霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖含量測定及其鹵蟲毒活性研究

司華陽， 陳乃富， 陳乃東

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 合肥 230032； 2. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院， 六安 237012； 3. 皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心， 六安 237012)

霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖含量測定及其鹵蟲毒活性研究

司華陽1,2， 陳乃富2,3， 陳乃東2,3

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 合肥 230032； 2. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院， 六安 237012； 3. 皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心， 六安 237012)

基于正交試驗(yàn)探究提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間及溫度對多糖提取的影響。以鹵蟲的校正死亡率及LD50值評價(jià)銅皮石斛多糖的鹵蟲毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對銅皮石斛多糖提取的影響因素從小到大依次為：提取次數(shù)<料液比<提取時(shí)間<溫度，最佳提取條件為料液比1∶40、提取2 h、浸提溫度60 ℃、提取3次。銅皮石斛多糖鹵蟲毒活性研究表明，在4 h、8 h和12 h的LD50值分別為1.03、0.66和0.38 mg/mL，相同給藥時(shí)間內(nèi)，多糖對鹵蟲毒性的強(qiáng)弱隨濃度的增高而增高，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。在最優(yōu)提取條件下測得霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖含量為25.24%；銅皮石斛多糖具有顯著的鹵蟲毒活性。

銅皮石斛；多糖；鹵蟲毒；校正死亡率

銅皮石斛[Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.]，即細(xì)莖石斛，為蘭科石斛屬多年生草本植物，又稱清水山石斛、臺(tái)灣石斛，具有散風(fēng)止痛、清熱利濕等功效，在民間常用于治療消化不良、癰瘡腫痛、風(fēng)濕疼痛等疾病[1]?，F(xiàn)代化學(xué)研究及藥理研究表明，銅皮石斛中主要含有多糖[2]、生物堿[2]、聯(lián)芐類[3]和菲類[4]等多種生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[5]。銅皮石斛作為我國傳統(tǒng)中藥材“銅皮楓斗”的原材料，具有良好的藥用價(jià)值及應(yīng)用前景。

鹵蟲(Artemia)屬甲殼動(dòng)物亞門(Crustacea)鰓足綱(Branchiopoda)無甲目(Anostaca)鹵蟲科 (Artemidae)[6]，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生理學(xué)[7]、毒理學(xué)[8]、生態(tài)學(xué)[9]等學(xué)科的研究中?，F(xiàn)代研究表明，藥物的鹵蟲毒活性與其細(xì)胞毒活性存在相關(guān)性[10-12]，目前通過鹵蟲毒活性實(shí)驗(yàn)對藥物是否具有抗腫瘤活性進(jìn)行早期篩選的研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]。截至目前，尚未見天然來源的多糖鹵蟲毒活性研究報(bào)道。

為了探討多糖類物質(zhì)鹵蟲毒活性，本實(shí)驗(yàn)首先對霍山產(chǎn)銅皮石斛最佳提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，在確定的最佳工藝條件下提取霍山產(chǎn)鐵皮石斛多糖，采用鹵蟲毒活性篩選模型，對其抗腫瘤活性進(jìn)行測定，為鹵蟲用于天然藥物抗腫瘤活性評價(jià)積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為霍山產(chǎn)石斛資源開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用銅皮石斛于2013年6月采自安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)，經(jīng)皖西學(xué)院植物細(xì)胞工程生物技術(shù)研究中心主任陳乃富教授鑒定確認(rèn)為銅皮石斛[Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.]。剪取當(dāng)年生枝條，去葉備用。

鹵蟲卵(Artemiasalina)于2013年8月購自山東濱州金太陽生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52D型，上海浦滬儀器廠)；雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司)；離心機(jī)(GL-200-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；電子天平(GL-20G-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇(河北四友卓越科技有限公司)；無水乙醇(山東臨沂貝斯特化工有限公司)；無水乙醚、丙酮(上海振興化工一廠)；氯仿(武漢市鑫民族化工有限公司)；正丁醇(淄博品易經(jīng)貿(mào)有限公司)；蒽酮(阿拉丁試劑公司)；濃硫酸(汕頭市西隴化工廠有限公司)。以上試劑藥品均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖提取

