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)10月齡大鼠骨密度峰值仍未達(dá)到,骨密度仍處在增長(zhǎng)期;一般來(lái)說(shuō)骨密度達(dá)到平臺(tái)期后建模為最理想時(shí)間,作為老年動(dòng)物模型,下一步考慮使用年齡更大的SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    實(shí)驗(yàn)第8周手術(shù)組骨密度低于對(duì)照組骨密度,且存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。已有報(bào)道稱手術(shù)切除雙側(cè)睪丸8周后大鼠骨密度(BMD)會(huì)顯著降低[10],大鼠去勢(shì)8周后可以達(dá)到骨質(zhì)疏松。手術(shù)組雙側(cè)睪丸切除術(shù)是通過(guò)模擬老年男性性腺功能減退導(dǎo)致睪酮水平下降,骨密度流失所致的骨質(zhì)疏松[11-12]。給藥組骨密度雖然低于對(duì)照組骨密度,但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。給藥組D-半乳糖通過(guò)皮下大劑量注射,會(huì)在大鼠體內(nèi)會(huì)經(jīng)氧化酶分解為CO2和木酮糖,伴有氧自由基和H2O2的產(chǎn)生,產(chǎn)生氧化損傷,形成亞急性衰老模型[13];同時(shí)D-半乳糖的過(guò)量堆積影響骨的代謝,改變骨結(jié)構(gòu)的力學(xué)和生物力學(xué)參數(shù),造成骨質(zhì)疏松[13-14]。本研究中給藥組骨密度下降不明顯,說(shuō)明連續(xù)8周使用D-半乳糖無(wú)法造成骨質(zhì)疏松,仍需延長(zhǎng)給藥時(shí)間。

    另外,共處理組骨密度與手術(shù)組骨密度均低于對(duì)照組,共處理組骨密度較手術(shù)組骨密度降低5.6%,兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),在缺乏睪酮的機(jī)體內(nèi),D-半乳糖造成的骨量丟失更加明顯;而在單獨(dú)使用D-半乳糖的給藥組中,骨量丟失不明顯。睪酮是否存在一種抗氧化應(yīng)激作用,避免D-半乳糖在骨代謝中的堆積。這將是我們下一步研究的方向。

    值得關(guān)注的是,第8周三組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比脂肪含量顯著下降(P<0.01)。很多研究表明雌性骨質(zhì)疏松模型建立后,雌性動(dòng)物脂肪含量均會(huì)代償性增加。而在雄性動(dòng)物模型中,其脂肪含量卻在建立骨質(zhì)疏松模型后較少。其機(jī)理可能與睪酮抑制瘦素的表達(dá)有關(guān)。切除睪丸后,機(jī)體瘦素分泌增加,脂肪含量減少。同時(shí),D-半乳糖導(dǎo)致機(jī)體衰老,內(nèi)環(huán)境代謝紊亂也會(huì)導(dǎo)致脂肪含量減少。這樣,睪酮減少和機(jī)體衰老對(duì)機(jī)體脂肪含量的影響,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于骨骼肌-機(jī)械負(fù)荷對(duì)于骨質(zhì)疏松的代償性保護(hù),結(jié)果就表現(xiàn)為雄性動(dòng)物骨質(zhì)疏松后脂肪減少。

    本研究討論并說(shuō)明了去勢(shì)法第8周雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立;去勢(shì)法和D-半乳糖給藥法聯(lián)合使用第8周建立骨質(zhì)疏松模型,骨密度下降更為顯著;雄性大鼠骨質(zhì)疏松后,脂肪含量減少,與雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型后脂肪增加不同。

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