冬蟲夏草菌絲體多酚提取及對(duì)3種癌細(xì)胞抑制作用研究

尹 敏，趙迎春，劉雨陽(yáng)，吳素蕊，趙天瑞，樊 建*

（1．昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2．云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650106；3．中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

冬蟲夏草菌絲體多酚提取及對(duì)3種癌細(xì)胞抑制作用研究

尹 敏1，趙迎春2，劉雨陽(yáng)1，吳素蕊3，趙天瑞1，樊 建1*

（1．昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2．云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650106；3．中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

以冬蟲夏草的菌絲體為原料，提取溶劑為乙醇，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定冬蟲夏草菌絲體中多酚的含量，目的在于研究乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響。以單因素試驗(yàn)為前提，以正交試驗(yàn)來指導(dǎo)優(yōu)化提取參數(shù)，測(cè)定了所得多酚含量及其對(duì)Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞、HepG-2肝癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。研究結(jié)果表明，在冬蟲夏草菌絲體的提取工藝中，最佳的提取工藝條件為：溫度為70℃，提取時(shí)間60 min，乙醇的濃度70%，料液比（g∶mL）1∶35；冬蟲夏草菌絲體中提取的粗多酚對(duì)試驗(yàn)中3種癌細(xì)胞都表現(xiàn)出一定的抑制作用，當(dāng)菌絲體粗多酚的濃度為100 μg·mL-1時(shí)，對(duì)3種癌細(xì)胞抑制率達(dá)到最高，分別為72．12%（Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞）、83．67%（HepG-2肝癌細(xì)胞）和58．78%（MCF-7乳腺癌細(xì)胞）。

冬蟲夏草菌絲體；多酚；癌細(xì)胞；抗癌作用

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis），又名蟲草。在適宜的條件下，寄生在高山草甸土壤中蝠蛾幼蟲身體里，僵化后形成冬蟲夏草菌的子實(shí)體，其與僵蟲菌形成菌物復(fù)合體，即冬蟲夏草[1]。它是中國(guó)歷史上名貴的中藥材，主要分布在我國(guó)的西藏、四川、云南、青海等高寒地帶[2]。據(jù)《本草從新》描述，冬蟲夏草以四川產(chǎn)的為最佳，云南和貴州次之。研究表明，冬蟲夏草中富含多種不飽和脂肪酸、氨基酸、多糖類物質(zhì)和維生素B12等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，冬蟲夏草在提高人體免疫力、抗腫瘤活性和抗輻射等方面均具有較好的功效[3]。

冬蟲夏草的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值非常高，程麗芳等[4]研究冬蟲夏草內(nèi)的多糖物質(zhì)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖和抑制作用。孫艷[5]等用不同濃度的冬蟲夏草細(xì)粉注射到H22肝癌小鼠的腹腔中，觀察小鼠的腫瘤抑制率以及NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。劉彥威等[6]研究冬蟲夏草菌絲體水提物的抗新城疫病毒作用。本文以冬蟲夏草菌絲體為原料，采用乙醇溶劑浸提法提取冬蟲夏草中的粗多酚，優(yōu)化提取工藝條件，確定最佳提取條件，并探究冬蟲夏草粗多酚對(duì)3種癌細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試菌種：冬蟲夏草菌種為昆明食用菌研究所保藏菌種；試劑：瓊脂、酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、Na2CO3、福林酚、沒食子酸、KH2PO4、MgSO4·7H2O、乙醇等。

1.2 試驗(yàn)儀器

BSC-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QYC-2102C型光照振蕩培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；TU1901型分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ES-315高壓滅菌鍋，TOMY KOGYO Co．Ltd．；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZD-F12型真空冷凍干燥機(jī)，南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；SW-CJ-ID超凈工作臺(tái)，蘇州凈化儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋，金壇科析儀器有限公司；FRD系列多功能薄膜封口機(jī)，中國(guó)船舶重工集團(tuán)公司；YHZ82恒溫振蕩器，常州中國(guó)電器有限公司。

1.3 方法

1．3．1 冬蟲夏草菌絲體的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)：經(jīng)活化后的菌種進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，將帶菌的瓊脂塊置于往復(fù)式搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃～27℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1～200 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間為7 d[7]。

冬蟲夏草菌絲體制備：發(fā)酵培養(yǎng)完成后，去除瓊脂塊，離心10 min（5 000 r·min-1），得到冬蟲夏草菌絲體，用純水洗滌菌絲體3次～4次，凍干，即得冬蟲夏草菌絲體。

1．3．2 冬蟲夏草菌絲體多酚提取和含量測(cè)定

冬蟲夏草菌絲體→粉碎過篩（70目）→水浴提取→過濾→離心（5 000 r·min-1，10 min）→濃縮凍干→多酚粗提物。

用Folin-Ciocalteu法測(cè)定冬蟲夏草多酚粗提物中多酚含量。以不同條件下的冬蟲夏草多酚粗提物為實(shí)驗(yàn)原料測(cè)定其吸光值，菌絲體多酚得率（P）公式為：

