低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和p-Nrf2表達(dá)的影響

姬衛(wèi)秀，何詩(shī)依，嚴(yán) 露，張 纓

JI Wei-xiu，HE Shi-yi，YAN Lu，ZHANG Ying

低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和p-Nrf2表達(dá)的影響

姬衛(wèi)秀，何詩(shī)依，嚴(yán) 露，張 纓

JI Wei-xiu，HE Shi-yi，YAN Lu，ZHANG Ying

目的：轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）－Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keapl）信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路。普遍認(rèn)為，長(zhǎng)期低氧訓(xùn)練會(huì)影響抗氧化能力，研究試圖通過(guò)對(duì)小鼠施加低氧暴露、低氧訓(xùn)練兩種方式，探討其對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表達(dá)以及活性氧（ROS）水平的影響。方法：C57BL/6J小鼠30只，分為3組，分別是對(duì)照組（C）、低氧組（H）和低氧訓(xùn)練組（HT）。其中，小鼠跑臺(tái)訓(xùn)練的跑速為12 m/min，1 h/d，6 d/周，持續(xù)4周；低氧濃度為10%，8 h/d，持續(xù)4周。干預(yù)結(jié)束后脫頸處死取后腿兩側(cè)骨骼肌。Western Blot法測(cè)定骨骼肌Nrf2、Keapl和p-Nrf2的蛋白表達(dá)。免疫共沉淀法測(cè)Nrf2/Keap1結(jié)合量。高質(zhì)熒光測(cè)定法檢測(cè)小鼠骨骼肌ROS水平。結(jié)果：與C組相比，H、HT組小鼠骨骼肌中Nrf2/Keap1結(jié)合量顯著升高，游離Nrf2顯著降低，p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低，游離Keap1基本無(wú)變化。WHT組ROS水平顯著高于WC組。結(jié)論：氧濃度為10%的4周低氧暴露和低氧訓(xùn)練均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解綁作用；低氧訓(xùn)練組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常顯著性降低，可能是造成ROS水平顯著升高的原因之一。

低氧；低氧訓(xùn)練；Nrf2/Keap1；p-Nrf2

近年來(lái)，低氧訓(xùn)練已成為運(yùn)動(dòng)員提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)的重要輔助手段。研究已表明，低氧訓(xùn)練可影響骨骼肌的抗氧化能力［1，3，4，11］，但其作用機(jī)制目前并不十分清楚。

NF-E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)［11，26］。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keapl），是Nrf2的調(diào)節(jié)者，對(duì)Nrf2功能起負(fù)調(diào)控作用［19］。在正常情況下，Keapl與Nrf2耦聯(lián)，并與肌動(dòng)蛋白結(jié)合被錨定于胞漿中，通過(guò)泛素化介導(dǎo)Nrf2蛋白降解，從而維持細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2處于較低水平［15］。而當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激后，Keap1蛋白上半胱氨酸的巰基易受到破壞，使其構(gòu)象發(fā)生改變，可促進(jìn)Nrf2與Keapl偶聯(lián)作用的解除。同時(shí)，氧化應(yīng)激刺激使Nrf2/Keap1復(fù)合物中的Nrf2發(fā)生磷酸化（p-Nrf2），加劇其和Keap1的解離作用，也可使游離Nrf2發(fā)生磷酸化［10，14］，從而使Nrf2和P-Nrf2在細(xì)胞漿中聚集，并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與Maf蛋白形成雜化二聚體［25］，而后與下游靶基因DNA上的抗氧化元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)其靶基因的轉(zhuǎn)錄，成為許多抗氧化基因的開(kāi)關(guān)［17，20］。

運(yùn)動(dòng)可以激活Nrf2－ARE通路，增強(qiáng)心肌的抗氧化防御能力，但Nrf2敲除鼠這種作用減弱［22］。也有研究發(fā)現(xiàn)，急性運(yùn)動(dòng)可使小鼠骨骼肌細(xì)胞核Nrf2的蛋白表達(dá)升高［5］。在低氧環(huán)境中，機(jī)體細(xì)胞缺氧，會(huì)產(chǎn)生一系列的反應(yīng)。低氧預(yù)處理可以激活Nrf2及其靶基因的表達(dá)，從而提高大鼠胚胎心肌細(xì)胞的生物學(xué)功能及抗缺氧能力［16］。沉默Nrf2基因后，低氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞的體外增殖活動(dòng)減少［28］。但也有研究表明，慢性間歇性低氧暴露4周和8周小鼠心肌組織中Nrf2表達(dá)水平下降［8］。在氧濃度為零的極度缺氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h的人類晶狀體上皮細(xì)胞，其Nrf2蛋白和mRNA表達(dá)降低，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞蛋白破壞［29］。

