河北省平菇主栽品種分子身份證的構(gòu)建*

李 慧，王朝江，高春燕

（河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051）

〈生理生化〉

河北省平菇主栽品種分子身份證的構(gòu)建*

李 慧，王朝江，高春燕**

（河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051）

以河北省主栽的17個(gè)平菇品種為材料，對(duì)構(gòu)建平菇種質(zhì)分子身份證的方法進(jìn)行探討研究。首先應(yīng)用CO1對(duì)平菇物種進(jìn)行鑒定，然后利用SSR Locator軟件從Pleurotus ostreatus PC15 v2．0全基因組序列上查找SSRs位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，采用篩選后的SSR引物對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增，然后根據(jù)引物對(duì)不同菌株擴(kuò)增產(chǎn)生的帶型進(jìn)行編碼、組合，構(gòu)建SSR分子身份證。結(jié)果顯示，17個(gè)平菇品種包括4株糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）、8株白黃側(cè)耳（P. cornucopiae）和5株肺形側(cè)耳（P.pulmonarius）。從48對(duì)SSR引物中篩選出9對(duì)引物，在17個(gè)平菇品種間共檢測(cè)到53種帶型，將不同帶型賦值編碼后組合成17個(gè)平菇品種的特異分子身份證。該研究表明CO1結(jié)合SSR標(biāo)記技術(shù)可有效地用于平菇種質(zhì)分子身份證的構(gòu)建。

平菇；分子身份證；CO1；SSR

平菇（Oyster mushroom）是一種栽培歷史悠久，栽培范圍廣泛的食用菌[1-2]。平菇子實(shí)體肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富且具有一定的保健功效[3]。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)平菇產(chǎn)量約占食用菌總產(chǎn)量的17%，位居第3位。

平菇原專指糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus），現(xiàn)常將側(cè)耳屬幾個(gè)可以栽培的近緣種泛稱為平菇[4]。平菇近緣種的鑒定方法，傳統(tǒng)上是依靠形態(tài)學(xué)[5]或結(jié)合拮抗試驗(yàn)和同工酶分析等多項(xiàng)分類方法[6]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，多種快捷、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到真菌鑒定中來(lái)。ITS（internal transcribed spacer） 序列分析是側(cè)耳屬鑒定的常用方法[7-8]，但是由于沒(méi)有界定種的明確界限并且ITS序列存在近緣種種內(nèi)差異比種間大的問(wèn)題[9]，以及數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息的不準(zhǔn)確性[10-11]，造成了該方法的不準(zhǔn)確。黃晨陽(yáng)[12]根據(jù)側(cè)耳屬不同物種的CO1（細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因）開(kāi)發(fā)出特異引物可以對(duì)平菇的糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）、白黃側(cè)耳（P. cornucopiae）以及肺形側(cè)耳（P.pulmonarius）進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。平菇栽培品種繁多，據(jù)報(bào)道有些省份栽培用平菇品種多達(dá)十幾至幾十個(gè)，這些品種存在嚴(yán)重的同物異名、同名異物現(xiàn)象[7，13]。如何準(zhǔn)確有效地進(jìn)行品種鑒別，對(duì)于平菇品種繁育、引種育種具有重要意義，也是品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的需要。