式中：C表示提取液濃度，mg·mL-1；V表示提取液體積，mL；N表示稀釋倍數(shù)；M表示菌粉質(zhì)量，g。

1．3．3 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過研究不同提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比等對(duì)多酚得率的影響，選擇最佳的試驗(yàn)條件。在單因素試驗(yàn)過程中取得的最佳試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)之上，再以這四個(gè)因素為正交試驗(yàn)的因素，采用L9（34）正交優(yōu)化表作為試驗(yàn)研究方案，設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以冬蟲夏草菌絲體中粗多酚的提取率作為參考指標(biāo)，確定其最佳提取工藝條件。正交試驗(yàn)水平與因素設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Tab．1 Factors and levels of orthogonal extraction experiment

1．3．4 冬蟲夏草菌絲體多酚類物質(zhì)對(duì)3種癌細(xì)胞抑制作用

（1）試驗(yàn)分組

空白組A0：完全培養(yǎng)液90 μL、PBS 10 μL；模型組Ax0：癌細(xì)胞懸液90 μL、PBS 10 μL；樣品組Ax：癌細(xì)胞懸液90 μL、樣品10 μL。

96孔板中，每孔加入癌細(xì)胞懸液 （1×106個(gè)·mL-1） 90 μL，不同濃度多酚提取物稀釋液10 μL（終濃度分別為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1、100 μg·mL-1），空白組和模型組每孔分別用10 μL的PBS補(bǔ)齊，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。

（2）細(xì)胞抑制率測(cè)定

培養(yǎng)72 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8試劑（碧云天），置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在450 nm處測(cè)定每孔的吸光值以計(jì)算細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞抑制率（I）公式為：

式中：Ax表示樣品組的吸光值；A0表示空白對(duì)照組的吸光值；Ax0表示模型組的吸光值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及方差分析工作采用Origin軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草菌絲體多酚提取

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

（1）乙醇濃度對(duì)菌絲體多酚提取率的影響

乙醇濃度對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚提取率的影響情況見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium

由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的提高，冬蟲夏草菌絲體中多酚的提取率先上升后下降。且當(dāng)乙醇濃度從30%升至50%時(shí)，多酚提取率提高顯著。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值，為0.945%。隨著進(jìn)一步增大乙醇濃度，多酚提取率緩慢下降。造成多酚提取率下降的原因，一方面可能是由于乙醇的濃度太高，容易揮發(fā)從而影響多酚的提取效果。另一方面，乙醇濃度過高，導(dǎo)致冬蟲夏草菌絲體內(nèi)色素和醇溶性成分等的溶出，進(jìn)而引起多酚提取率的下降。而當(dāng)乙醇濃度低于60%時(shí)，多酚提取率未達(dá)到最大值，可能是由于水與菌絲體內(nèi)的糖類成分相互溶解，從而影響多酚的提取率[8]。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度60%是最佳提取條件之一。

（2）料液比對(duì)菌絲體多酚提取率的影響

料液比對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚提取率的影響情況見圖2。

圖2 料液比對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium

從圖2可以看出，菌絲體多酚得率隨著料液比的遞減呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1:35時(shí)，冬蟲夏草菌絲體多酚提取率達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)閭髻|(zhì)驅(qū)動(dòng)力會(huì)隨著料液比的降低而增加，因此，隨著料液比的降低，傳質(zhì)驅(qū)動(dòng)力隨之增加，從而引起多酚的提取率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)[9]。而當(dāng)料液比繼續(xù)減小時(shí)，多酚提取率顯著降低。這可能是由于醇溶性雜質(zhì)浸出率的增加，以及冬蟲夏草菌絲體多糖或其他物質(zhì)的溶出，阻礙菌絲體多酚的提取。因此，料液比1:35是最佳提取條件之一。

（3）提取溫度對(duì)菌絲體多酚提取率的影響

提取溫度對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚提取率的影響情況見圖3。

圖3 溫度對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium

從圖3可知，冬蟲夏草菌絲體多酚提取率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在50℃到 90℃溫度范圍內(nèi)，多酚提取率變化范圍為0.822%～1.362%，當(dāng)溫度為 80℃時(shí)，多酚提取率為1.362%，達(dá)到最大值。當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，多酚提取率下降的原因可能是溫度過高改變了其細(xì)胞壁的可溶性，同時(shí)，也造成提取液粘度下降。因此，多酚的滲透、溶解、擴(kuò)散速度也隨之加快，使得多酚得率有所增加[10]。但是溫度過高一些聚合反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)也會(huì)隨之發(fā)生，同時(shí)也造成乙醇揮發(fā)加快，從而使得多酚的得率明顯急劇降低[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，80℃的提取溫度是最佳的提取條件之一。

（4）提取時(shí)間對(duì)菌絲體多酚提取率的影響

由一些研究看出，多酚提取率會(huì)隨著提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[12]。然而，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，部分多酚類物質(zhì)有可能會(huì)發(fā)生降解和氧化等反應(yīng)，從而導(dǎo)致菌絲體多酚類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)冬蟲夏草菌絲體多酚得率的影響Fig.4 Effect of time on the polyphenols extraction rate of Cordyceps sinensis mycelium

