小球藻凈化沼液的預(yù)處理方法

孫中亮， 馮雪珂， 李 丹， 孫利芹， 盛清凱， 朱昌雄

(1. 煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 煙臺 264005； 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所， 濟南 250100；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所， 北京 100081)

小球藻凈化沼液的預(yù)處理方法

孫中亮1， 馮雪珂1， 李 丹1， 孫利芹1， 盛清凱2， 朱昌雄3

(1. 煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 煙臺 264005； 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所， 濟南 250100；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所， 北京 100081)

沼液組分復(fù)雜，極易滋生細(xì)菌等微生物，影響微藻對污染物的去除。研究采用添加次氯酸鈉、氯化鈉、氨水和高壓蒸汽滅菌4種方法對沼液進(jìn)行預(yù)處理，通過對比沼液中小球藻的生長狀況和污染物的去除情況，同時通過PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)測培養(yǎng)液中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，考察了預(yù)處理方法對小球藻凈化沼液的影響。研究結(jié)果表明，添加次氯酸鈉的處理方法操作簡單、成本低廉，并且可以顯著減少沼液中微生物的種類和數(shù)量；在使用60%的沼液作為培養(yǎng)基時，藻細(xì)胞密度可達(dá)4.78×107個/mL；培養(yǎng)7 d后，總氮去除率為76.9%，總磷去除率為46.6%，氨氮去除率為97.1%，COD去除率為72.8%，達(dá)到畜禽養(yǎng)殖業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)。

小球藻; 沼液凈化; 滅菌方法; 微生物群落

Different pretreatment methods for biogas slurry
purification byChlorellavulgaris

SUN Zhong-liang1, FENG Xue-ke1, LI Dan1,
SUN Li-qin1, SHENG Qing-kai2, ZHU Chang-xiong3

(1. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005; 2. Institute of Animal Science and Veterinary
Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100; 3. Institute of Environment and
Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

近年來，集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，產(chǎn)生的大量動物排泄物對環(huán)境產(chǎn)生了一定的破壞，如滋生細(xì)菌病毒、產(chǎn)生惡臭、污染飲用水以及引起自然水體的富營養(yǎng)化等[1-2]。目前，國家大力推廣沼氣工程(厭氧消化技術(shù))，雖然在一定程度上緩解了畜禽養(yǎng)殖糞便給環(huán)境帶來的壓力，但是產(chǎn)生的沼液仍含有大量的有機物、氮和磷等，被視為高濃度污水[3-5]。處理沼液的主要方法有好氧微生物處理、生物塘法、人工濕地以及膜處理等，但是限于處理成本和對沼液中氮、磷脫除效果不佳等問題，上述方法在養(yǎng)殖企業(yè)中推廣緩慢[2,6-7]。

微藻種類多樣，適應(yīng)性強，能夠在復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中生長[8-9]。沼液中富含碳、氮、磷等元素，可以為微藻生長提供營養(yǎng)。將沼液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)微藻，不僅可以降低污染物濃度，而且收獲的藻細(xì)胞利用途徑多樣，如生產(chǎn)生物柴油、藻多糖和動物飼料等[1]。Craggs驗證了在示范規(guī)模的跑道池條件下，微藻不但能夠有效凈化污水，而且能夠?qū)崿F(xiàn)生物柴油的經(jīng)濟性生產(chǎn)[10]。譚芬等利用小球藻處理豬糞發(fā)酵后的沼液，經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化，可將其中氨氮去除93.5%，藻細(xì)胞生物量產(chǎn)率達(dá)675.06 mg/L·d，其中藻多糖含量為44.3%[11]。劉雪等發(fā)明了將廢水培養(yǎng)、收集、沉淀的微藻與玉米皮作為發(fā)酵的底物生產(chǎn)生豬飼料的方法[12]。目前，由微藻介導(dǎo)的新型畜禽養(yǎng)殖污水處理技術(shù)以其經(jīng)濟性、環(huán)保性、可操作性強等優(yōu)勢，已逐漸成為污水處理領(lǐng)域中重要的研究方面。

沼液中除含有微藻生長所需的營養(yǎng)元素外，還含有較多的懸浮顆粒，具有較高的濁度，組分和理化性質(zhì)隨厭氧消化的批次不同而變化很大，極易滋生細(xì)菌等微生物，進(jìn)而影響后續(xù)微藻凈化的效果[13]。因此，對沼液進(jìn)行預(yù)處理是整個凈化過程的重要組成部分。目前，已有較多關(guān)于污水前處理和微藻培養(yǎng)基預(yù)處理的報道。如巫小丹等使用漂白粉處理養(yǎng)豬沼液以殺滅食藻害蟲[14]；黃園等對比了苦皮藤素等植物源殺蟲劑對微藻培養(yǎng)液中輪蟲的殺滅效果[15]；王偉偉等對比了加熱法、臭氧消毒法和次氯酸鈉消毒法對海水養(yǎng)殖廢水的處理效果，結(jié)果表明次氯酸鈉消毒養(yǎng)殖廢水較適宜微藻的生長[16]；Soletto等研究了批式和補料-批式培養(yǎng)模式下，銨根對螺旋藻及培養(yǎng)基中其他微生物菌群的影響[17]；高斌對比了5種消毒劑處理微藻培養(yǎng)基對小球藻和三角褐指藻生長的影響，結(jié)果顯示在消毒劑的作用下，微藻生長延滯期延長[18]。盡管上述方法都取得了一定的效果，但是多數(shù)研究忽略了消毒劑的二次污染問題，且缺乏處理過程中微生物尤其是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的監(jiān)測。Huang等研究了細(xì)菌對微藻凈化沼液效果的影響，結(jié)果顯示多數(shù)細(xì)菌的存在降低了氮、磷的去除效率[19]。因此，監(jiān)測微藻凈化沼液過程中微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，找到簡單、方便、高效、環(huán)保的防控方法至關(guān)重要。

