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    低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和p-Nrf2表達(dá)的影響

    2017-08-01 00:19:22姬衛(wèi)秀何詩(shī)依
    中國(guó)體育科技 2017年4期
    關(guān)鍵詞:骨骼肌低氧抗氧化

    姬衛(wèi)秀,何詩(shī)依,嚴(yán) 露,張 纓

    JI Wei-xiu,HE Shi-yi,YAN Lu,ZHANG Ying

    低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和p-Nrf2表達(dá)的影響

    姬衛(wèi)秀,何詩(shī)依,嚴(yán) 露,張 纓

    JI Wei-xiu,HE Shi-yi,YAN Lu,ZHANG Ying

    目的:轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keapl)信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路。普遍認(rèn)為,長(zhǎng)期低氧訓(xùn)練會(huì)影響抗氧化能力,研究試圖通過(guò)對(duì)小鼠施加低氧暴露、低氧訓(xùn)練兩種方式,探討其對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表達(dá)以及活性氧(ROS)水平的影響。方法:C57BL/6J小鼠30只,分為3組,分別是對(duì)照組(C)、低氧組(H)和低氧訓(xùn)練組(HT)。其中,小鼠跑臺(tái)訓(xùn)練的跑速為12 m/min,1 h/d,6 d/周,持續(xù)4周;低氧濃度為10%,8 h/d,持續(xù)4周。干預(yù)結(jié)束后脫頸處死取后腿兩側(cè)骨骼肌。Western Blot法測(cè)定骨骼肌Nrf2、Keapl和p-Nrf2的蛋白表達(dá)。免疫共沉淀法測(cè)Nrf2/Keap1結(jié)合量。高質(zhì)熒光測(cè)定法檢測(cè)小鼠骨骼肌ROS水平。結(jié)果:與C組相比,H、HT組小鼠骨骼肌中Nrf2/Keap1結(jié)合量顯著升高,游離Nrf2顯著降低,p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低,游離Keap1基本無(wú)變化。WHT組ROS水平顯著高于WC組。結(jié)論:氧濃度為10%的4周低氧暴露和低氧訓(xùn)練均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解綁作用;低氧訓(xùn)練組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常顯著性降低,可能是造成ROS水平顯著升高的原因之一。

    低氧;低氧訓(xùn)練;Nrf2/Keap1;p-Nrf2

    近年來(lái),低氧訓(xùn)練已成為運(yùn)動(dòng)員提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)的重要輔助手段。研究已表明,低氧訓(xùn)練可影響骨骼肌的抗氧化能力[1,3,4,11],但其作用機(jī)制目前并不十分清楚。

    NF-E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)[11,26]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keapl),是Nrf2的調(diào)節(jié)者,對(duì)Nrf2功能起負(fù)調(diào)控作用[19]。在正常情況下,Keapl與Nrf2耦聯(lián),并與肌動(dòng)蛋白結(jié)合被錨定于胞漿中,通過(guò)泛素化介導(dǎo)Nrf2蛋白降解,從而維持細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2處于較低水平[15]。而當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激后,Keap1蛋白上半胱氨酸的巰基易受到破壞,使其構(gòu)象發(fā)生改變,可促進(jìn)Nrf2與Keapl偶聯(lián)作用的解除。同時(shí),氧化應(yīng)激刺激使Nrf2/Keap1復(fù)合物中的Nrf2發(fā)生磷酸化(p-Nrf2),加劇其和Keap1的解離作用,也可使游離Nrf2發(fā)生磷酸化[10,14],從而使Nrf2和P-Nrf2在細(xì)胞漿中聚集,并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與Maf蛋白形成雜化二聚體[25],而后與下游靶基因DNA上的抗氧化元件(ARE)結(jié)合,啟動(dòng)其靶基因的轉(zhuǎn)錄,成為許多抗氧化基因的開(kāi)關(guān)[17,20]。

    運(yùn)動(dòng)可以激活Nrf2-ARE通路,增強(qiáng)心肌的抗氧化防御能力,但Nrf2敲除鼠這種作用減弱[22]。也有研究發(fā)現(xiàn),急性運(yùn)動(dòng)可使小鼠骨骼肌細(xì)胞核Nrf2的蛋白表達(dá)升高[5]。在低氧環(huán)境中,機(jī)體細(xì)胞缺氧,會(huì)產(chǎn)生一系列的反應(yīng)。低氧預(yù)處理可以激活Nrf2及其靶基因的表達(dá),從而提高大鼠胚胎心肌細(xì)胞的生物學(xué)功能及抗缺氧能力[16]。沉默Nrf2基因后,低氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞的體外增殖活動(dòng)減少[28]。但也有研究表明,慢性間歇性低氧暴露4周和8周小鼠心肌組織中Nrf2表達(dá)水平下降[8]。在氧濃度為零的極度缺氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h的人類晶狀體上皮細(xì)胞,其Nrf2蛋白和mRNA表達(dá)降低,導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞蛋白破壞[29]。