近年來(lái)，分子生物學(xué)手段因具有不受環(huán)境影響且變異豐富等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到食用菌菌株鑒別中來(lái)[14-15]。尤其是分子身份證概念的提出，不僅給品種本身賦予了一個(gè)識(shí)別品種的標(biāo)準(zhǔn)，而且數(shù)字化的DNA指紋，使品種鑒別更加直觀簡(jiǎn)潔[16]。SSR（simple sequence repeats）分子標(biāo)記常用于分子身份證的構(gòu)建，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、易于檢測(cè)而又識(shí)別率高等優(yōu)點(diǎn)[17]。王慧玲等[18]利用國(guó)際通用的9對(duì)SSR引物構(gòu)建了13個(gè)中國(guó)葡萄優(yōu)新品種的分子身份證；陳昌文等[16]從16對(duì)SSR引物中篩選出8對(duì)核心引物構(gòu)建了176份桃種質(zhì)的可辯分子身份證；張肖雅等[19]利用5對(duì)SSR引物將11株靈芝菌種完全區(qū)分開(kāi)，并構(gòu)建其分子身份證。王新新等[20]根據(jù)8對(duì)SSR引物產(chǎn)生的不同擴(kuò)增譜型，構(gòu)建了29份雙孢蘑菇菌株的分子身份證。平菇品種繁多，種質(zhì)較為混亂，然而關(guān)于平菇SSR分子身份證的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取河北省常栽的17個(gè)平菇品種，在對(duì)平菇近緣種進(jìn)行CO1物種鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)SSR分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建平菇品種的分子身份證，為當(dāng)?shù)仄焦狡贩N鑒定提供理論依據(jù)，也對(duì)平菇種質(zhì)分子身份證的構(gòu)建提供一定的方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為河北省主栽平菇品種，來(lái)源于科研單位或菌種公司。經(jīng)多年的栽培試驗(yàn)測(cè)試，17個(gè)平菇品種均表現(xiàn)為穩(wěn)定而特異的表型性狀，并且拮抗試驗(yàn)顯示17個(gè)菌株兩兩之間均有拮抗。供試菌株的品種名稱和來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試菌株名稱和來(lái)源Tab．1 Name and source of tested strains

1.2 菌絲培養(yǎng)和DNA提取

將活化好的平菇菌種塊轉(zhuǎn)接至鋪有玻璃紙的PDA平板上，25℃暗光培養(yǎng)5 d，刮取新鮮菌絲體100 mg左右，加入液氮研磨，按照植物基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)于天根生化科技有限公司） 說(shuō)明，提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA濃度和純度。將DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1～30 ng·μL-1，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CO1擴(kuò)增和分析

參考黃晨陽(yáng)[12]方法，對(duì)17個(gè)菌株進(jìn)行CO1基因擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小進(jìn)行物種鑒定，片段大小約為1 700 bp的為P.ostreatus，約為2 300 bp的為P.cornucopiae，約為3 600 bp的為P.pulmonarius。

1.4 SSR引物設(shè)計(jì)

從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并下載Pleurotus ostreatus PC15 v2．0全基因組序列 （http://genome．jgi．doe．gov/ PleosPC15_2/PleosPC15_2．download．html）。利用SSR Locator軟件對(duì)其全基因組序列進(jìn)行單至六核苷酸重復(fù)SSR序列的查找[21]，并隨機(jī)選取4條位于不同scaffold上的SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。共設(shè)計(jì)48條SSR引物用于PCR擴(kuò)增。SSR引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 SSR引物篩選

選取4個(gè)平菇菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行SSR引物初篩。SSR-PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，包括10×PCR buffer 2 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，

10 mmol·L-1dNTP 0．4 μL，5 U·μL-1Taq DNA酶0．2 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol·L-1） 1．5 μL，Reverse Primer(10 μmol·L-1)1．5 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O 10．4 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，銀染技術(shù)檢測(cè)。

1.6 SSR分析和分子身份證構(gòu)建

根據(jù)4個(gè)菌株擴(kuò)增結(jié)果篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富且區(qū)分度高的SSR引物。分別對(duì)17個(gè)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。

根據(jù)供試菌株的擴(kuò)增圖譜，參考每個(gè)引物擴(kuò)增目的片段的分子量大小，將強(qiáng)帶或可分辨/重復(fù)性好的弱帶記為有效的等位基因譜帶，重復(fù)性不好的弱帶不考慮，由小到大依次統(tǒng)計(jì)等位基因譜帶，分析每對(duì)引物對(duì)17個(gè)菌株擴(kuò)增產(chǎn)生的帶型，并對(duì)不同帶型進(jìn)行賦值編碼，標(biāo)記為1～9。為了保證每位編碼只有1位數(shù)字，第10種帶型標(biāo)記為0，將菌株帶型轉(zhuǎn)成零一矩陣，采用NTSYS-2．10e軟件計(jì)算同一物種菌株間相似度。根據(jù)菌株間相似度分析結(jié)果，如果存在相似度為100%的菌株，則需設(shè)計(jì)新的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，直至17個(gè)菌株的相似度小于100%，即將17個(gè)菌株全部區(qū)分開(kāi)。根據(jù)帶型編碼構(gòu)建17個(gè)平菇品種的SSR分子標(biāo)記身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO1擴(kuò)增結(jié)果及分析

CO1擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 供試菌株的CO1擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 PCR results of tested strains amplified by CO1 primers

