一測多評法同時測定山銀花藥材中5種皂苷類成分的含量Δ

孫玲，樊曉蘭，郭綺，張小蒙，陳磊（.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城4005；.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都630；3.重慶市醫(yī)療器械技術(shù)審評認證中心，重慶400）

一測多評法同時測定山銀花藥材中5種皂苷類成分的含量Δ

孫玲1＊，樊曉蘭2，郭綺3#，張小蒙1，陳磊1（1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城224005；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都611130；3.重慶市醫(yī)療器械技術(shù)審評認證中心，重慶401120）

目的：建立同時測定山銀花藥材中5種皂苷類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以灰氈毛忍冬皂苷乙為內(nèi)標(biāo)，計算其對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙的相對校正因子（RCF），通過RCF計算上述4種皂苷類成分的含量；以外標(biāo)法測定的上述皂苷類成分含量作實測值，比較計算值與實測值的差異。結(jié)果：灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙檢測進樣量線性范圍分別為0.316～6.32μg（r＝0.997 3）、0.453～9.06μg（r＝0.998 2）、0.231～4.62μg（r＝0.999 6）、0.342～6.84μg（r＝0.998 4）、0.147～2.94μg（r＝0.996 1）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率試驗的RSD分別為97.74%～104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%～103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%～103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%～104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%～102.92%（RSD＝1.39%，n＝6）。計算值與實測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于山銀花藥材中5種皂苷類成分含量的同時測定。

一測多評法；山銀花；外標(biāo)法；相對校正因子；灰氈毛忍冬皂苷乙

山銀花Lonicerae Flos為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[1]，臨床上常用于治療熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等疾病。山銀花藥材中有效成分眾多，皂苷類成分是除綠原酸外對其藥效起關(guān)鍵作用的一類重要成分，其中主要為常春藤皂苷類，即灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲等。

一測多評法的可行性在茶葉、大黃、黃連、人參等藥材中得以驗證[2-4]，作為一個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測量方法已從2010年版《中國藥典》開始被收錄。本研究采用一測多評法，根據(jù)灰氈毛忍冬皂苷乙與其他成分的相對校正因子（RCF），通過測定灰氈毛忍冬皂苷乙的含量來計算多個皂苷類成分的含量，實現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量分析的目的，并與外標(biāo)法測定結(jié)果進行比較，評價該技術(shù)的可行性，為山銀花藥材中有效成分含量測定的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311A四元泵、G1313A自動進樣器、Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器、G1316A柱溫箱、Agilent Chem Station工作站（美國Agilent公司）；P680型HPLC儀，包括P680A四元梯度泵、SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測器、TCC-100柱溫箱、Chromeleon色譜工作站（美國Dionex公司）；AL-204型電子分析天平、AE240型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

灰氈毛忍冬皂苷甲對照品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號：140360-201310）；灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（批號：136849-201402）、川續(xù)斷皂苷乙對照品（批號：133289-201405）均購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；灰氈毛忍冬次皂苷甲對照品（南京廣潤生物制品有限公司，批號：128730-201403）；灰氈毛忍冬次皂苷乙對照品（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號：136849-201403），以上對照品純度均＞98%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

山銀花藥材購自湖南隆回，經(jīng)筆者鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理

在一定線性范圍內(nèi)，成分的量（質(zhì)量或質(zhì)量濃度）與檢測器響應(yīng)值成正比，f＝W/A（W表示質(zhì)量濃度，A表示響應(yīng)值）。在多指標(biāo)質(zhì)量評價時，以藥材中某一典型組分（有對照品供應(yīng)者）為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的RCF，通過RCF計算其他組分的含量。

假設(shè)某樣品中含有i個組分，fi＝Wi/Ai（i＝1，2，…，k，…，m），式中Ai為組分響應(yīng)值，Wi為組分質(zhì)量濃度。選取其中一組分k為內(nèi)參物，建立組分k與其他組分m之間的RCF：fkm＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）；由此可導(dǎo)出定量計算公式：Wm＝（Wk×Am）/（fkm×Ak）[5]。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～5m in，15%→18%A；5～8m in，18%→25%A；8～15m in，25%→75%A）；流速：1.0m L/m in；柱溫：32℃；進樣量：15μL；蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）漂移管溫度：100℃；空氣體積流量：3.2 L/m in。在上述色譜條件下，各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液精密稱取待測成分對照品適量，分別置于25m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙質(zhì)量濃度分別為0.316、0.453、0.231、0.342、0.147mg/m L的混合對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chrom atogram s

2.3.2 供試品溶液取藥材樣品，干燥，研磨（過4號篩），精密稱取粉末0.5 g，置于圓底燒瓶中，精密加50%甲醇溶液50m L，搖勻，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷；再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，置于50m L量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液1、4、8、12、16、20μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.5 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙峰面積的RSD分別為1.34%、1.73%、0.95%、1.22%、1.93%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙峰面積的RSD分別為1.66%、1.37%、0.89%、1.41%、0.65%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙含量的平均值分別為0.072%、4.527%、1.021%、0.053%、0.038%，RSD分別為1.36%、0.72%、1.91%、1.84%、0.73%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.9 RCF的計算

