心臟肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因c.G772A突變與家族性肥厚型心肌病

邢曉博，劉福頌，王芳，宋雷，趙雯娜，劉杰，張克傳，朱玉召，劉歆，袁帥，孫璐，尚興福，李榮，梁琰，李曉，樊光紅，張長(zhǎng)青

心臟肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因c.G772A突變與家族性肥厚型心肌病

邢曉博，劉福頌*，王芳，宋雷，趙雯娜，劉杰，張克傳，朱玉召，劉歆，袁帥，孫璐，尚興福，李榮，梁琰，李曉，樊光紅，張長(zhǎng)青

目的：研究中國(guó)人肥厚型心肌?。℉CM） 患者致病基因突變位點(diǎn)，并分析基因型與臨床表型的關(guān)系。

方法：在HCM家系中利用靶向外顯子捕獲測(cè)序的方法對(duì)HCM先證者的30個(gè)與遺傳性心肌病相關(guān)的基因進(jìn)行全外顯子擴(kuò)增和高通量測(cè)序，進(jìn)一步通過(guò)Sanger測(cè)序法在家系內(nèi)及200例健康志愿者中進(jìn)行驗(yàn)證。家系調(diào)查資料包括臨床表現(xiàn)、體格檢查、心電圖及超聲心動(dòng)圖。

結(jié)果：該家系6例有血緣關(guān)系的研究對(duì)象中3例攜帶心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因（MYBPC3） c.G772A雜合突變，該突變位點(diǎn)位于MYBPC3的258位的谷氨酸（E）變?yōu)橘?lài)氨酸（K）。其余家系成員未發(fā)現(xiàn)此突變。200例健康志愿者中未見(jiàn)異常。先證者及其女兒發(fā)病年齡晚且均伴有心悸、胸悶的癥狀，超聲心動(dòng)圖示室間隔基底段增厚（16~18 mm）。先證者目前伴有陣發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速惡性心律失常及心力衰竭，左心室流出道最大壓差為56 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），屬于猝死高危人群。

結(jié)論：全面基因檢測(cè)有利于臨床危險(xiǎn)分層及早診治。MYBPC3 的剪切位點(diǎn)突變c.G772A可能是該HCM家系的致病突變。

心肌病，肥厚性；基因突變

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:680.)

肥厚型心肌?。℉CM）是最常見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性心肌病，以編碼肌小節(jié)蛋白基因突變引起的收縮力產(chǎn)生缺陷為主要病因，涉及至少20個(gè)基因和1 400多個(gè)突變位點(diǎn)，發(fā)病率約為1:500[1，2]。心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因（MYBPC3）是HCM的主要致病基因，約占15%~25%。 MYBPC3突變的HCM患者心肌肥厚出現(xiàn)晚、癥狀輕，不利于臨床診斷，由此可能延誤病情，而基因診斷是有用的手段之一[3-5]。HCM人群發(fā)病率高，有潛在兇險(xiǎn)表型，本研究通過(guò)高通量靶向捕獲測(cè)序在一家系發(fā)現(xiàn)MYBPC3 c.G772A，分析突變基因型與臨床表型的關(guān)系，為HCM危險(xiǎn)分層及治療評(píng)估提供了依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及臨床資料收集

選擇中國(guó)漢族家族性HCM一家系（圖1），臨床資料包括體檢、心電圖、超聲心動(dòng)圖等結(jié)果。HCM診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2011年美國(guó)心臟病學(xué)院基金會(huì)（ACCF）/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)（AHA）HCM診斷和治療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即臨床上不能解釋的、無(wú)心室腔擴(kuò)張的左心室肥厚（超聲心動(dòng)圖示左心室壁厚度≥15 mm），且無(wú)其他導(dǎo)致心室肥厚的心臟疾病或系統(tǒng)性疾病[6]。同時(shí)滿(mǎn)足2014年歐洲心臟病學(xué)會(huì)HCM診斷與治療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。選擇200例健康志愿者為正常對(duì)照，所有研究對(duì)象已簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

提取基因組DNA: 采集HCM患者及正常對(duì)照者外周靜脈血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管中備用，采用吸附法DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit , QIAGEN公司，德國(guó)）提取血液樣本中的DNA，經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳鑒定樣本DNA質(zhì)量合格后置-20℃冰箱中保存。