17個(gè)菌株均能擴(kuò)增得到單一條帶，根據(jù)條帶大小，供試菌株分為3組。第2號(hào)、第9號(hào)、第12號(hào)和第16號(hào)菌株為P.ostreatus，共4株；第3號(hào)、第4號(hào)、第6號(hào)、第8號(hào)、第10號(hào)、第11號(hào)、第14號(hào)和第15號(hào)菌株為P.cornucopiae，共8株；第1號(hào)、第5號(hào)、第7號(hào)、第13號(hào)、第17號(hào)菌株為P. pulmonarius，共5株。

2.2 SSR引物篩選及擴(kuò)增多態(tài)性分析

根據(jù)4個(gè)菌株對(duì)48對(duì)SSR引物的篩選結(jié)果，經(jīng)過(guò)多次擴(kuò)增試驗(yàn)驗(yàn)證，最終選取9對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富且區(qū)分度高的SSR分子標(biāo)記，見(jiàn)表2。這九對(duì)SSR分子標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的SSR位點(diǎn)分別分布在Pleurotus ostreatus PC15 v2．0全基因組12條scaffold的第3條～第8條上。9對(duì)SSR標(biāo)記在17個(gè)平菇菌株中共檢測(cè)到52個(gè)等位基因。不同SSR標(biāo)記檢測(cè)到等位基因數(shù)目范圍為3個(gè)～8個(gè)，平均檢測(cè)效率為5．8個(gè)/標(biāo)記，擴(kuò)增的等位基因譜帶片段大小見(jiàn)表3。各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC=1-∑Pi2，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率）范圍為0．410～0．828，平均值為0．704，說(shuō)明供試菌株具有較高的雜合度，可能是由于長(zhǎng)期人工選擇具有雜種優(yōu)勢(shì)品種的結(jié)果。其中引物P25的多態(tài)信息含量最高為0．828，說(shuō)明該引物最能反映不同品種之間的差異。

表2 9對(duì)SSR分子標(biāo)記序列及擴(kuò)增多樣性信息Tab．2 Sequence and genetic diversity of 9 SSR primers for oyster mushroom

進(jìn)一步根據(jù)9對(duì)引物對(duì)17個(gè)菌株擴(kuò)增的分子指紋圖譜，將帶型轉(zhuǎn)成零一矩陣，計(jì)算同一物種內(nèi)菌株間的相似度。4株P(guān).ostreatus菌株間的遺傳相似性系數(shù)為0．44～0．89，8株P(guān).cornucopiae菌株間的遺傳相似性系數(shù)為0．48～0．85，5株P(guān).pulmonarius菌株間的遺傳相似性系數(shù)為0．33～0．93，說(shuō)明這九對(duì)SSR引物可以將17個(gè)平菇品種完全區(qū)分開(kāi)。

表3 每對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生的等位基因片段大小Tab．3 Size range of alleles amplified by SSR primer

圖2 引物P4對(duì)17個(gè)供試菌株擴(kuò)增產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)帶型圖及賦值Fig．2 Electrophoresis band pattern standards amplified by primer P4 for 17 tested strains

2.3 編碼和分子身份證構(gòu)建

9對(duì)引物在17個(gè)菌株中共產(chǎn)生53種帶型，其中在P.ostreatus組中檢測(cè)到18種、P.cornucopiae組27種、P.pulmonarius組27種，不同物種的菌株間可以產(chǎn)生相同的帶型。9個(gè)引物分別擴(kuò)增的帶型數(shù)為4種～10種。引物P25擴(kuò)增的帶型數(shù)最多為10種。圖2為引物P4對(duì)17個(gè)菌株擴(kuò)增產(chǎn)生的全部帶型和賦值情況，共有6種帶型。每對(duì)引物產(chǎn)生的不同標(biāo)準(zhǔn)帶型和賦值情況見(jiàn)表3、表4。

表4 每對(duì)SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)帶型和賦值情況Tab．4 Band pattern and encoded standard amplified by each SSR primer

對(duì)17個(gè)供試菌株的分子身份證進(jìn)行編碼，每個(gè)菌株的分子身份證分別由9個(gè)字符串組成，從左到右依次代表引物P3、P4、P12、P14、P22、P23、P25、P26、P34產(chǎn)生的第幾種帶型，結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5可以看出，17個(gè)平菇品種分別具有特異的分子身份證編碼。