以灰氈毛忍冬皂苷乙為內(nèi)標(biāo)，按“2.1”項下公式計算，結(jié)合“2.4”項下系列混合對照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，計算灰氈毛忍冬皂苷乙分別對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙的RCF，結(jié)果見表3。

2.10 一測多評法系統(tǒng)適用性考察

2.10.1 不同HPLC儀和色譜柱考察精密量取“2.3.1”項下混合對照品適量，分別考察不同HPLC儀（Agilent1200、Dionex P680）和不同色譜柱（Agilent XDB-C18、Ultimate XB C18、DiamonsilC18）對RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為1.18%、3.95%、2.89%、3.12%，表明不同HPLC儀和色譜柱對RCF無顯著影響。

表3 RCF計算結(jié)果Tab 3 Resultsof RCF

2.10.2 不同流速考察精密量取“2.3.1”項下混合對照品適量，分別考察0.8、1.1、1.3m L/m in的流速對RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為2.83%、1.45%、3.61%、2.91%，表明流速對RCF無顯著影響。

2.10.3 不同柱溫考察精密量取“2.3.1”項下混合對照品適量，分別考察25、30、35、40、45℃的柱溫對RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為2.17%、3.21%、2.61%、2.95%，表明柱溫對RCF無顯著影響。

2.10.4 不同進樣量考察分別精密量取“2.3.1”項下混合溶液4、8、10、12、14、16μL，考察不同進樣量對RCF的影響。結(jié)果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為3.12%、2.57%、1.36%、2.74%，表明進樣量對RCF無顯著影響。

2.11 樣品含量測定

取藥材樣品各適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按“2.1”項下公式計算樣品含量；采用外標(biāo)法對山銀花藥材中4種皂苷成分進行多成分同步含量測定，結(jié)果見表4（表中ESM為實測值，QAMS為計算值）。結(jié)果，兩種方法測得結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明建立的RCF具有較好的可信度，一測多評法計算結(jié)果可靠。

3 討論

由于中藥材的成分較為復(fù)雜，很難做到整體質(zhì)量評價體系的認證，所以對于中藥中多組分、多靶點的質(zhì)量控制成為了近年研究熱點。隨著人們對中藥材中多組分含量控制的深入研究發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)部含量在一定程度內(nèi)察不同HPLC儀、不同色譜柱、不同柱溫和不同流速對RCF的影響，結(jié)果顯示以上因素對RCF無顯著影響。最后將計算值與實測值的結(jié)果進行了比較，結(jié)果表明，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此在缺少對照品的情況下，可以利用RCF對山銀花藥材的皂苷類成分進行含量測定。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：30.

[2]何兵，楊世艷，張燕.一測多評法中待測成分校正和定位的新方法研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2012，47（12）：1653-1659.

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Simultaneous Determ ination of 5 Saponins in Lonicerae Flosby QAMSM ethod

SUN Ling1，F(xiàn)AN Xiaolan2，GUO Qi3，ZHANG Xiaomeng1，CHEN Lei1（1.College of Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Medicine，Jiangsu Yancheng 224005，China；2.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Chongqing Accreditation Center for M edical Device and Technology，Chongqing 401120，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determ ination of 5 saponins in Lonicerae Flos.METHODS：Usingmacranthoidin B asa reference，HPLC method wasadopted to calculate the relative correction factor（RCF）of it to macranthoidin A，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B.The contentsof above 4 saponinswere calculated through RCF.Using the contents of saponins determ ined by external standard method as measured value，the calculated value was compared w ith measured value.RESULTS：The linear ranges ofmacranthoidin A，macranthoidin B，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B were 0.316-6.32μg（r＝0.997 3），0.453-9.06μg（r＝0.998 2），0.231-4.62μg（r＝0.999 6），0.342-6.84μg（r＝0.998 4）and 0.147-2.94μg（r＝0.996 1），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoverieswere 97.74%-104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%-103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%-103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%-104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%-102.92%（RSD＝1.39%，n＝6），respectively.There was no statistical significance between calculated value and measured value（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and reproducible.It can be used for the determination of saponins in Lonicerae Flos.

QAMS；Lonicerae Flos；External standard method；Relative correction factor；Macranthoidin B

R927

A

1001-0408（2017）18-2546-04

2016-09-06

2017-03-27）

（編輯：張靜）

江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項目（No. PPZY 2015A097）；鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計劃項目（No.YK2016053）

＊講師，碩士。研究方向：中藥鑒定及中藥分析。E-mail：vivianlovesun@163.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)和醫(yī)療器械技術(shù)審批。E-mail：cqguoqi@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.28