將銅皮石斛切成薄片，60℃烘干至恒重，精確稱取5.0 g樣品于85℃無水乙醇冷凝回流提取脫色、脫脂，濾紙過濾，室溫下將所得藥渣中殘留有機(jī)試劑自然揮干，加入雙蒸水于80℃水浴冷凝回流浸提所得藥渣[17]。合并濾液并減壓濃縮獲得濃縮后的銅皮石斛粗多糖溶液。

2.2 多糖純化

將合并后的粗多糖浸提液定容至一定體積，4倍體積無水乙醇沉淀多糖，4℃冰箱靜置12 h，4000 r/min離心5 min，反復(fù)操作3～4次[18]，合并所得沉淀，加入適量雙蒸水溶解，采用Sevage法除蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1)[19-20]，收集去蛋白后的上層水相，40℃減壓濃縮蒸干，得精制多糖。

2.3 多糖含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配置0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液。分別精確量取0、0.1、0.2、0.4 、0.6、0.8和1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液于各試管中，雙蒸水定容至1.0 mL，按體積比1∶4加入 0.2%蒽酮-硫酸溶液顯色，震蕩均勻，冷卻至室溫后，置于沸水浴中加熱10 min，取出后，冷卻至室溫，雙蒸水作空白對照，于620 nm進(jìn)行紫外檢測[21]。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，求得回歸方程。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液0.2 mL，按2.3.1所述操作步驟測定其吸光度，在620 nm處分別于0、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0 h測定吸光度。結(jié)果顯示該顯色在6.0 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精確量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液0.2 mL，按2.3.1所述操作述步驟在620 nm處測定吸光度，測定5 次。結(jié)果顯示，RSD=2.6%。

2.3.4 換算因子的測定

精密稱取銅皮石斛精制多糖10.0 mg，配置成0.1 mg/mL溶液，精確量取兩種精制多糖溶液各1.0 mL，按2.3.1所述步驟檢測其吸光度，以雙蒸水做對照實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3組重復(fù)。

計(jì)算換算因子(F)：

F=W/(C×D)

其中：W為銅皮石斛多糖的質(zhì)量(mg)；C為多糖溶液中所含葡萄糖的濃度(mg/mL)；D為稀釋倍數(shù)。

2.3.5 多糖提取液的制備

按2.1方法對干品霍山產(chǎn)銅皮石斛進(jìn)行初步脫色、脫脂處理后，以蒸餾水為提取溶劑，按一定的料液比(g/mL)、提取時(shí)間、溫度、提取次數(shù)浸提，浸提液趁熱過濾，定容，制得霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖浸提液。

2.3.6 多糖含量測定

精密稱取銅皮石斛多糖提取液1.0 mL，雙蒸水配置成0.1 mg/mL的多糖溶液，按2.3.1所述操作測定其吸光度，以雙蒸水代替多糖做空白實(shí)驗(yàn)，計(jì)算銅皮石斛多糖含量:

多糖含量(%)=(C×D×F×V)/W×100%

其中：C為樣品液中所含葡萄糖的濃度(mg/mL)；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；F為換算因子；V為樣品溶液體積(mL)；W為藥材干重(mg)。

2.4 提取條件優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)

以雙蒸水為提取溶劑，考查提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間、溫度等對銅皮石斛多糖提取的影響。

精確稱取5.0 g銅皮石斛樣品若干份，按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察不同提取因素對銅皮石斛多糖提取的影響。當(dāng)考察一個(gè)因素影響時(shí)，其他3個(gè)因素均采用第3水平代表的條件。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素水平，按L9(34)正交設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖的最佳提取工藝條件，各因素及水平設(shè)計(jì)見表2，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 鹵蟲毒活性測定

2.5.1 鹵蟲毒活性實(shí)驗(yàn)

按照Nondo[22]、Lin[23]、Badisa[24]及本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的研究方法進(jìn)行鹵蟲毒活性研究實(shí)驗(yàn)[25]。在不加樣連續(xù)培養(yǎng)14～15 h后，觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的鹵蟲存活率不足50%，因此，選取4、8和12 h培養(yǎng)后的鹵蟲存活數(shù)作為評價(jià)指標(biāo)。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)水平表

