血漿miRNA在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)差異性研究

羅鳳玲?杜紅纓?毛進(jìn)星?鄺碧茹?李家祥

[摘要] 目的 應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)，研究血漿miRNA在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)差異性，初步篩選出與鼻咽癌相關(guān)的miRNA，為鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提供依據(jù)。 方法 選取90例初次接受治療的鼻咽癌患者及健康成年人60例，分別收集所有研究對(duì)象的血漿標(biāo)本，分離miRNA，運(yùn)用GenePix4000B芯片行比較分析病例組與對(duì)照組之間miRNA的表達(dá)是否存在差異。 結(jié)果 通過比較，各組一般資料無差異，90例鼻咽癌患者臨床分期為Ⅰ期組20例，Ⅱ期組20例，Ⅲ期組25例，Ⅳ期組25例；通過miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNA31個(gè)，在這31個(gè)miRNA中，上調(diào)有26個(gè)，下調(diào)有5個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 鼻咽癌患者和健康人血漿中含有的miRNA表達(dá)存在差異，提示miRNA參與到鼻咽癌病情的發(fā)生以及發(fā)展當(dāng)中，可為鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷，早期治療提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 鼻咽癌；miRNA；表達(dá)；差異性

[中圖分類號(hào)] R739.63 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）09-217-03

Differential expression study of plasma miRNA in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma

LUO Fengling DU Hongying MAO Jinxing KUANG Biru LI Jiaxiang

Department of Oncology，Zhaoqing First People's Hospital，Zhaoqing 526000，China

[Abstract] Objective To study the differential expression of plasma miRNA in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma by miRAN chip technology，to conduct the preliminary screening of the miRNA associated with nasopharyngeal carcinoma，and to provide evidence for early detection，early diagnosis and early treatment of nasopharyngeal carcinoma. Methods 90 patients with nasopharyngeal carcinoma in the initial treatment and 60 cases of healthy adults were selected.Plasma samples were collected from all subjects to separate the miRNA.GenePix4000B chip was used to compare and analyze the differential expression of case group and control group. Results By comparison，there was no difference in general data.90 patients with nasopharyngeal carcinoma were divided into stage I group（n=20），stage II Group（n=20），stage III group（n=25）and stage IV group（n=25）.There were 31 cases different in the expression of miRNA by miRNA.Among the 31 cases of miRNA，there were Up by 26，down by 5，and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression of miRNA in plasma of NPC patients and healthy people is different.It is suggested that miRNA is involved in the occurrence and development of NPC.It can provide theoretical basis for early detection，early diagnosis and early treatment of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma；miRNA；Expression；Difference

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，以明顯的區(qū)域分布特征、強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)移傾向?yàn)轱@著特征[1]。大宗臨床病例觀察顯示鼻咽癌病人不易早期發(fā)現(xiàn)[2]。而有關(guān)鼻咽癌的分子標(biāo)志物研究中，EB病毒VCA-IgA、EA-IgA及血液中EBV-DNA拷貝數(shù)變化雖然在一定程度上可監(jiān)測鼻咽癌療效，但目前還沒有被FDA承認(rèn)的鼻咽癌診斷及預(yù)測預(yù)后的分子標(biāo)志物[3]。如何能夠早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)測腫瘤對(duì)治療的敏感性、預(yù)測預(yù)后、監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移對(duì)鼻咽癌診治、干預(yù)具有重要的臨床意義。然而，正常情況下血漿中存在miRNA，可能為細(xì)胞、組織、器官之間的信息傳遞方式，普通正

常人群的血漿miRNA表達(dá)譜變化不大，腫瘤細(xì)胞也可通過微泡主動(dòng)釋放miRNA入血，隨之其表達(dá)譜可發(fā)生變化，由于血漿中miRNA分子量小且被微泡保護(hù)，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高[4]，所以血漿miRNA將有可能為腫瘤分子標(biāo)志物的研究帶來曙光，其臨床應(yīng)用意義前景廣闊。本研究擬通過芯片技術(shù)，測定健康人群與鼻咽癌患者血漿miRNA表達(dá)的差異，為鼻咽癌miRNA篩選及早期診斷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月1日～2016年12月1日在我院腫瘤科住院的并有完整隨訪資料及血樣標(biāo)本的初診鼻咽癌患者90例，其中男53例，女37例，平均年齡（45.4±6.2）歲，鼻咽癌2008分期Ⅰ期組20例，Ⅱ期組20例，Ⅲ期組25例，Ⅳ期組25例。另外，選取排除重大系統(tǒng)性疾病及腫瘤病史的正常人血漿標(biāo)本60例作為對(duì)照組，其中男36例，女24例，平均年齡（45.8±7.1）歲。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診，既往無放療或化療史。按照血清采集的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程收集鼻咽癌患者的血清標(biāo)本，掌握鼻咽癌患者的基本資料和臨床資料。兩組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有患者和志愿者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血漿RNA的提取 （1）在Eppendorf 離心管中加入1mL Trizol試劑，充分振蕩混勻，混勻后將溶液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf離心管中，加入200μL氯仿，再次充分振蕩混勻；（2）將Eppendorf離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為12000rpm，充分離心15min；（3）打開Eppendorf離心管，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf離心管中，加入500μL異丙醇溶液，混合均勻后室溫于靜置 15min；（4）重復(fù)第2步驟，再次離心，離心完成后，棄掉上清液，加入1Ml 75%乙醇溶液，再次充分振蕩混勻；（5）再次離心：4℃，7500rpm，5min；離心完成后，打開Eppendorf離心管，棄掉上清液，并在超凈工作臺(tái)中干燥5～10min；（6）加入40～60μL無RNA酶的水，用槍反復(fù)吹打，幫助沉淀的RNA溶解。

