彝藥大火草花中槲皮素的色譜定性研究

張?；?/p>

摘要：目的建立大火草花中槲皮素的提取方法，對大火草花中槲皮素進(jìn)行薄層和高效液相方法鑒別。方法采用薄層色譜法對大火草花中槲皮素進(jìn)行分離鑒別，并用高效液相色譜法加以確定。結(jié)果大火草花中含槲皮素成分，可用薄層色譜鑒別槲皮素。結(jié)論薄層色譜法簡便、準(zhǔn)確，高效液相色譜法可為槲皮素含量的測定奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大火草花；槲皮素；薄層色譜法；高效液相色譜法

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號：1007-2349（2017）07-0074-02

大火草記載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005版第六冊彝族藥（Ⅲ）。為菊科植物鉤苞大丁草Gerbera delavayi France的干燥全草。又名鉤苞大丁草、小一支箭、火草、白地紫苑等，是一種民間常用中藥。具有清熱利濕，消積殺蟲等作用。臨床主要用于治療痢疾，胃痛，消化不良，蛔蟲癥等。槲皮素，又名櫟精，槲皮黃素，可作為藥品，具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外還有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量等作用。用于治療慢性支氣管炎。對冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用。此外，邢博士關(guān)于《利用槲皮素阻斷雄激素對激素依賴型的人類前列腺癌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)》一文認(rèn)為，槲皮素可以阻斷雄激素對激素依賴型的人類前列腺癌細(xì)胞的作用。本文采用薄層色譜法和高效液相色譜法，對大火草花中有效成分槲皮素進(jìn)行了研究，對其質(zhì)量控制有一定的意義。

1儀器和材料

大火草（玉溪市澄江縣帽天山自采）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-201408 含量以991%計(jì)）；電子天平（賽多利斯BP211D-OCE，賽多利斯BSA224S-CW）；高效液相色譜儀（安捷倫1260）；超聲清洗儀（Branson 5800）；硅膠G薄層色譜板（MERCK HX117107）；可見-紫外分光光度計(jì)（安捷倫Cary 60）；薄層色譜板成像儀（Biostep Cabuvis）；數(shù)顯控溫水浴鍋（XMT-DA）；電熱加熱板（EH20A-plus）；水處理器（Micra operator manual）；自動(dòng)顯色噴射器（SPU-1）；玻璃儀器均為天津玻璃儀器廠生產(chǎn)；分析純試劑均為四川西隴化工有限公司生產(chǎn)，色譜純甲醇為德國默克股份有限公司生產(chǎn)。

2方法與結(jié)果

21薄層鑒別

211供試品溶液的制備取供試品粉末01 g，加70%乙醇30 mL超聲30 min，取濾液蒸干，加水10 mL使溶解，用石油醚（30～60℃）萃取，棄去石油醚液，水溶液加3 mL稀鹽酸回流1小時(shí)，用冷水立即冷凝，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，加1 mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。

212對照品溶液的制備取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg槲皮素的溶液，作為對照品溶液。

213色譜方法照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部 通則 0502）試驗(yàn)，分別吸取上訴兩種溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10：8：1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在日光和紫外（365 nm）下檢視。

214結(jié)果供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)。TLC色譜圖見圖1。

22HPLC測定

221HPLC鑒別吸收波長的確定取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含5 ug槲皮素的溶液，作為供試品溶液，以甲醇為空白溶液，取供試品溶液，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在375 nm和255 nm處有最大吸收。375 nm波長處峰形狀圓滑對稱，故選擇375 nm為HPLC鑒別吸收波長。見圖2、圖3：

222色譜條件色譜柱為ZORBAX Extend-C18（46 mm×250 mm，5 um）；流動(dòng)相為甲醇-02%磷酸（45：55）；流速10 mL/min。檢測波長375 nm，柱溫30℃。進(jìn)樣量10 uL。理論塔板數(shù)按槲皮素計(jì)算，應(yīng)不低于 6000。在此色譜條件下，槲皮素對照品和大火草火藥材的HPLC圖譜見圖4、圖5。

