中－低劑量阿托伐他汀對(duì)急性心肌缺血性損傷中內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

王亮，鐘武，陳睦虎

中－低劑量阿托伐他汀對(duì)急性心肌缺血性損傷中內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

王亮，鐘武，陳睦虎

目的：通過(guò)研究?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）增殖、遷移、分化及細(xì)胞因子的分泌，探討中－低劑量的阿托伐他汀對(duì)急性心肌缺血性損傷患者的外周血EPC的影響。

方法：選擇急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者80例，根據(jù)服用阿托伐他汀的劑量不同，隨機(jī)分為觀察組（阿托伐他汀40 mg）和對(duì)照組（阿托伐他汀20 mg），每組各40例。采用四唑鹽（MTT）比色法、流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的方法，檢測(cè)藥物治療前后不同時(shí)間點(diǎn)STEMI患者體內(nèi)循環(huán)的EPC細(xì)胞數(shù)量、增殖能力和細(xì)胞因子的分泌。

結(jié)果：觀察組和對(duì)照組阿托伐他汀治療2周內(nèi)均使EPC明顯增殖，遷移能力有較大改變。治療期間細(xì)胞因子的分泌表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、趨化因子4（CXCR4）出現(xiàn)先增加后減少，但沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）持續(xù)增加。各組數(shù)據(jù)顯示觀察組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：STEMI患者服用中－低劑量的阿托伐他汀能有效改善EPC的增殖和遷移能力，增加了CXCR4、VEGF、bFGF及SIRT1的表達(dá)。

心肌缺血；內(nèi)皮祖細(xì)胞；降血脂藥

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:697.)

急性冠狀動(dòng)脈（冠脈）供血不足導(dǎo)致心臟供氧量減少，從而發(fā)生心肌缺血性損傷。在此過(guò)程中，不同程度缺血的心肌細(xì)胞與正常的心肌細(xì)胞之間生化功能和電功能等均發(fā)生改變。從而出現(xiàn)心電活動(dòng)的延遲、紊亂等[1]。正常情況下，機(jī)體可通過(guò)自身調(diào)節(jié)，保持心臟正常工作，但是由疾病產(chǎn)生的急性心肌缺血性損傷將導(dǎo)致長(zhǎng)期的冠脈供血不足，致使心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷[2]。目前，心肌缺血的患病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)，有效地預(yù)防和治療早期心肌缺血顯得尤為重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是一類在血液中循環(huán)并能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。EPC主要參與血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和血管新生，維持血管內(nèi)皮的完整性，生成新的血管。近年來(lái)，EPC的研究成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，為缺血性心臟病的治療提供了新思路[3]。大量研究表明，他汀類藥物能降低血管氧化應(yīng)激，改善和恢復(fù)內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)免疫活性，穩(wěn)定斑塊，促進(jìn)缺血組織的新血管生成[4]。本研究觀察阿托伐他汀對(duì)急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者EPC 增殖、遷移和細(xì)胞因子分泌等的影響，進(jìn)一步明確他汀類藥物的作用機(jī)制，為急性心肌缺血性損傷的防治提供有效治療策略。

1 材料與方法

研究對(duì)象：選擇2015-02至2015-08期間我院心血管內(nèi)科收治的STEMI患者80例，依據(jù)《2012年歐洲心臟病學(xué)會(huì)STEMI管理指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，根據(jù)所服用阿托伐他?。ㄉ唐访毫⑵胀?，美國(guó)輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)）的劑量不同，分為觀察組（阿托伐他汀40 mg，n=40）和對(duì)照組（阿托伐他汀20 mg，n=40）。兩組患者在冠脈血管病變程度、置入支架數(shù)、血管病變長(zhǎng)度及管腔狹窄程度等方面無(wú)差異。所有患者接受經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI），每日按照劑量要求口服阿托伐他汀。入選患者均為初始接受他汀類藥物治療，排除不明原因的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）持續(xù)性升高或活動(dòng)性肝病患者以及用藥過(guò)程中肌酸激酶（CK）嚴(yán)重升高的患者等。

阿托伐他汀對(duì)外周血EPC數(shù)目的影響：每例患者在治療前、治療后第15、30、60、90、120天6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取外周血20 ml，ficoil 梯度離心。將其鋪在包被有人纖連蛋白（h-FBN，5μg/cm2）的24孔板上，用Lonza EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)4天后細(xì)胞換液，除去懸浮的細(xì)胞。第7天收集貼壁細(xì)胞。用DiL標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―ilacLDL，終濃度2.4 mg/L）37℃孵育1 h，4%多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗。再用異硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記的荊豆凝集素IFITC-UEA-I（終濃度10 mg/L）37℃孵育1 h。PBS（PH=7.4）清洗一遍后在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算10個(gè)視野（×200）EPC 雙染陽(yáng)性細(xì)胞。