1.2.2 血清總RNA中miRNA的分離 取50～100.0?g總RNA，用Qiagen公司的miRNA分離提取試劑盒對(duì)總RNA中的miRNA進(jìn)行分離。

1.2.3 miRNA樣品的熒光標(biāo)記 利用T4 RNA連接酶對(duì)miRNA樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀。

1.2.4 芯片掃描、分析及數(shù)據(jù)分析 芯片使用Axon GenePix 4000B雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描，并用Axon公司的 GenePix 4000B 圖像掃描儀對(duì)微陣列芯片進(jìn)行掃描，同時(shí)用Axon公司的GenePix pro V6.0圖像分析軟件分析掃描轉(zhuǎn)化得到的數(shù)字信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

釆用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿總RNA抽提質(zhì)量

全部RNA抽提后，取使用微量核酸定量儀測定RNA濃度和純度，用于miRNA芯片的標(biāo)本總RNA檢測OD260/280均在1.7～2.0之間，濃度在20～200ng/μL之間，總量均在400ng以上，結(jié)果均符合miRNA芯片檢測要求，具體結(jié)果見表1。

2.2 鼻咽癌患者與正常人血漿miRNA芯片分析的差異性表達(dá)

應(yīng)用芯片對(duì)鼻咽癌患者及正常對(duì)照血漿進(jìn)行全基因組miRNA差異表達(dá)分析，在1891種miRNA中檢測到31種表達(dá)差異（倍數(shù)>1.5，χ2=14.34，P<0.05，其中26個(gè)高表達(dá)，5個(gè)低表達(dá)）。

3 討論

鼻咽癌作為我國兩廣（廣東、廣西）地區(qū)的高發(fā)病，給當(dāng)?shù)厝藗儙砹藰O大威脅[5]。目前鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，已知的危險(xiǎn)因素也無法從病因角度采取預(yù)防措施[6-7]。所以，鼻咽癌防控措施主要是二級(jí)預(yù)防-早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。鼻咽癌病例的預(yù)后與其是否早期診斷有著密切關(guān)系，我院就診的鼻咽癌患者中，有相當(dāng)一部分為中晚期患者，因?yàn)楸臼袑?duì)鼻咽癌的早期診斷尚無較好方法，故在高發(fā)區(qū)應(yīng)用miRNA對(duì)鼻咽癌早診早治和篩查工作，可以確保最大程度地提高篩查收益，提高早期鼻咽癌的檢出率和早期治療率，有效提高鼻咽癌患者的治愈率。

目前血漿miRNA在腫瘤的研究集中在大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、頭頸腫瘤等腫瘤中，并且已初步驗(yàn)證血漿miRNA作為診斷及預(yù)后指標(biāo)的可行性，顯示了良好的臨床應(yīng)用價(jià)值[8-9]。盡管近幾年來陸續(xù)有研究報(bào)道m(xù)iRNA參與鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，但與歐美高發(fā)的乳腺癌和前列腺癌研究相比仍是九牛一毛，更為重要的是，僅有的一些鼻咽癌miRNA研究多數(shù)集中于基礎(chǔ)研究，少數(shù)使用了小樣本的組織標(biāo)本進(jìn)行研究，臨床意義較小，鑒于血漿miRNA在腫瘤分子標(biāo)志物研究中的良好應(yīng)用前景，而目前尚無鼻咽癌血漿miRNA的研究報(bào)道[10]。本研究選擇從2016年開始收集的肇慶地區(qū)鼻咽癌病人血標(biāo)本，獲取90例的不同期、不同放療效果的鼻咽癌患者，結(jié)合詳細(xì)臨床資料及隨訪對(duì)血漿miRNA在鼻咽癌的臨床應(yīng)用價(jià)值展開初步探討。本研究表明，通過比較選擇差異表達(dá)出的miRNA31個(gè)，在這31個(gè)miRNA中，上調(diào)有26個(gè)，下調(diào)有5個(gè)，F(xiàn)old-Change>1.50，具有明顯差異。5個(gè)下調(diào)的miRNA所對(duì)應(yīng)的靶基因可能會(huì)富集在4條通路：腫瘤相關(guān)通路，嘌呤代謝途徑，Wnt信號(hào)通路以及軸突導(dǎo)向通路[11-12]；上調(diào)miRNA不具有明顯富集通路，miRNA與鼻咽癌亦存在緊密關(guān)聯(lián)。相關(guān)研究表明，鼻咽癌患者組織中和健康人組織內(nèi)含有的 miRNA表存在差異，提示miRNA或許參與到鼻咽癌病情的發(fā)生以及發(fā)展[13-15]。

綜上所述，本研究通過分子芯片技術(shù)對(duì)初次診斷為鼻咽癌患者和健康成年人血漿中miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)具有明顯差異性表達(dá)的人源性miRNA31個(gè)，其中上調(diào)26個(gè)，下調(diào)5個(gè)，提示鼻咽癌可導(dǎo)致患者血漿中miRNA的改變，確定了正常健康人與鼻咽癌患者之間血漿miRNA的表達(dá)存在差異，可以為鼻咽癌的早期診斷提供生物指標(biāo)，同時(shí)，能夠?yàn)楸茄拾┑脑缙谥委熂芭R床個(gè)體化治療提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-03-31）