3 討論

3.1 SSR分子身份證的編碼方法

對(duì)于SSR分子身份證的構(gòu)建方法，不同的研究者有不同的編碼原則。于瀟等[22]構(gòu)建的野生黑木耳菌株的分子ID是由1、0字符串組合而成，代表某對(duì)引物某個(gè)基因位點(diǎn)有無(wú)擴(kuò)增條帶，1代表有擴(kuò)增條帶，0代表無(wú)擴(kuò)增條帶，該分子ID是依賴于資源特征分析軟件（ID Analysis 1.0）分析構(gòu)建而成，簡(jiǎn)單快捷，但具有一定的使用局限性。杜晶晶等[23]構(gòu)建的葡萄種質(zhì)分子身份證與陳昌文等[16]的方法類似，即分子身份證字符串的每位上的字符對(duì)應(yīng)同一引物擴(kuò)增的較小等位基因編碼值，但對(duì)于雜合帶型的菌株，如果較小譜帶相同，那么就需要通過(guò)增加引物來(lái)區(qū)分種質(zhì)，這樣會(huì)增加所需引物數(shù)量和分子身份證位數(shù)。

本研究選取9對(duì)SSR引物對(duì)17個(gè)菌株擴(kuò)增結(jié)果顯示，大部分菌株都是雜合帶型，即包括兩個(gè)以上的等位基因，這可能是由于平菇栽培過(guò)程中容易產(chǎn)生孢子而發(fā)生自然雜交[24]，再經(jīng)不斷的人工選擇的結(jié)果。所以，本研究構(gòu)建的平菇品種分子身份證是由不同帶型的編碼組合而成，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)帶型包括所有的有效等位基因，這與王新新等[20]對(duì)雙孢蘑菇分子身份證的構(gòu)建方法類似。即分子身份證每一位數(shù)字代表一個(gè)引物產(chǎn)生的第幾種帶型，對(duì)于引物P25擴(kuò)增的7個(gè)等基因片段共組成10種帶型，為了保證每一位點(diǎn)只有1位數(shù)字，第10種帶型賦值為0，以達(dá)到書(shū)寫簡(jiǎn)潔的目的。本研究認(rèn)為SSR分子身份證的編碼是一種人為制定的標(biāo)準(zhǔn)，以簡(jiǎn)潔直觀且不影響區(qū)分效率為目的即可。

3.2 SSR分子標(biāo)記在平菇研究中的應(yīng)用

SSR分子標(biāo)記多用于平菇種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及菌株鑒定等研究[14，25]。對(duì)于SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)主要有3種策略，包括基因文庫(kù)篩選法，例如Barroso等[26]通過(guò)建立基因組文庫(kù)，從雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）中分離出四核苷酸（TATG）4，并擴(kuò)增出預(yù)期的產(chǎn)物；富集文庫(kù)篩選法，例如Ma等[14]采用生物素-磁珠富集法首次開(kāi)發(fā)出糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）微衛(wèi)星序列引物，成功區(qū)分37個(gè)側(cè)耳屬栽培菌株；數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法，例如劉春滟等[27]利用香菇（Lentinus edodes） 的EST數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)了40對(duì)SSR引物，22對(duì)具有多態(tài)性，多態(tài)率為55%。隨著糙皮側(cè)耳菌株全基因組序列的測(cè)序成功公布[28-29]，基于糙皮側(cè)耳全基因組的SSR信息分析越來(lái)越深入[30]，也為糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）SSR位點(diǎn)的獲取提供了便捷有效的途徑。本研究利用P.ostreatus PC15 v2.0全基因組序列成功設(shè)計(jì)9對(duì)SSR引物用于17個(gè)平菇菌株的區(qū)分，但為了更全面地反映種質(zhì)間的基因信息，需要開(kāi)發(fā)更多的SSR位點(diǎn)，覆蓋更多的基因組序列。本研究選取的9對(duì)SSR分子標(biāo)記，只分布在糙皮側(cè)耳基因組12條scaffold中的其中6條，雖然達(dá)到了區(qū)分全部菌株的目的，但對(duì)于更多新菌株尤其是親緣關(guān)系近的菌株，還需要不斷開(kāi)發(fā)新的SSR標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分。