    由上可知,低氧與Nrf2關(guān)系密切。然而,低氧暴露和低氧訓(xùn)練如何影響骨骼肌的Nrf2信號(hào)及其抗氧化作用,目前并不十分清楚。因此,本研究試圖通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以Nrf2/Keap1復(fù)合物為切入點(diǎn),探討4周低氧暴露和低氧訓(xùn)練,對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表達(dá)以及活性氧(ROS)水平的影響,為低氧訓(xùn)練影響骨骼肌抗氧化作用的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠(購(gòu)于維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證書:SCX-K(京)2009-0004)30只,按體重隨機(jī)分為3組,分別是對(duì)照組(C組),低氧暴露組(H組),低氧訓(xùn)練組(HT組),每組10只。小鼠體重(18.37±2.26)g,每籠3~4只飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動(dòng)物房,動(dòng)物房溫度保持在20~25℃,相對(duì)濕度保持在50%~70%,每天光照12 h(7:00~19:00),3組動(dòng)物均自由進(jìn)食和飲水。

    1.2 干預(yù)方案

    低氧暴露組小鼠每天暴露在常壓低氧環(huán)境中8 h(8:00~16:00),氧氣濃度為10%,持續(xù)4周;通過(guò)制氮機(jī)(北京創(chuàng)文氣體有限公司)、凍干機(jī)(杭州超濾)和空氣壓縮機(jī)(美國(guó)英格索蘭)共同作用將空氣中的氮?dú)馔ㄈ雱?dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)達(dá)到相應(yīng)氧濃度;低氧訓(xùn)練組的低氧環(huán)境與低氧組相同,并在低氧環(huán)境下進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),經(jīng)過(guò)兩天的適應(yīng)性訓(xùn)練后,進(jìn)行正式訓(xùn)練,其中,跑速12m/min,坡度為0,每天1 h,每周6天,持續(xù)4周。

    1.3 取材

    最后一次訓(xùn)練結(jié)束后,休息48 h脫頸處死,迅速取兩側(cè)腿部骨骼肌,用錫紙包裹標(biāo)記,投于液氮,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備后續(xù)之用。

    1.4 指標(biāo)測(cè)定

    1.4.1 提取總蛋白

    取100 mg組織,加入800μl含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液,超聲勻漿,冰上靜置30 min,隨后12 000 rpm,4℃離心30 min,取上清溶液即為總蛋白。

    1.4.2 Western blot

    對(duì)提取的組織蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定(BCA Protein Assay Reagent,美國(guó)Thermo Scientific公司),根據(jù)濃度計(jì)算配樣,上樣量為20μg。采用Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝膠(美國(guó)life technologies公司)和NuPAGE MOPS SDS電泳緩沖液(美國(guó)life technologies公司)進(jìn)行電泳。之后采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h后,進(jìn)行一抗孵育:p-Nrf2(bs-2013R,1:200)、Nrf2(sc-722,1:200)、Keap1(sc-33569,1:500)、內(nèi)參β-actin(sc-47778,1:1 000),于4℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗脫一抗后進(jìn)行二抗孵育1 h:p-Nrf2(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301,1:5 000)、Nrf2(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301,1:2 000)、Keap1(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301,1:5 000)、β-actin(羊抗鼠,中科晨宇,164017,1:5 000)、。最后,洗脫二抗后加發(fā)光液用BIORAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影,用其配套軟件進(jìn)行條帶檢測(cè)與分析。讀取灰度值,計(jì)算結(jié)果,公式如下:

    1.4.3 免疫共沉淀

    采用免疫共沉淀法測(cè)組織胞漿中Nrf2/Keap1的結(jié)合量。根據(jù)蛋白的濃度,用PBS稀釋到1μg/μl;將1 ml已稀釋的蛋白溶液中加入到含20μl Protein A/G Mix Magnetic Beads(美國(guó)Millipore公司,LSKMAGAG02)的離心管中,4℃搖床2 h,將離心管放到磁力架(美國(guó)Millipore公司),轉(zhuǎn)移上清;向上清中加入5μl Nrf2抗體(sc-30915,santa cruz)(Input中加入Nomal goat IgG),4℃搖床過(guò)夜;次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads,室溫?fù)u床2 h,棄上清,PBS清洗3次,加35 μl上樣緩沖液洗脫,70℃水浴10 min,轉(zhuǎn)移上清液,重復(fù)洗脫第二遍,共吸出上清液70μl。用Bolt 4%~12% Bis-Tris Plus凝膠(美國(guó)life technologies公司)上樣30μl進(jìn)行電泳。之后,采用美國(guó)Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶封閉1 h后,加入一抗稀釋液Keap1(sc-33569,1:500),于4℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗脫一抗后加入二抗稀釋液(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301,1:5 000),室溫?fù)u床孵育1 h。最后,洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影。

    1.4.4 ROS測(cè)定

    采用GENMED試劑盒(中國(guó)上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,GMS10016.3)對(duì)小鼠骨骼肌ROS進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析,用P<0.05和P<0.01分別表示具有顯著性和非常顯著性差異。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌 Nrf2/Keap1結(jié)合量的影響

    圖1 各組小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量Figure 1 The Nrf2/Keap1 Binding Capacity in Skeletal Muscle of Mice

    由圖1可知,H、HT組分別與C組相比,小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1復(fù)合物結(jié)合量顯著性增加。

    2.2 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)的影響

    由圖2可知,H、HT組分別與C組相比,小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)量均顯著性降低。

    2.3 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達(dá)的影響

    由圖3可知,H、HT組分別與C組相比,小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性變化。

    2.4 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)的影響

    圖2 各組小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)量Figure 2 The Expression of Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

    圖3 各組小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達(dá)量Figure 3 The Expression of Keap1 in Skeletal Muscle of Mice

    由圖4可知,間歇低氧暴露后,H組骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)水平與C組相比顯著性下降;低氧訓(xùn)練后,HT組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)量與C組相比,非常顯著性降低。

    2.5 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌活性氧(ROS)的影響

    由圖5可知,H組與C組相比,小鼠骨骼肌中ROS水平無(wú)顯著性變化;HT組與C組相比,小鼠骨骼肌ROS水平顯著性升高。

    圖4 各組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)量Figure 4 The Expression of p-Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

    圖5 各組小鼠骨骼肌ROSFigure 5 The Level of ROS in Skeletal Muscle of Mice

    3 分析討論

    3.1 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)量和Nrf2/Keap1結(jié)合量的影響

    缺氧模擬化合物氯化鈷(CoCl2)處理小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,可促進(jìn)Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核,使核內(nèi)Nrf2蛋白含量增加,進(jìn)而上調(diào)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄[6,7]。Nrf2作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者,急性運(yùn)動(dòng)后小鼠心臟和骨骼肌細(xì)胞Nrf2核蛋白表達(dá)顯著增加[18,22]。6周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高年輕和年老小鼠心臟細(xì)胞Nrf2核蛋白的水平,從而使抗氧化酶的表達(dá)增強(qiáng)[13]。也有研究發(fā)現(xiàn),4周和8周的慢性間歇低氧暴露,小鼠心肌組織中Nrf2表達(dá)水平下降[8]。在本研究中,低氧暴露、低氧訓(xùn)練這兩種干預(yù)作用下,小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達(dá)量均顯著性降低,且兩種干預(yù)方式間無(wú)顯著性差異。這種Nrf2蛋白表達(dá)量的降低可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所處低氧環(huán)境的氧濃度有關(guān)。

    有研究提出,Keap1與Nrf2的相互作用遵循著“開(kāi)放”和“閉合”不同構(gòu)象的循環(huán)方式?!伴_(kāi)放”構(gòu)象即1個(gè)Nrf2分子結(jié)合1個(gè)Keap1分子;“閉合”構(gòu)象即1個(gè)Nrf2分子結(jié)合兩個(gè)Keap1分子。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí),處于安靜“開(kāi)放”狀態(tài)的分子可被誘導(dǎo)呈現(xiàn)為“閉合”態(tài),從而釋放出1個(gè)游離Nrf2分子,而Keap1結(jié)合數(shù)量仍保持不變,游離Keap1未被釋放[9]。因此,在本研究中,低氧暴露、低氧訓(xùn)練兩種干預(yù)作用下小鼠骨骼肌游離Keap1蛋白表達(dá)無(wú)顯著性變化,可能與此相關(guān)。