2.5.2 鹵蟲毒活性計(jì)算方法

采用校正死亡率作為霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖的鹵蟲毒活性評價(jià)指標(biāo)，計(jì)算方法如下：

校正死亡率(%)=(空白存活數(shù)-加樣存活數(shù))/空白存活數(shù)×100%

LD50值為校正死亡率為50%時(shí)的藥物濃度，不同濃度的鹵蟲數(shù)存活數(shù)取其平均值通過LD50算出鹵蟲毒活性。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取次數(shù)對多糖提取的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，銅皮石斛多糖含量隨著浸提次數(shù)增長逐漸增長，浸提3次后，測得的多糖含量增長不明顯，表明樣品中所含的多糖接近提取完全。因此選擇浸提2次、3次和4次作為正交試驗(yàn)考察范圍。

圖2 提取次數(shù)對多糖提取的影響

3.2 料液比對多糖提取的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，隨料液比的增長提取測得的銅皮石斛多糖含量逐漸增長，當(dāng)料液比超過1∶40之后，多糖含量變化不大，因此，在正交試驗(yàn)中對其進(jìn)一步優(yōu)化，其考察水平選為1∶30，1∶40和1∶50。

圖3 料液比對多糖提取的影響

3.3 提取時(shí)間對多糖提取的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，隨浸提時(shí)間的增長提取測得的銅皮石斛多糖含量逐漸增多，2 h時(shí)提取測得的銅皮石斛多糖含量最高，隨后開始下降?？赡苁且?yàn)殡S著浸提時(shí)間的增加，銅皮石斛中多糖提取逐漸完全，隨著浸提時(shí)間的延長，多糖在持續(xù)高溫下可能發(fā)生斷鏈降解，導(dǎo)致多糖提取含量降低。因此，在正交試驗(yàn)中對其進(jìn)一步優(yōu)化，其考察范圍選為1～2 h。

圖4 提取時(shí)間對多糖提取的影響

3.4 提取溫度對多糖提取的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)，隨浸提溫度的增長提取測得的銅皮石斛多糖含量逐漸增多，60℃浸提時(shí)多糖含量幾乎達(dá)到最大值，80℃提取測得的多糖含量較60℃提取增加不明顯，隨后開始呈現(xiàn)下降趨勢，這可能因?yàn)殡S著提取溫度的增加植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，分子熱運(yùn)動(dòng)加速，從而使多糖充分溶出，當(dāng)溫度過高時(shí)，可能導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)的分解，導(dǎo)致多糖得率逐漸降低。因此，在正交試驗(yàn)中對其進(jìn)一步優(yōu)化，其考察水平選為40℃，60℃和80℃。

圖5 提取溫度對多糖提取的影響

3.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以 L9( 43) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對銅皮石斛提取條件進(jìn)行優(yōu)化。探究霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖的最佳提取條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

由表3中的R值可知，在選取的考察因素中，對多糖提取的影響由大到小依次為溫度>提取時(shí)間>提取次數(shù)>料液比。從表4結(jié)果中可看出，溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比對銅皮石斛多糖含量具有顯著影響。由k值大小可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下銅皮石斛多糖的最佳提取條件組合為A2B2C3D2，此結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相似。在此條件下提取測得霍山產(chǎn)銅皮石斛的多糖含量為25.24%。

3.6 鹵蟲毒活性研究

霍山產(chǎn)銅皮石斛精制多糖的鹵蟲毒活性校正死亡率結(jié)果如表5所示。在選取的給藥培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，測得的鹵蟲校正死亡率與不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的銅皮石斛多糖濃度均具有顯著的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系：隨著多糖濃度的增大鹵蟲的校正死亡率逐漸上升，當(dāng)給藥濃度超過1.0 mg/mL時(shí)，校正死亡率上升趨于平緩。此外，同一給藥濃度，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，鹵蟲的存活個(gè)數(shù)越少，存活率越低。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

表4 方差分析

表5 銅皮石斛多糖校正死亡率 (n=3)

經(jīng)LSD檢驗(yàn)，4、8和12 h各劑量組，鹵蟲毒活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.5)。