阿托伐他汀對(duì)外周血EPC生物學(xué)功能的影響：（1）MTT檢測(cè)EPC細(xì)胞增殖能力：取第7天的貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù)，將5×103個(gè)細(xì)胞接種到包被纖連蛋白的96孔培養(yǎng)板，過(guò)夜，每孔加10μl MTT（5 mg/ml），培養(yǎng)4 h后，吸掉上清液，加入二甲基亞砜（150μl/ well），酶標(biāo)儀上490 nm 波長(zhǎng)讀數(shù)。（2）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPC的遷移能力：在下室底部涂上一層纖連蛋白，晾干后，將25μl Lonza EGM-2 培養(yǎng)基添加到內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF-165，終濃度為50 ng/μl加入下室。再將2×104個(gè) EPC 懸浮在50μl 培養(yǎng)基中，注入上室。37℃培養(yǎng)24 h后，去掉上室，甲醇固定，Giemsa 染色，隨機(jī)選擇3個(gè)顯微鏡視野下，觀察EPC的數(shù)目。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法檢測(cè)EPC 細(xì)胞因子分泌：通過(guò)檢測(cè)不同劑量的阿托伐他汀對(duì)EPC細(xì)胞因子趨化因子受體4（CXCR4）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）分泌的影響，判斷EPC的增殖、內(nèi)皮修復(fù)等情況。時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為服藥前及服藥后第15、30、60、90、120天。VEGF可直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、增殖及分裂，增加微血管通透性，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。CXCR4是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）的受體，高度保守。SDF-1介導(dǎo)趨化反應(yīng)，其表達(dá)量由CXCR4的表達(dá)水平?jīng)Q定。CXCR4表達(dá)量越高，SDF-1誘導(dǎo)發(fā)生EPC 發(fā)生的遷移細(xì)胞越多。bFGF是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的異構(gòu)體，參與內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新血管形成，修復(fù)損害的內(nèi)皮細(xì)胞。SIRT1與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關(guān)，可抵抗內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。取專用酶標(biāo)版，包被一抗后4℃冰箱孵育過(guò)夜。洗板后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。37℃孵育1 h。洗板，每孔加入酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。洗板，加入底物，與酶反應(yīng)后顯色30 min，最后加入檸檬酸中止反應(yīng)。450 nm波長(zhǎng)讀數(shù)，測(cè)吸光值（OD），描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以 ±s 表示。兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EPC 鑒定結(jié)果（圖1）

人纖連蛋白對(duì)EPC有特殊的親和力，增加EPC細(xì)胞的貼壁。培養(yǎng)7天收集的細(xì)胞用Dil-acLDL和FITC-UEA-I雙染，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察到，細(xì)胞同時(shí)被染成紅色（DiI-AcLDL染色）和綠色（FITC-UEA-I染色），此類細(xì)胞為早期分化的EPC。倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)取15個(gè)視野，儀器自動(dòng)分析統(tǒng)計(jì)雙染陽(yáng)性的細(xì)胞，再進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算總細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算雙染陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。結(jié)果為約90%的貼壁細(xì)胞為EPC。

2.2阿托伐他汀對(duì)EPC生物學(xué)功能的影響（表2）

MTT 方法檢測(cè)EPC的增殖和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組與對(duì)照組患者術(shù)后應(yīng)用阿托伐他汀治療2周和4周EPC增殖能力均較治療前增強(qiáng)（P<0.01），但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞染色鑒定

2.3細(xì)胞因子分泌結(jié)果（圖2）

CXCR4的分泌濃度在治療30天時(shí)達(dá)高峰，然后逐漸減少。說(shuō)明與觀察組比較，對(duì)照組細(xì)胞遷移及歸巢能力更好。SIRT1不斷增加，且對(duì)照組略高于觀察組。VEGF、bFGF分泌量先增加，后減少，在治療60天時(shí)濃度曲線達(dá)到高峰?？紤]這與早期血管內(nèi)膜急性損傷、調(diào)動(dòng)激活外周循環(huán)EPC有關(guān)。

表2 兩組EPC增殖和遷移的結(jié)果比較（±s）

圖2 觀察組（40 mg） 和對(duì)照組（20 mg） 趨化因子受體4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、沉默調(diào)節(jié)蛋白1的分泌