由上可知，低氧與Nrf2關(guān)系密切。然而，低氧暴露和低氧訓(xùn)練如何影響骨骼肌的Nrf2信號(hào)及其抗氧化作用，目前并不十分清楚。因此，本研究試圖通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以Nrf2/Keap1復(fù)合物為切入點(diǎn)，探討4周低氧暴露和低氧訓(xùn)練，對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表達(dá)以及活性氧（ROS）水平的影響，為低氧訓(xùn)練影響骨骼肌抗氧化作用的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠（購(gòu)于維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證書：SCX-K（京）2009-0004）30只，按體重隨機(jī)分為3組，分別是對(duì)照組（C組），低氧暴露組（H組），低氧訓(xùn)練組（HT組），每組10只。小鼠體重（18.37±2.26）g，每籠3～4只飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度保持在20～25℃，相對(duì)濕度保持在50%～70%，每天光照12 h（7：00～19：00），3組動(dòng)物均自由進(jìn)食和飲水。

1.2 干預(yù)方案

低氧暴露組小鼠每天暴露在常壓低氧環(huán)境中8 h（8：00～16：00），氧氣濃度為10%，持續(xù)4周；通過(guò)制氮機(jī)（北京創(chuàng)文氣體有限公司）、凍干機(jī)（杭州超濾）和空氣壓縮機(jī)（美國(guó)英格索蘭）共同作用將空氣中的氮?dú)馔ㄈ雱?dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)達(dá)到相應(yīng)氧濃度；低氧訓(xùn)練組的低氧環(huán)境與低氧組相同，并在低氧環(huán)境下進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，經(jīng)過(guò)兩天的適應(yīng)性訓(xùn)練后，進(jìn)行正式訓(xùn)練，其中，跑速12m/min，坡度為0，每天1 h，每周6天，持續(xù)4周。

1.3 取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束后，休息48 h脫頸處死，迅速取兩側(cè)腿部骨骼肌，用錫紙包裹標(biāo)記，投于液氮，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱備后續(xù)之用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 提取總蛋白

取100 mg組織，加入800μl含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，超聲勻漿，冰上靜置30 min，隨后12 000 rpm，4℃離心30 min，取上清溶液即為總蛋白。

1.4.2 Western blot

對(duì)提取的組織蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定（BCA Protein Assay Reagent，美國(guó)Thermo Scientific公司），根據(jù)濃度計(jì)算配樣，上樣量為20μg。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠（美國(guó)life technologies公司）和NuPAGE MOPS SDS電泳緩沖液（美國(guó)life technologies公司）進(jìn)行電泳。之后采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h后，進(jìn)行一抗孵育：p-Nrf2（bs-2013R，1：200）、Nrf2（sc-722，1：200）、Keap1（sc-33569，1：500）、內(nèi)參β-actin（sc-47778，1：1 000），于4℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗脫一抗后進(jìn)行二抗孵育1 h：p-Nrf2（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：5 000）、Nrf2（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：2 000）、Keap1（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：5 000）、β-actin（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1：5 000）、。最后，洗脫二抗后加發(fā)光液用BIORAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影，用其配套軟件進(jìn)行條帶檢測(cè)與分析。讀取灰度值，計(jì)算結(jié)果，公式如下：