基因分析：用3.0 μg DNA作為起始，根據(jù)Agilent’s SureSelect XT target enrichment system的實(shí)驗(yàn)流程來(lái)制備文庫(kù)，再使用設(shè)計(jì)好的探針（諾心安panel Bestnovo公司，中國(guó)）對(duì)目標(biāo)區(qū)域完成捕獲，利用靶向外顯子捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)30個(gè)與遺傳性心肌病相關(guān)的基因按照Illumina-SolexaHiSeq2000程序裝置進(jìn)行第2代測(cè)序（ Next generation sequencing NGS），測(cè)序儀器為MiSeq System（Illumina公司，美國(guó)）。運(yùn)用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq程序來(lái)分析測(cè)序結(jié)果，明確突變位點(diǎn)，進(jìn)一步通過(guò)一代測(cè)序（Sanger測(cè)序法）在家系主要成員及200例健康志愿者中進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1測(cè)序結(jié)果（圖1、2）

在人類(lèi)基因組變異協(xié)會(huì)（HGVS）標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上與參考基因組NCBI Genome（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome）比對(duì)，并綜合考慮人群頻率數(shù) 據(jù) 庫(kù) Exome Aggregation Consortium（http://exac. broadinstitute.org/）/1000 Genomes Project和致病性數(shù)據(jù) 庫(kù) ClinVar（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）/ OMIM（http://www.omim.org），由我們的遺傳咨詢(xún)團(tuán)隊(duì)評(píng)估得出結(jié)果。3例患者攜帶MYBPC3 c.G772A，使258位的谷氨酸（E）變?yōu)橘?lài)氨酸（K）。該突變點(diǎn)為高度保守序列。其余家系成員不攜帶突變基因，200例正常對(duì)照者中未見(jiàn)異常。

2.2家系成員臨床表現(xiàn)（表1）

該家系中先證者（I-2）為75歲女性患者，因“反復(fù)發(fā)作心悸、胸悶10年”就診。24 h動(dòng)態(tài)心電圖示陣發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速（室速）。超聲心動(dòng)圖示收縮期前向運(yùn)動(dòng)（SAM）征陽(yáng)性，最大室壁厚度18.3 mm，左心室短軸縮短率（FS）35%，左心室舒張功能減退。冠狀動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層血管攝影術(shù)示符合冠狀動(dòng)脈硬化表現(xiàn)，右冠狀動(dòng)脈走行區(qū)見(jiàn)點(diǎn)狀鈣化，相應(yīng)管腔未見(jiàn)明顯變窄，左冠狀動(dòng)脈無(wú)異常。先證者女兒（II-2），50歲，因“反復(fù)發(fā)作心悸、胸悶5年”就診。 超聲心動(dòng)圖示SAM征陽(yáng)性，最大室壁厚度18.0 mm，F(xiàn)S 36%，左心室舒張功能減退。冠狀動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層血管攝影術(shù)示符合冠狀動(dòng)脈硬化表現(xiàn)，左冠狀動(dòng)脈回旋支近端似斑塊形成并狹窄，遠(yuǎn)端閉塞。

表1 攜帶MYBPC3基因c.G772A突變的HCM家系成員臨床資料

圖1 一家族性肥厚型心肌病家系系譜圖

圖2 測(cè)序結(jié)果圖

3 討論

MYBPC3 編碼心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白 C，該蛋白僅在心肌中表達(dá)，其C1 IgI區(qū)C2 IgI區(qū)連接部稱(chēng)“基序（motif）”區(qū)，系9個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是環(huán)磷酸腺苷依賴(lài)性蛋白激酶A及鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶進(jìn)行底物可逆性磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)，其磷酸化可調(diào)節(jié)心肌收縮[8]。該HCM家系攜帶MYBPC3 c.G772A，是C1IgI區(qū)6外顯子最后一個(gè)核苷酸剪切位點(diǎn)突變，導(dǎo)致258位的谷氨酸（E）變?yōu)橘?lài)氨酸（K），為罕見(jiàn)變異，其在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP6500 數(shù)據(jù)庫(kù)均無(wú)人群頻率報(bào)道，ExAC 數(shù)據(jù)庫(kù)的人群頻率為 0.00003903。該變異曾被多個(gè)研究表明是HCM的致病變異，MYBPC3 c.G772A攜帶者部分為家系篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)存在心肌肥厚， 有些攜帶者則并無(wú)明顯心肌肥厚等異常，外顯率不完全，并且發(fā)病與年齡有關(guān)，隨著年齡增加而外顯率增加[9-11]。Marston等[12]研究發(fā)現(xiàn)攜帶該變異的患者心肌組織中的心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白 C 含量下降了24%，由于單倍劑量不足而致病。

