杏鮑菇軟腐病的病原菌及其生物學(xué)特性研究*

藥欣榮，常明昌，劉靖宇，趙 慧，仝宗軍，常晏民

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

〈病蟲(chóng)害防治〉

杏鮑菇軟腐病的病原菌及其生物學(xué)特性研究*

藥欣榮，常明昌，劉靖宇**，趙 慧，仝宗軍，常晏民

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

軟腐病是目前山西省杏鮑菇工廠化生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的新病害。為明確其致病菌，通過(guò)染病子實(shí)體組織分離獲得1株病原菌，經(jīng)過(guò)形態(tài)特征觀察和16SrDNA基因序列分析，確定該病原菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp．），該致病菌對(duì)杏鮑菇菌絲、子實(shí)體都具有侵染能力。通過(guò)對(duì)該病原菌生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，其最佳生長(zhǎng)條件為30℃，pH8，NaCl濃度15 g·L-1。在菌絲培養(yǎng)階段強(qiáng)化細(xì)菌性病害檢測(cè)，出菇管理中嚴(yán)格控制低溫條件，有助于預(yù)防軟腐病發(fā)生。

杏鮑菇；軟腐??；病原菌鑒定；生物學(xué)特性

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）是我國(guó)工廠化生產(chǎn)的繼白色金針菇之后的第二大食用菌種類(lèi)[1]。由于我國(guó)杏鮑菇生產(chǎn)多采用高密度、封閉、立體式的工廠化生產(chǎn)模式，病害一旦發(fā)生，傳播速度快，擴(kuò)散范圍廣，對(duì)企業(yè)的正常生產(chǎn)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的影響。Smith和Anna等的研究結(jié)果表明托拉氏假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii） 可引起褐斑?。˙rown Blotch Disease），同時(shí)Ro等發(fā)現(xiàn)病毒PeSV可造成杏鮑菇病毒性病害[2-4]。

2013年在山西省一些杏鮑菇生產(chǎn)企業(yè)發(fā)生了1種國(guó)內(nèi)未見(jiàn)過(guò)的病害，該病害發(fā)生時(shí)，在染病子實(shí)體的菌柄和菌蓋表面，呈現(xiàn)粘稠狀腐爛病癥，會(huì)嚴(yán)重降低杏鮑菇子實(shí)體的商品性。為此，本文開(kāi)展了相應(yīng)的病原學(xué)研究，以期明確該病害的病原菌種類(lèi)及其生物學(xué)特性，為科學(xué)防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

杏鮑菇腐爛病子實(shí)體與健康子實(shí)體，均采自山西省晉城市澤地萃綠農(nóng)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和出菇培養(yǎng)料配方

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH7.4。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然。

出菇培養(yǎng)料：棉籽殼77%、麩皮20%，糖、石灰和石膏各1%，pH7，料水比1∶1.5。

1.2 病原菌分離純化

選取杏鮑菇子實(shí)體病斑部位，在超凈工作臺(tái)中切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的表層組織，用無(wú)菌水沖洗3遍，接種于LB培養(yǎng)基中。搖床暗培養(yǎng)24 h（30℃，160 r·min-1） 之后，在無(wú)菌條件下，稀釋至原始濃度的10-6倍后，取100 μL涂布于直徑90 mm的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，30℃倒置暗培養(yǎng)36 h，挑取單菌落進(jìn)行保種。

1.3 病原菌致病性分析

1.3.1 子實(shí)體侵染

取病原菌菌液對(duì)健康杏鮑菇的菌柄和菌蓋進(jìn)行侵染，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2 菌絲侵染

取健康杏鮑菇菌絲接種于PDA試管培養(yǎng)基中，24℃恒溫暗培養(yǎng)4 d后，將病原菌點(diǎn)接于菌絲尖端未生長(zhǎng)處，24℃恒溫暗培養(yǎng)2 d。直到病原菌被菌絲生長(zhǎng)所覆蓋，將被侵染的菌絲接種于瓶裝出菇培養(yǎng)料中，以健康菌絲為對(duì)照，按常規(guī)杏鮑菇栽培流程進(jìn)行出菇試驗(yàn)。