1.4.3 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀法測(cè)組織胞漿中Nrf2/Keap1的結(jié)合量。根據(jù)蛋白的濃度，用PBS稀釋到1μg/μl；將1 ml已稀釋的蛋白溶液中加入到含20μl Protein A/G Mix Magnetic Beads（美國(guó)Millipore公司，LSKMAGAG02）的離心管中，4℃搖床2 h，將離心管放到磁力架（美國(guó)Millipore公司），轉(zhuǎn)移上清；向上清中加入5μl Nrf2抗體（sc-30915，santa cruz）（Input中加入Nomal goat IgG），4℃搖床過(guò)夜；次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads，室溫?fù)u床2 h，棄上清，PBS清洗3次，加35 μl上樣緩沖液洗脫，70℃水浴10 min，轉(zhuǎn)移上清液，重復(fù)洗脫第二遍，共吸出上清液70μl。用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠（美國(guó)life technologies公司）上樣30μl進(jìn)行電泳。之后，采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗稀釋液Keap1（sc-33569，1：500），于4℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗脫一抗后加入二抗稀釋液（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：5 000），室溫?fù)u床孵育1 h。最后，洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影。

1.4.4 ROS測(cè)定

采用GENMED試劑盒（中國(guó)上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS10016.3）對(duì)小鼠骨骼肌ROS進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析，用P＜0.05和P＜0.01分別表示具有顯著性和非常顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌 Nrf2/Keap1結(jié)合量的影響

圖1 各組小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量Figure 1 The Nrf2/Keap1 Binding Capacity in Skeletal Muscle of Mice

由圖1可知，H、HT組分別與C組相比，小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1復(fù)合物結(jié)合量顯著性增加。

2.2 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，H、HT組分別與C組相比，小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)量均顯著性降低。

2.3 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，H、HT組分別與C組相比，小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性變化。

2.4 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)量Figure 2 The Expression of Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

圖3 各組小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達(dá)量Figure 3 The Expression of Keap1 in Skeletal Muscle of Mice

由圖4可知，間歇低氧暴露后，H組骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)水平與C組相比顯著性下降；低氧訓(xùn)練后，HT組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)量與C組相比，非常顯著性降低。

2.5 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌活性氧（ROS）的影響

由圖5可知，H組與C組相比，小鼠骨骼肌中ROS水平無(wú)顯著性變化；HT組與C組相比，小鼠骨骼肌ROS水平顯著性升高。

圖4 各組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)量Figure 4 The Expression of p-Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

圖5 各組小鼠骨骼肌ROSFigure 5 The Level of ROS in Skeletal Muscle of Mice

3 分析討論

3.1 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)量和Nrf2/Keap1結(jié)合量的影響

缺氧模擬化合物氯化鈷（CoCl2）處理小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，可促進(jìn)Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，使核內(nèi)Nrf2蛋白含量增加，進(jìn)而上調(diào)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄［6，7］。Nrf2作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，急性運(yùn)動(dòng)后小鼠心臟和骨骼肌細(xì)胞Nrf2核蛋白表達(dá)顯著增加［18，22］。6周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高年輕和年老小鼠心臟細(xì)胞Nrf2核蛋白的水平，從而使抗氧化酶的表達(dá)增強(qiáng)［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)，4周和8周的慢性間歇低氧暴露，小鼠心肌組織中Nrf2表達(dá)水平下降［8］。在本研究中，低氧暴露、低氧訓(xùn)練這兩種干預(yù)作用下，小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)量均顯著性降低，且兩種干預(yù)方式間無(wú)顯著性差異。這種Nrf2蛋白表達(dá)量的降低可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所處低氧環(huán)境的氧濃度有關(guān)。

有研究提出，Keap1與Nrf2的相互作用遵循著“開(kāi)放”和“閉合”不同構(gòu)象的循環(huán)方式?！伴_(kāi)放”構(gòu)象即1個(gè)Nrf2分子結(jié)合1個(gè)Keap1分子；“閉合”構(gòu)象即1個(gè)Nrf2分子結(jié)合兩個(gè)Keap1分子。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，處于安靜“開(kāi)放”狀態(tài)的分子可被誘導(dǎo)呈現(xiàn)為“閉合”態(tài)，從而釋放出1個(gè)游離Nrf2分子，而Keap1結(jié)合數(shù)量仍保持不變，游離Keap1未被釋放［9］。因此，在本研究中，低氧暴露、低氧訓(xùn)練兩種干預(yù)作用下小鼠骨骼肌游離Keap1蛋白表達(dá)無(wú)顯著性變化，可能與此相關(guān)。