3.3 平菇種質(zhì)分子身份證構(gòu)建過(guò)程中的物種鑒定

在我國(guó)，不同地區(qū)稱謂的平菇所指的生物學(xué)物種不完全相同，但是總體上說(shuō)，俗稱為平菇的側(cè)耳屬物種包括糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）、白黃側(cè)耳（P. cornucopiae）、佛羅里達(dá)側(cè)耳（P.florida） 和肺形側(cè)耳（P.pulmonarius）4個(gè)種[31]。在對(duì)平菇種質(zhì)進(jìn)行菌種鑒別或分子身份證構(gòu)建之前應(yīng)首先對(duì)平菇物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。對(duì)于平菇近緣種的鑒定，至今沒(méi)有一個(gè)準(zhǔn)確的方法，本研究采用的CO1標(biāo)記方法簡(jiǎn)便快速，雖然能夠克服ITS測(cè)序方法中的數(shù)據(jù)庫(kù)信息不準(zhǔn)確、種內(nèi)變異大于種間變異等不足，但是CO1引物是黃晨陽(yáng)[12]僅對(duì)側(cè)耳屬9個(gè)種、20個(gè)菌株的CO1序列進(jìn)行測(cè)序而設(shè)計(jì)的通用引物，由于試驗(yàn)材料有限，所以不能斷定CO1基因種內(nèi)保守，再者側(cè)耳屬CO1基因中頻繁出現(xiàn)內(nèi)含子，密碼子的擺動(dòng)效用可能使設(shè)計(jì)的通用引物失效或擴(kuò)增出假基因而影響結(jié)果[32]。所以CO1鑒定平菇近緣種的方法適應(yīng)性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]Falck R.Uber die Waldkultur des Austernpilzes(Agaricus ostreatus)[J].Laubholzstubben.Z.Forst-u.Jagdween,1917,49 (1917):159-165.

[2]Larraya LM,Perez G,Ritter E,et al.Genetic linkage map of the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus[J].Applied& Environmental Microbiology,2000,66 (12):5290-5300.

[3]黃毅.食用菌栽培學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2008.

[4]呂作舟.食用菌栽培學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2006.

[5]卯曉嵐.中國(guó)大型真菌[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000.

[6]鄭素月，張金霞，王賀祥，等.我國(guó)栽培平菇近緣種的多相分類[J].中國(guó)食用菌，2003，22（3）：3-6.

[7]申進(jìn)文，趙旭，李燕，等.河南省栽培平菇品種的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45（3）：297-301.

[8]鄭和斌，馬志剛，呂作舟，等.基于ITS序列分析對(duì)我國(guó)主要栽培的側(cè)耳品種的鑒定及評(píng)價(jià)[J].菌物學(xué)報(bào)，2006，25（3）：398-407.

[9]黃晨陽(yáng)，陳強(qiáng)，張金霞，等.側(cè)耳屬主要種類ITS序列分析[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29（3）：365-372.

[10]Nilsson RH,Ryberg M,Kristiansson E,et al.Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases:a fungal perspective[J].PLoS One,2006,1(1):59.

[11]Brock PM,D?ring H,Bidartondo MI.How to know unknown fungi:the role of a herbarium[J].New Phytologist,2009,181 (3):719-724

[12]黃晨陽(yáng).ITS和CO1在側(cè)耳屬物種鑒定中應(yīng)用[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[13]鄭素月，張慶橋.生化標(biāo)記在河北省栽培平菇種質(zhì)資源鑒別中的應(yīng)用[J].北方園藝，2011（14）：162-164.

[14]Ma KH,Lee GA,Lee SY,et al.Development and characterization of new microsatellite markers for the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus)[J].Journal of Microbiology Biotechnology,2009,19(9):851-857.

[15]葉翔，黃晨陽(yáng)，陳強(qiáng)，等.中國(guó)主栽香菇品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13（6）：1067 -1072.

[16]陳昌文，曹珂，王力榮，等.中國(guó)桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構(gòu)建[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（10）：2081-2093.

[17]Morgante M,Olivivieri A.PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics[J].The Plant Journal,1993,3 (1): 175-182.

[18]王慧玲，閆愛(ài)玲，孫磊，等.13個(gè)中國(guó)葡萄優(yōu)新品種的分子身份證構(gòu)建[J].生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（4）：137 -142.