本家系資料表明，該位點(diǎn)突變?cè)谶@一家系中的特點(diǎn)為臨床發(fā)病晚（先證者66歲發(fā)病，其女兒46歲發(fā)病，其兒子在47歲還未發(fā)病），與既往研究“MYBPC3基因突變攜帶者發(fā)病較晚（＞40歲）且中老年發(fā)病多見(jiàn)”一致[13-14]。值得注意的是，雖然HCM自然病程存在明顯的異質(zhì)性，大約25%的患者臨床無(wú)癥狀或僅有輕微的癥狀，并可以享有正常的壽命（75歲以上），但最終大多數(shù)患者會(huì)發(fā)生心力衰竭、心房顫動(dòng)導(dǎo)致卒中甚至猝死[15-16]。該研究中先證者晚年發(fā)病開(kāi)始疑診為冠心病，提示基因突變篩查是HCM診斷的重要補(bǔ)充。2014年歐洲心臟病學(xué)會(huì)HCM診斷和管理指南指出，HCM是臨床和基因表現(xiàn)復(fù)雜的疾病，基因檢測(cè)有利于HCM的診斷、危險(xiǎn)分層及心臟性猝死的早期預(yù)警，建議強(qiáng)化基因檢測(cè)和遺傳咨詢(xún)，在進(jìn)行家系的臨床篩查時(shí)，尤其年輕攜帶者，建議制定長(zhǎng)期的隨訪(fǎng)計(jì)劃[7]。

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Relationship Between Cardiac Myosin-binding Protein c.G772A Gene Mutation and Familial Hypertrophic Cardiomyopathy

XING Xiao-bo, LIU Fu-song, WANG Fang, SONG Lei, ZHAO Wen-na, LIU Jie, ZHANG Ke-chuan, ZHU Yu-zhao, LIU Xin, YUAN Shuai, SUN Lu, SHANG Xing-fu, LI Rong, LIANG Yan, LI Xiao, FAN Guang-hong, ZHANG Chang-qing.
Department of Cardiology, The Third People’s Hospital of Qingdao City, Qingdao (266004), Shandong, China

WANG Fang, Email: wf8522@126.com

Objective: To investigate the mutation site of pathogenic gene in patients with hypertrophic cardiomyopathy (HCM) and to analyze the relationship between the genotype and clinical phenotype.

Methods: Targeted exon capture sequencing was conducted in a HCM proband for 30 coding exons related HCM gene by all exon amplification and high-throughput sequencing. Furthermore, Sanger sequencing was performed in other family member and in 200 healthy volunteers for verification. The familial investigation included in clinical presentation, physical examination, electrocardiogram and echocardiography.

Results: There were 3/6 blood relatives carrying cardiac myosin-binding protein gene MyBPC3 G772A heterozygous mutation, the mutation site was at 258 amino acid of MyBPC3 as glutamic acid (Glu) was substitute to lysine (Lys), such mutation was not found in rest of family member and not in healthy volunteers. The onset of proband and her daughter was rather late, they had palpitation and chest tightness; echocardiography showed interventricular septum basal segment thickening (16-18) mm. Proband was complicating paroxysmal ventricular tachycardia, malignantarrhythmia and heart failure, the maximum pressure gradient of left ventricular outflow was 56 mmHg, which with the high risk for sudden death.

Conclusion: Comprehensive gene test has been helpful for clinical stratification, early diagnosis and treatment. MYBPC3 site mutation c.G772A might be the pathogenic mutation in that specific HCM family.

Cardiomyopathy, hypertrophic; Gene; Mutation

2016-08-20）

（編輯：常文靜）

青島市科研計(jì)劃（2015-WJZD061）

266041 山東省，青島市第三人民醫(yī)院 心內(nèi)科（邢曉博 、劉福頌、王芳、趙雯娜、劉杰、劉歆、袁帥、孫璐、尚興福、李榮、梁琰、李曉、樊光紅、張長(zhǎng)青），檢驗(yàn)科（張克傳），特檢科（朱玉召）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院 高血壓診治中心（宋雷）

邢曉博 主任醫(yī)師 學(xué)士 主要研究方向冠心病、高血壓和肥厚型心肌病 Email：13668884192@126.com 通訊作者：王芳 Email： wf8522@126.com*劉福頌為共同第一作者

R596

A

1000-3614（2017）07-0680-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.07.014