223對照品溶液的制備取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 ug槲皮素的溶液，作為對照品溶液。

224供試品溶液的制備取本品粉末01 g，精密稱定，精密加甲醇-25%鹽酸（4：1）25 mL，稱重，回流提取1 h，冷卻，補(bǔ)足重量，過濾，精密吸取續(xù)濾液5 mL～25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（045 um）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

225結(jié)果供試品色譜在與槲皮素對照品色譜相同的保留時(shí)間上有相同峰。見圖4、圖5。

3討論

31薄層鑒別提取方法比較本實(shí)驗(yàn)嘗試了多種提取方法：①以甲醇為溶劑回流提取60 min，濾過，濾液濃縮。②以乙醇為溶劑超聲處理60 min，濾過，濾液濃縮。③以70%乙醇超聲30 min，取濾液蒸干，加水使溶解，用石油醚（30～60℃）萃取，棄去石油醚液，水溶液加l稀鹽酸回流1 h，用冷水立即冷凝，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴ト芙?。比較上訴三種方法，以方法③所得色譜圖斑點(diǎn)比較清晰圓整，且色素斑點(diǎn)較少。

32薄層鑒別展開劑的比較實(shí)驗(yàn)用不同展開劑展開，對結(jié)果進(jìn)行比較：①以石油醚（60℃～90℃）：丙酮（5：1）為展開劑，紫外365 nm下觀察。②正己烷：乙酸乙酯：甲酸（7：5：08）為展開劑，紫外365 nm下觀察。③甲苯：乙酸乙酯：甲酸（10：8：1）為展開劑，紫外365 nm下觀察，噴以三氯化鋁試液，在日光和紫外（365 nm）下觀察。④氯仿：甲酸乙酯：甲酸（5：4：1）鹽酸蒸汽飽和為展開劑，置紫外365 nm下觀察。⑤乙酸乙酯：甲酸：水（8：1：1）為展開劑，噴以三氯化鋁試液，在日光和紫外（365 nm）下觀察。⑥以氯仿：甲醇（10：08）為展開劑，紫外365nm下觀察。比較上述六種展開劑的展開結(jié)果，以方法③的分離效果和Rf值比較好。

33薄層鑒別點(diǎn)樣量的篩選本實(shí)驗(yàn)分別對供試品溶液2、5、10、15 uL的點(diǎn)樣量進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖6，表明以10 uL的點(diǎn)樣量斑點(diǎn)在日光和紫外365 nm下表現(xiàn)均較好。

34樣品不同部位槲皮素薄層鑒別本實(shí)驗(yàn)對樣品不同部位的槲皮素進(jìn)行了薄層鑒別比較，結(jié)果表明花中槲皮素的含量最高，故選用樣品的花進(jìn)行試驗(yàn)研究。

35大火草易于生長，在松樹林下山坡草叢中都能生存。本方法操作簡單，結(jié)果清晰明確。可為大火草的開發(fā)及槲皮素的來源提供一個(gè)依據(jù)，為今后大火草的質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會中華人民共和國藥典[S]北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015

[2]王祥培，許士娜，吳紅梅，等天胡荽藥材中槲皮素的薄層鑒別與含量測定[J]，時(shí)珍國醫(yī)國藥2010，21（1）：44

[3]俞一心，戈升榮，王桂珍，等槲皮素及其衍生物的藥理作用研究進(jìn)展[J]，中藥材，2003，26（12）：902

[4]楊修鎮(zhèn)甜地丁中槲皮素的薄層鑒別與含量測定，第五屆中國獸藥大會—?jiǎng)游锼幤穼W(xué)會分論文集[C]

[5]云南省食品藥品監(jiān)督管理局云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)·彝族藥（Ⅲ）[S]，昆明：云南科技出版社，2005