1.4 病原菌的分類(lèi)鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株在LB平板上培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)特征，并作記錄。參照參考文獻(xiàn) [5]進(jìn)行利用電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)、大小，并記錄。

1.4.2 病原菌菌株16S rDNA基因序列比對(duì)鑒定

參考Vanysacker的方法[6]進(jìn)行基因組DNA提取，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5’-GACTCG GTCCTAGTTTGAGA-3’） 和1472R（5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參考劉冰花等方法[7]進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性序列比對(duì)，并用軟件MEGA6.0[8]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。

1.5 病原菌生物學(xué)特性分析

1.5.1 溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

將病原菌稀釋后在LB液體培養(yǎng)基中搖床暗培養(yǎng)（160 r·min-1，24 h），溫度設(shè)置為 10℃、20℃、30℃、35℃、40℃和50℃六個(gè)梯度。以未接種的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度值（OD600），每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.5.2 pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

在無(wú)菌條件下，用1mol·L-1的NaOH和1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的pH，pH設(shè)置為4、6、8、10、12，方法同1.5.1。

1.5.3 NaCl濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，設(shè)置NaCl濃度為0、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1和20 g·L-1，方法同1.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性分析

致病性分析見(jiàn)圖1。

圖1 致病性分析Fig.1 Pathogenicity test

由圖1可知，病原菌菌液侵染杏鮑菇菌柄和菌蓋處均出現(xiàn)病癥，見(jiàn)圖1中的A、a以及B、b，被侵染的菌絲在瓶裝出菇培養(yǎng)料中菌絲生長(zhǎng)期的菌絲密度明顯變稀疏，生長(zhǎng)速度明顯變慢（見(jiàn)圖1中的C、c以及D、d）。經(jīng)出菇培養(yǎng)后，其子實(shí)體發(fā)育期菌柄和菌蓋處均出現(xiàn)與出菇房相同病癥，因此，病原菌侵染量大，導(dǎo)致子實(shí)體出現(xiàn)畸形。

2.2 形態(tài)學(xué)分析

病原菌的形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

圖2 病原菌的形態(tài)特征Fig．2 Morphological characteristics of pathogenic bacteria

如圖2所示，病原菌在LB平板上28℃培養(yǎng)2 d，菌落淡黃色，直徑2．5 mm左右，圓形，表面光滑有光澤，平凸，邊緣整齊，無(wú)粘性，有微弱的臭味。顯微觀察顯示該細(xì)菌菌體為兩端鈍圓的短小桿菌，單獨(dú)存在或成雙，但不呈現(xiàn)長(zhǎng)鏈狀排列，革蘭氏染色為陰性。

2.3 病原菌16S rDNA鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

基于16S rDNA基因序列同源性病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列同源性病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig．3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence homology of pathogenic bacteria

測(cè)序結(jié)果顯示病原菌16S rDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 456 bp。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)杏鮑菇腐爛病病原菌16S rDNA序列與Bacillus sp．（登錄號(hào)為GQ495042） 的16S rRNA序列相似程度為99%，病原菌的16S rDNA序列已提交至 GenBank，登錄號(hào)為 KT426539。利用軟件MEGA6．0，以部分Bacillales目菌株為基礎(chǔ)構(gòu)建16S rDNA基因進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果表明該病原菌與芽孢桿菌屬細(xì)菌有較高的遺傳相似性，該菌株與菌株登錄號(hào)為GQ495042的Bacillus sp．M_17相似性最大，且相似性高達(dá)100%。

2.4 病原菌生物學(xué)特性分析

2．4．1 最適溫度分析

溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，病原菌在不同溫度下培養(yǎng)1 d后，生長(zhǎng)速度存在顯著差異，該菌在20℃～50℃均可生長(zhǎng)，最適溫度為30℃，10℃、20℃病原菌幾乎不生長(zhǎng)。

2．4．2 最適pH分析

圖4 溫度對(duì)病原菌的影響Fig．4 Effect of temperature on pathogenic bacteria

pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 pH對(duì)病原菌的影響Fig．5 Effect of pH on pathogenic bacteria