Nrf2/Keap1復(fù)合物是Nrf2和Keap1結(jié)合物。在本研究中，低氧暴露、低氧訓(xùn)練兩種干預(yù)作用下，小鼠骨骼肌Nrf2/ Keap1結(jié)合量均顯著增加。說(shuō)明兩種干預(yù)方式使得Nrf2/ Keap1復(fù)合物的解離作用減弱，是造成游離Nrf2蛋白水平降低的重要原因。

3.2 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)和ROS水平的影響

機(jī)體受到氧化應(yīng)激后，Nrf2蛋白磷酸化（p-Nrf2）與Nrf2一樣，在與Keap1解綁、核易位及其靶基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中也可能發(fā)揮著重要調(diào)控作用［10，23］。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠6周游泳運(yùn)動(dòng)后，海馬體的p-Nrf2蛋白表達(dá)增加［12］。而在本研究中，低氧暴露、低氧訓(xùn)練這兩種干預(yù)作用下小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)均降低，且降低程度依次增強(qiáng)，但兩種干預(yù)方式之間并無(wú)顯著變化。Nrf2蛋白磷酸化減少可能也會(huì)造成p-Nrf2與靶基因的ARE結(jié)合活性降低，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。

生物活性小分子ROS是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，正常情況下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除能力之間呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡。運(yùn)動(dòng)、低氧都會(huì)影響機(jī)體ROS的產(chǎn)生［2，24，27］。在本研究中，低氧暴露、低氧訓(xùn)練這兩種干預(yù)作用下，低氧訓(xùn)練組小鼠骨骼肌ROS水平顯著性增加，說(shuō)明p-Nrf2蛋白表達(dá)的非常顯著性降低可能影響了下游抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而使骨骼肌的ROS水平提高。

4 結(jié)論

氧濃度為10%的4周低氧暴露和低氧訓(xùn)練均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解綁作用；且低氧訓(xùn)練組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常顯著性降低，可能是造成ROS水平顯著升高的原因之一。

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Effects of Hypoxia and Hypoxic Training on Nrf2/Keap1 Binding Capacity and p-Nrf2 Expression in Skeletal Muscle of Mice

Objective：NF-E2-related factor 2(Nrf2)－Kelch-like ECH-associated protein-1 (Keapl) signaling pathway is a key pathway of cell oxidative stress reaction. It is generally believed that the long-term hypoxic training could impact oxidation resistance. This research attempts to apply hypoxic training on mice to study the binding capacity of Nrf2/Keap1 and the contents of Nrf2、Keap1、p-Nrf2proteins in skeletal muscle. Methods：The 30 C57BL/6J mice were divided into three groups：control group (C)，hypoxia group (H)，hypoxic training group (HT). The mice ran on treadmill in speed of 12 m/min，1h/d，6d/week，for 4 weeks. Oxygen concentration in hypoxia chamber was 10%. Mice were treated for 4 weeks，8h/d. After both the interventions，the mice were sacrificed and collected skeletal muscle of legs. The expression of Nrf2，Keap1 and p-Nrf2were analyzed by western blot. High quality fluorescence assay was done to detect ROS level in skeletal muscle of mice. Result：Compared with C group，Nrf2/Keap1 binding capacity in skeletal muscle of H、HT groups mice was significantly increased while free Nrf2 and p-Nrf2were significantly reduced respectively；Free Keap1 did not change in skeletal muscle of mice；The ROS level in skeletal muscle of HT group mice significantly increased compared with C group mice. Conclusion：Hypoxia and hypoxic training which oxygen concentration was 10% could reduce the Nrf2/Keap1 unbinding capacity in skeletal muscle of mice. The exerpression of p-Nrf2in skeletal muscle of mice in hypoxic training group was significantly reduced，which may result in marked increase in ROS level.

hypoxia；hypoxic training；Nrf2/Keap1；p-Nrf2

1002-9826（2017）04-0114-05

10. 16470/j. csst. 201704016

G804.2

A

2016-11-28；

2017-05-24

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31471134）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助；北京體育大學(xué)自主課題（2016BS004）。

姬衛(wèi)秀，女，博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌代謝，E-mail：jwx8918@163.com。

張纓，女，北京人，博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌代謝，E-mail：zhyi9256@126.com，Tel：（010）62989584

北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084

Beijing Sports University，Beijing 100084，China.