[19]張肖雅，許修宏，劉華晶.11個(gè)靈芝菌株的分子ID構(gòu)建[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（2）：249-255.

[20]王新新，李丹，宋冰，等.雙孢蘑菇種質(zhì)SSR分子身份證的構(gòu)建[J].食用菌學(xué)報(bào)，2016，23（2）：6-11.

[21]da Maia LC,Palmieri DA,de Souza VQ,et al.SSR locator: tool for simple sequence repeat discovery integrated with primer design and PCR simulation[J].International Journal of Plant Genomics,2008,2008:412696.

[22]于瀟，許修宏，劉華晶.黑龍江部分野生黑木耳菌株的分子ID構(gòu)建[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（13）：171-175.

[23]杜晶晶，劉國(guó)銀，魏軍亞，等.基于SSR標(biāo)記構(gòu)建葡萄種質(zhì)資源分子身份證[J].植物研究，2013，33（2）：232 -237.

[24]李紅，肖千明，劉娜，等.食用菌菌種退化原因分析及復(fù)壯方法的探討[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：53-55.

[25]李慧，陳強(qiáng)，黃晨陽(yáng)，等.基于SSR標(biāo)記構(gòu)建平菇栽培品種核心樣本方法的探討[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（10）：2023-2032.

[26]Barroso G,Sonnenberg AS,Van Griensven LJ,et al.Molecular cloning of a widely distributed microsatellite core sequence from the cultivated mushroom Agaricus bisporus[J]. Fungal Genetics and Biology,2000,31(2):115-123.

[27]劉春滟，李南羿，張玉瓊.香菇EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[J].食用菌學(xué)報(bào)，2010，17（2）：1-6.

[28]Grigoriev IV,Nordberg H,Shabalov I,et al.The genome portal of the department of energy joint genome institute[J]. Nucleic Acids Research,2012,40(Database issue):26-32.

[29]Riley R,Salamov AA,Brown DW,et al.Extensive sampling of basidiomycete genomes demonstrates inadequacy of the white-rot/brown-rot paradigm for wood decay fungi[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2014,111 (27):9923-9928.

[30]Qu J,Huang C,Zhang J.Genome-wide functional analysis of SSR for an edible mushroom Pleurotus ostreatus[J].Gene, 2014,575(2):524-530.

[31]張金霞，黃晨陽(yáng)，鄭素月.平菇新品種-秀珍菇的特征特性[J].中國(guó)食用菌，2005，24（4）：25-26.

[32]Song H,Buhay JE,Whiting MF,et al.Many species in one: DNA barcoding overstimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(36):13486-13491.

Molecular ID Establishment of 17 Oyster Mushroom Cultivated in Hebei Province

LI Hui,WANG Chao-jiang,GAO Chun-yan
(Institute of Genetics and Physiology of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

The method of establishing the oyster mushroom germplasm molecular ID was studied by using 17 strains of oyster mushroom cultivated in Hebei province．Cytochrome oxidase subunit 1 gene (CO1)was used to identify the species of 17 oyster mushroom strains．Using SSR Locator software to screen SSRs(simple sequence repeats)in complete genome sequence of P.ostreatus PC15 v2．0 and to design primers for the selected SSR locus,suitable primers were selected to amplify genomic DNA．The assemblage of standard electrophoresis band patterns that amplified by each maker were coded and combined for the establishment of oyster mushroom germplasm molecular ID．The results showed that 17 oyster mushroom strains were identified as 4 strains of P.ostreatus,8 strains of P.cornucopiae,5 strains of P.pulmonarius．After screening of 48 primers,53 electrophoresis band patterns were detected using 9 selected SSR makers．Coding the standard electrophoresis band patterns,the distinctive molecule ID for 17 strains of oyster mushroom were established．The 17 strains were completely distinguished by 4 SSR primers．The results suggested CO1 combied with SSR maker techniques can be used for establishing molecular ID of oyster mushroom germplasm．

oyster mushroom;molecular ID;CO1;SSR

S646.9

A

1003-8310（2017）04-0035-07

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．009

河北省農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（A2015110103）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-24）。

李慧（1986-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌栽培育種。E-mail:lihuiviphappy＠163．com

**通信作者：高春燕（1964-），女，本科，副研究員，主要從事食用菌栽培研究。E-mail:ycsgcy＠163．com

2017-05-15