銅皮石斛多糖的LD50值計(jì)算結(jié)果表明，給藥培養(yǎng)4 h時(shí)銅皮石斛多糖對鹵蟲毒活性的LD50值為1.03 mg/mL，8 h時(shí)鹵蟲毒活性的LD50值為0.66 mg/mL，12 h時(shí)鹵蟲毒活性的LD50值為0.38 mg/mL。分析表明，銅皮石斛多糖的鹵蟲毒活性與給藥時(shí)間具有一定的相關(guān)性。

4 討論與結(jié)論

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響多糖提取因素的先后順序?yàn)闇囟?提取時(shí)間>提取次數(shù)>料液比，霍山產(chǎn)銅皮石斛多糖的最佳提取條件為：料液比1∶40，60℃提取3次，每次2 h。此外，本實(shí)驗(yàn)揭示了銅皮石斛多糖具有明顯的鹵蟲毒活性，在選取的給藥培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，測得的鹵蟲校正死亡率與不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的銅皮石斛多糖濃度均具有顯著的量效關(guān)系與時(shí)效關(guān)系，4、8和12 h鹵蟲毒的LD50值分別為1.03、0.66和0.38 mg/mL，本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明[25]，4、8和12 h鐵皮石斛多糖鹵蟲毒的LD50值分別為(5.8±1.4) mg/mL、(1.7±3.1)mg/mL和(0.41±0.04) mg/mL，表明銅皮石斛多糖具有更強(qiáng)的鹵蟲毒活性。

銅皮石斛作為我國傳統(tǒng)中藥材“銅皮楓斗”的原材料，具有良好的藥用價(jià)值及食用價(jià)值，其植株中含有多種生物活性成分，多糖含量尤為豐富?，F(xiàn)代藥理研究表明，多糖具有廣泛的藥理活性。本實(shí)驗(yàn)以鹵蟲的校正死亡率評價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)銅皮石斛多糖具有較強(qiáng)的鹵蟲毒活性，在相同濃度及同一時(shí)間內(nèi)，相較于鐵皮石斛多糖，銅皮石斛多糖鹵蟲毒的LD50值更低，推測可能是由兩種石斛多糖的單糖組成差異造成的。因此，在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步研究兩種石斛的單糖組成及各組成單糖的含量，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，以期進(jìn)一步揭示兩種石斛多糖的鹵蟲毒活性差異機(jī)制。

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The content and brine shrimp larvae toxicities of polysaccharide ofDendrobiummoniliformefrom Huoshan

SI Hua-yang1,2, CHEN Nai-fu2,3, CHEN Nai-dong2,3

(1. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230032; 2. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu’an 237012; 3. West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine, West Anhui University, Lu’an 237012， China)

In order to obtain the optimum condition of the extraction and shrimp larvae toxicities of the polysaccharide fromDendrobiummoniliformefrom Huohan, the effect of the extraction times, extracting time, solid-liquid ratio and extraction temperature on the yield of the polysaccharides from the stems ofD.moniliformewere investigated by single factor experiments and orthogonal experiments, and shrimp larvae toxicity of the polysaccharide was evaluated by corrected mortality. The decreasing order of the four influencing factors affecting the polysaccharide yield were successively extraction temperature, extracting time, solid-liquid ratio and extraction times. The orthogonal experimental results showed that the optimal condition were extraction temperature, 60℃; solid-liquid ration, 1∶40; extracting time, 2 h and extraction times, 3.Being administered for 4 h, 8 h and 12 h, theLD50values of the crude were 1.03, 0.66 and 0.38 mg/mL respectively. Under this condition, the polysaccharide content was 25.24%.Remarkable shrimp larvae toxicity was showed by the polysaccharide of wildingD.moniliformefrom huoshan.

Dendrobiummoniliforme(Linn.)Sw.; polysaccharide; shrimp larvae toxicity; corrected mortality

2016-06-06；

2016-09-27

國家自然科學(xué)基金(81274021,81573536)；中國博士后基金特別資助(2016T90568)；安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(1608085MH221)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A886)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(2015ZD043)

司華陽，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與天然藥物化學(xué)，E-mail:1067027066@qq.com

陳乃富，教授，主要從事植物生化及植物資源開發(fā)應(yīng)用研究，E-mail: naifuchen1962@163.com；陳乃東，博士，教授，E-mail：2004cnd@163.com

Q946

A

2095-1736(2017)03-0064-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.064