    Nrf2/Keap1復(fù)合物是Nrf2和Keap1結(jié)合物。在本研究中,低氧暴露、低氧訓(xùn)練兩種干預(yù)作用下,小鼠骨骼肌Nrf2/ Keap1結(jié)合量均顯著增加。說(shuō)明兩種干預(yù)方式使得Nrf2/ Keap1復(fù)合物的解離作用減弱,是造成游離Nrf2蛋白水平降低的重要原因。

    3.2 低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)和ROS水平的影響

    機(jī)體受到氧化應(yīng)激后,Nrf2蛋白磷酸化(p-Nrf2)與Nrf2一樣,在與Keap1解綁、核易位及其靶基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中也可能發(fā)揮著重要調(diào)控作用[10,23]。有研究發(fā)現(xiàn),大鼠6周游泳運(yùn)動(dòng)后,海馬體的p-Nrf2蛋白表達(dá)增加[12]。而在本研究中,低氧暴露、低氧訓(xùn)練這兩種干預(yù)作用下小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達(dá)均降低,且降低程度依次增強(qiáng),但兩種干預(yù)方式之間并無(wú)顯著變化。Nrf2蛋白磷酸化減少可能也會(huì)造成p-Nrf2與靶基因的ARE結(jié)合活性降低,從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。

    生物活性小分子ROS是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物,正常情況下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除能力之間呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡。運(yùn)動(dòng)、低氧都會(huì)影響機(jī)體ROS的產(chǎn)生[2,24,27]。在本研究中,低氧暴露、低氧訓(xùn)練這兩種干預(yù)作用下,低氧訓(xùn)練組小鼠骨骼肌ROS水平顯著性增加,說(shuō)明p-Nrf2蛋白表達(dá)的非常顯著性降低可能影響了下游抗氧化酶的表達(dá),進(jìn)而使骨骼肌的ROS水平提高。

    4 結(jié)論

    氧濃度為10%的4周低氧暴露和低氧訓(xùn)練均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解綁作用;且低氧訓(xùn)練組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常顯著性降低,可能是造成ROS水平顯著升高的原因之一。

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    Effects of Hypoxia and Hypoxic Training on Nrf2/Keap1 Binding Capacity and p-Nrf2 Expression in Skeletal Muscle of Mice

    Objective:NF-E2-related factor 2(Nrf2)-Kelch-like ECH-associated protein-1 (Keapl) signaling pathway is a key pathway of cell oxidative stress reaction. It is generally believed that the long-term hypoxic training could impact oxidation resistance. This research attempts to apply hypoxic training on mice to study the binding capacity of Nrf2/Keap1 and the contents of Nrf2、Keap1、p-Nrf2proteins in skeletal muscle. Methods:The 30 C57BL/6J mice were divided into three groups:control group (C),hypoxia group (H),hypoxic training group (HT). The mice ran on treadmill in speed of 12 m/min,1h/d,6d/week,for 4 weeks. Oxygen concentration in hypoxia chamber was 10%. Mice were treated for 4 weeks,8h/d. After both the interventions,the mice were sacrificed and collected skeletal muscle of legs. The expression of Nrf2,Keap1 and p-Nrf2were analyzed by western blot. High quality fluorescence assay was done to detect ROS level in skeletal muscle of mice. Result:Compared with C group,Nrf2/Keap1 binding capacity in skeletal muscle of H、HT groups mice was significantly increased while free Nrf2 and p-Nrf2were significantly reduced respectively;Free Keap1 did not change in skeletal muscle of mice;The ROS level in skeletal muscle of HT group mice significantly increased compared with C group mice. Conclusion:Hypoxia and hypoxic training which oxygen concentration was 10% could reduce the Nrf2/Keap1 unbinding capacity in skeletal muscle of mice. The exerpression of p-Nrf2in skeletal muscle of mice in hypoxic training group was significantly reduced,which may result in marked increase in ROS level.

    hypoxia;hypoxic training;Nrf2/Keap1;p-Nrf2

    1002-9826(2017)04-0114-05

    10. 16470/j. csst. 201704016

    G804.2

    A

    2016-11-28;

    2017-05-24

    國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31471134);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助;北京體育大學(xué)自主課題(2016BS004)。

    姬衛(wèi)秀,女,博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌代謝,E-mail:jwx8918@163.com。

    張纓,女,北京人,博士,博士研究生導(dǎo)師,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌代謝,E-mail:zhyi9256@126.com,Tel:(010)62989584

    北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084

    Beijing Sports University,Beijing 100084,China.

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