由圖5可知，病原菌在不同pH的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后，生長(zhǎng)速度差距明顯，在pH為6～10的條件下均可生長(zhǎng)，最適pH為8，pH為4和12時(shí)不利于病原菌生長(zhǎng)。

2．4．3 NaCl耐受能力分析

NaCl對(duì)病原菌的影響見(jiàn)圖6。

圖6 NaCl對(duì)病原菌的影響Fig．6 Effect of NaCl concentration on pathogenic bacteria

由圖6可知，病原菌在NaCl濃度0～20 g·L-1的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后，病原菌均可生長(zhǎng)，該菌最適NaCl為15 g·L-1。

3 討論

2013年關(guān)統(tǒng)偉等[12]對(duì)杏鮑菇培養(yǎng)料中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，其研究結(jié)果顯示鑒定菌株多數(shù)屬于Bacillus屬（36．7%）和Thermus屬（28．2%），并推測(cè)這些細(xì)菌可能會(huì)對(duì)杏鮑菇人工栽培病害發(fā)生構(gòu)成一定的潛在威脅。本研究通過(guò)對(duì)該致病菌的分離和鑒定，表明這一新的杏鮑菇軟腐病是由1種芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp．M_17）引起。對(duì)該細(xì)菌的致病性測(cè)定還顯示其對(duì)杏鮑菇菌絲具有侵染效果，而對(duì)子實(shí)體侵染無(wú)效果，這與食用菌常見(jiàn)病害，如平菇褐斑病[9]、雙孢菇褐斑病[10]和金針菇軟腐病[11]等病原菌致病性測(cè)定結(jié)果不同。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)被Bacillus sp．侵染的杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)速度明顯變慢，密度明顯變稀疏，據(jù)此推測(cè)該病原細(xì)菌侵染杏鮑菇菌絲的機(jī)制可能與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） S9對(duì)真菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani） 菌絲的侵染相似[13]，可吸附于菌絲上，并伴隨菌絲生長(zhǎng)，而后產(chǎn)生溶菌物質(zhì)消解菌絲體，從而導(dǎo)致被其侵染的菌絲出現(xiàn)生長(zhǎng)速度變慢，長(zhǎng)勢(shì)減退以及杏鮑菇子實(shí)體病變。隨后的生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)顯示，該病原菌的最適生長(zhǎng)條件為溫度30℃，pH8，NaCl濃度15 g·L-1。這一研究結(jié)果為杏鮑菇菌種生產(chǎn)和出菇管理，采用物理、化學(xué)和生物方法綜合防控該病原菌的滋生和蔓延，提高杏鮑菇的品質(zhì)和產(chǎn)量提供了重要參考。

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Biological Characteristics of Soft-rot Parasitic on Pleurotus eryngii

YAO Xin-rong,CHANG Ming-chang,LIU Jing-yu,ZHAO Hui,TONG Zong-jun,CHANG Yan-min
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

A new disease,soft-rot disease,was recently found in Pleurotus eryngii growing factory in Shanxi province．A bacteria isolate was generated from the diseased fruiting body．Pathogenicity test,morphological observation and 16S rDNA sequence analysis had proved that the bacteria was Bacillus sp．,the pathogen of the disease．The pathogen had the ability to infect mycelia of P.eryngii and the fruiting body without infection．The biological test showed that the optimum culture conditions for the pathogen were temperature of 30°C,pH of 8,NaCl concentration of 15 g·L-1．It is helpful to prevent the occurrence of the disease by strengthening the detection of bacterial diseases in the culture of the mycelia and the strict control of the low temperature conditions in mushroom growth．

Pleurotus eryngii;soft-rot;pathogen identification;biological characteristics

S646.1

A

1003-8310（2017）04-0058-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．014

山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（FT2014-03-01）；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（S2015A300010）；2015年度山西省高校協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（201315）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（13-044）。

藥欣榮（1992-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭秤镁∠x(chóng)害防治。E-mail:yxr096vip＠163．com

**通信作者：劉靖宇（1980-），男，博士，副教授，主要從事食用菌栽培與育種研究。E-mail:liujingyu80＠126．com

2017-05-10