由圖4可以看出，當(dāng)提取時(shí)間小于60 min時(shí)，菌絲體多酚提取率顯著增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，多酚提取率緩慢下降。因此，提取時(shí)間60 min是最佳提取條件之一。

2.1.2 冬蟲夏草菌絲體多酚提取工藝的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的前提下，以冬蟲夏草菌絲體中多酚類物質(zhì)的提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表研究最佳的提取工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal extraction experiment

由表2可以得出，提取溫度是冬蟲夏草菌絲體多酚類物質(zhì)提取率的最主要影響條件。其次從主到次的影響因素依次是提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比。冬蟲夏草菌絲體多酚浸提最好的工藝條件為C1D2A3B2，即提取溫度70℃，提取時(shí)間60 min，乙醇濃度70%，料液比1:35（g:mL）。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率分析

冬蟲夏草菌絲體中提取的粗多酚對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞、Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用分別如圖5所示。從圖5中可以看出，隨著冬蟲夏草多酚濃度的提高，3種癌細(xì)胞的抑制率有一定上升趨勢(shì)，呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性。

圖5 粗多酚對(duì)3種癌細(xì)胞抑制率的影響Fig.5 Effects of crude polyphenols on inhibition of three kinds of cancer cells

由圖5可知，冬蟲夏草菌絲體中粗多酚類物質(zhì)對(duì)3種癌細(xì)胞均產(chǎn)生一定程度的抑制作用，對(duì)癌細(xì)胞抑制效果，從好到壞排列依次是HepG-2肝癌細(xì)胞、Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞。當(dāng)粗多酚濃度為100 μg·mL-1時(shí)，對(duì)Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率為72.12%，MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑制率為58.78%。可能是因?yàn)槎x夏草菌絲體中多酚類物質(zhì)的抗氧化作用可以引起的癌細(xì)胞數(shù)量減少，多酚中的酚類物質(zhì)種類和含量也可能會(huì)影響到癌細(xì)胞的減少程度。Alshatwi等[13]認(rèn)為茶多酚對(duì)宮頸癌細(xì)胞有良好的抑制作用，能修復(fù)和影響宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激信號(hào)和PCD的阻力等。Cai等[14]對(duì)不同草藥中的多酚含量以及抗氧化活性和抗癌之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明多酚類物質(zhì)能夠有效抑制癌細(xì)胞的繁殖速度，是主要的抗癌活性成分。

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳的提取工藝條件：提取溫度70℃，提取時(shí)間60 min，乙醇濃度70%，料液比是1∶35（g:mL）。在最佳的提取工藝條件下，冬蟲夏草菌絲體中多酚類物質(zhì)提取得率為1.461%。對(duì)Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞、HepG-2肝癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，冬蟲夏草菌絲體中粗多酚類物質(zhì)對(duì)不同癌細(xì)胞表現(xiàn)出不同的作用。其對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出最好的抑制活性，其次依次是Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞，MCF-7乳腺癌細(xì)胞。

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Study on Polyphenol Extraction of Cordyceps sinensis Mycelium and Their Inhibitory Effect on Three Kinds of Cancer Cells

YIN Min1,ZHAO Ying-chun2,LIU Yu-yang1,WU Su-rui3,ZHAO Tian-rui1,FAN Jian1
(1．Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2．Yunnan Institute for Food and Drug Control,Kunming 650106,China;3．Kunming Edible Fungi Institute of All-China Federation of Supply and Marketing Cooperatives,Kunming 650221,China)

The polyphenols were extracted from the Cordyceps sinensis mycelium by Folin-Ciocalteu method,with ethanol as extraction solvent extraction．The effect of ethanol concentration,temperature,solid-liquid ratio and time on the extraction efficiency of polyphenols were identified．Based on single factor test,an orthogonal design was applied to optimize extraction process．The polyphenol composition and inhibitory effect of C.sinensis mycelium on three kinds of cancer cells were investigated in the present work．The results showed that the optimum conditions for polyphenols extraction were temperature of 70℃, ethanol concentration of 70%,solid-liquid ratio of 1:35,extracted for 60 min．The polyphenols were extracted from the C. sinensis mycelium have inhibitory effects on three kinds of cancer cells,it showed that the inhibition rate for HepG-2 cell,Caco-2 cell,MCF-7 cell was up to 83．67%,72．12%,58．78%respectively,when the polyphenols concentration was 100 μg·mL-1．

Cordyceps sinensis mycelium;polyphenol;cancer cells;anticancer effect

S646.9

A

1003-8310（2017）04-0048-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．012

尹敏（1992-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向：食品科學(xué)。E-mail:m18468259476＠163．com

*通信作者：樊建（1964-），男，碩士，副教授，主要從事食品化學(xué)方面研究。E-mail:fanj333＠163．com

2017-05-15