3 討論

冠脈介入治療已成為當(dāng)前治療急性心肌梗死最行之有效的方法之一，但是術(shù)后選擇合適的藥物及相應(yīng)的劑量是防止病變血管發(fā)生再狹窄的關(guān)鍵。他汀類藥物在降低血脂、恢復(fù)血管內(nèi)皮功能、降低氧化應(yīng)激、降低血管炎癥、降低血栓形成和調(diào)節(jié)免疫活性、穩(wěn)定粥樣斑塊等方面有良好的表現(xiàn)。他汀類是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的抑制劑，能使膽固醇的合成減少，清除增加，顯著降低血清總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度，被廣泛應(yīng)用于臨床和科學(xué)研究。眾多研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在治療過(guò)程中能促進(jìn)EPC的增殖和分化[5-7]。EPC即內(nèi)皮細(xì)胞分化的前身，起源于骨髓，在血液中循環(huán)，參與受損的內(nèi)皮細(xì)胞與組織的修復(fù)，促進(jìn)動(dòng)物缺血組織的新生血管生成[8]。在心肌急性缺血時(shí)，EPC能招募骨髓和血液循環(huán)系統(tǒng)中的EPC進(jìn)入缺血區(qū)，對(duì)損傷的血管內(nèi)膜進(jìn)行修復(fù)。在修復(fù)的過(guò)程中，分泌一些細(xì)胞因子，誘導(dǎo)新血管的再生，加速血管的內(nèi)皮化。有研究表明，血液中循環(huán)的EPC的數(shù)量減少，可用于預(yù)測(cè)未來(lái)的心血管事件[9]。內(nèi)皮祖細(xì)胞在分化過(guò)程中可分為早期或晚期EPC。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，體外培養(yǎng)原代EPC，4~7 天內(nèi)出現(xiàn)早期分化的EPC，在21 天后則逐漸發(fā)展為晚期分化的EPC[10,11]。早期分化的EPC可能表現(xiàn)在為周圍組織提供營(yíng)養(yǎng)支持，而晚期EPC則多分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管的修復(fù)[12,13]。研究急性心肌梗死患者術(shù)后長(zhǎng)期服用不同劑量的他汀類藥物體內(nèi)EPC的增殖及對(duì)血管的修復(fù)能力的影響，是研究有效延緩血管衰老、增強(qiáng)血管的自修復(fù)能力重要途徑。本研究結(jié)果顯示，觀察組和對(duì)照組阿托伐他汀治療2周較治療前EPC數(shù)量明顯增加。同時(shí)，CXCR4、bFGF、VEGF分泌量隨不同時(shí)間點(diǎn)也表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。表明患者在治療過(guò)程中，藥物對(duì)EPC先起效較為明顯，但是隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，EPC表現(xiàn)出適應(yīng)性，且受機(jī)體的干預(yù)逐漸明顯。在治療過(guò)程中， SIRT1一直保持增長(zhǎng)的趨勢(shì)，表現(xiàn)出藥物有抵抗EPC衰老的功能。觀察組與對(duì)照組的樣本量不夠大以及檢測(cè)的細(xì)胞因子種類有限，不能更為全面地分析不同劑量的他汀類藥物對(duì)EPC生長(zhǎng)和分化的影響。

綜上所述，中－低劑量的阿托伐他汀對(duì)急性心肌梗死患者體內(nèi)EPC增殖分化和細(xì)胞因子的分泌都有積極的影響，為防止術(shù)后血管再狹窄有著重要的意義。

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Impact of Middle and Low Dose Atorvastatin on Endothelial Progenitor Cell Function in Patients With Acute Myocardial Ischemia Injury

WANG Liang, ZHONG Wu, CHEN Mu-hu.
Department of Emergency, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou (646000), Gansu, China
Correspondence Author: WANG Liang, Email: ajhl64@163.com

Objective: To explore the impact of middle and low dose atorvastatin on peripheral endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with acute myocardial ischemia injury via investigating EPC proliferation, migration, differentiation and secretion of cytokines.

Method: A total of 80 patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) were randomly divided into 2 groups: Observation group, the patients received atorvastatin 40 mg and Control group, the patients received atorvastatin 20 mg. n=40 in each group. The number of circulating EPC, EPC proliferation ability and the secretion of cytokines before and at different time points after drug therapy were examined by means of MTT, flow cytometry and ELISA.

Results: The number of EPC was obviously increased with greatly changed migration ability within 2 weeks atorvastatin treatment in both groups. The secretion of cytokines presented that the contents of VEGF, bFGF, CXCR were elevating first followed by reducing thereafter, while the content of SIRT1was continuously increasing during the period of treating. The above parameters were similar between 2 groups.

Conclusion: Middle and low dose atorvastatin could effectively improve EPC proliferation and migration, increase the expressions of CXCR4, VEGF, bFGF and SIRT1 in STEMI patients.

Myocardial ischemia; Endothelial progenitor cells; Lipid-lowering drug

2016-09-19）

（編輯：許菁）

646000四川省瀘州市，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科

王亮 主治醫(yī)師 學(xué)士 研究方向?yàn)榧痹\創(chuàng)傷、急診介入 Email:ajhl64@163.com 通訊作者：王亮

R54

A

1000-3614（2017）07-0697-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.07.018