本研究選擇次氯酸鈉消毒法、氨水消毒法以及實驗室常用的氯化鈉消毒和高壓蒸汽滅菌方法，對比了不同預(yù)處理方法對養(yǎng)豬場沼液的滅菌效果和對微藻生長、污染物去除情況的影響，并通過分子生物學(xué)的手段分析了滅菌前后和微藻處理過程中微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，以期為微藻凈化沼液的規(guī)模化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本實驗所用藻種為小球藻(Chlorellavulgaris)，原種從中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫購得，編號為FACHB-31，后經(jīng)本實驗室按照梯度沼液培養(yǎng)的方式馴化得到。

沼液取自煙臺市牟平區(qū)某養(yǎng)豬場。

實驗所用的主要試劑包括次氯酸鈉、氨水、氯化鈉、氧化鈣、鹽酸等。DNA的提取采用上海金畔生物科技有限公司的FastDNA土壤樣品提取試劑盒。

1.2 主要儀器

752S紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司生產(chǎn))、 LXJ-IIB低速大容量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))、顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)、血球計數(shù)板(上海醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、PCR儀(德國Biometra公司)、電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠圖像處理系統(tǒng)(UVP)。

1.3 實驗方法

1.3.1 沼液的預(yù)處理

豬場沼液中含有大量的不溶物，致使水體十分渾濁，透光性差，因此在使用前需要進(jìn)行固液分離。具體操作為：將沼液曝氣處理2 h(過濾空氣，通氣量為0.3 vvm)，靜置沉降一段時間后用脫脂棉進(jìn)行簡單過濾，取過濾液待用。

根據(jù)先期試驗的結(jié)果，本實驗選取預(yù)處理方法的具體操作為：1)高壓蒸汽滅菌：在蒸汽壓為103.4 kPa、溫度為121 °C的條件下，將沼液滅菌20 min；2)次氯酸鈉：向沼液中添加3 mL/L的次氯酸鈉(有效氯含量為390 mg/L)，混合均勻后靜置24 h，然后通入過濾空氣，用淀粉碘化鉀試紙檢測余氯，并用硫代硫酸鈉中和；3)氯化鈉：向沼液中添加0.2 mol/L氯化鈉，混合均勻后待用；4)氨水：向沼液中添加體積分?jǐn)?shù)為0.04%的氨水。各預(yù)處理方式分別設(shè)置3組平行。

1.3.2 小球藻的培養(yǎng)方法

在振蕩光培養(yǎng)箱中采用三角瓶進(jìn)行微藻的擴培。以BG11為培養(yǎng)基，使用1000 mL三角瓶(培養(yǎng)體積為500 mL)在培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，振蕩速率為100 r/min；調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為25°C，由日光燈管提供光強為100 μmol/m2·s的24 h連續(xù)光照。待擴培的小球藻達(dá)到對數(shù)生長期后，于無菌條件下離心，待用。

將離心后的小球藻接種于5 L的三角瓶中，培養(yǎng)體積為3 L，沼液濃度為60%，并使得接種后的藻細(xì)胞密度約為1.5×107個/mL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0左右。培養(yǎng)過程中通入過濾空氣(濾膜孔徑為0.22 μm，通氣量為0.1 vvm)，控制室溫在(25±3)℃，由日光燈管提供光強為100 μmol/m2·s的24 h連續(xù)光照，每天定時使用鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值至7.0左右。

培養(yǎng)過程中取樣觀察藻細(xì)胞形態(tài)并計數(shù)；離心除藻后測定總氮、總磷、氨氮和COD的濃度。

1.3.3 水質(zhì)指標(biāo)的測定方法

1.3.4 微生物群落分析方法

1)培養(yǎng)液的預(yù)處理。

分別取由不同方法處理的沼液50 mL，并借助玻璃砂芯的抽濾裝置，先用高溫滅菌過的濾紙過濾掉沉淀雜質(zhì)，再用孔徑為0.45 μm的微孔過濾薄膜過濾大顆粒雜質(zhì)，最后用孔徑為0.22 μm微孔過濾薄膜將水體中的細(xì)菌抽濾在濾紙上，然后將濾紙用無菌剪刀剪切到FastDNA土壤樣品提取試劑盒的Lysing Matrix E Tube中，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

在培養(yǎng)的不同階段取培養(yǎng)液50 mL，按照同樣的方法進(jìn)行預(yù)處理后備用。

2)DNA的提取和分析。

利用上海金畔生物科技有限公司的FastDNA土壤樣品提取試劑盒，并按照其說明書提取不同階段的DNA。提取后電泳檢測DNA的完整性，并將提取后的DNA稀釋作為PCR實驗的模板,將V3區(qū)片段進(jìn)行擴增，采用的V3區(qū)特異性引物為341f(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，并且在其5′端加入一段GC夾子(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)和518r (5′- ATTACCGCGGCTGCTGG -3′)，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。以PCR產(chǎn)物為模板，利用DGGE技術(shù)分析樣品中的微生物群落，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照和Image Lab軟件分析圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方法對沼液組成的影響及滅菌效果

利用微藻處理沼液的關(guān)鍵是保證微藻在處理系統(tǒng)中始終保持競爭優(yōu)勢，因此，在進(jìn)行微藻培養(yǎng)之前，對沼液進(jìn)行滅菌有利于縮短接種后的延滯期，提高微藻細(xì)胞的競爭優(yōu)勢[21]。采用不同的預(yù)處理方法可能對沼液組成產(chǎn)生一定的影響，表1對比了沼液處理前后各污染物的濃度變化?？梢钥闯?，經(jīng)氨水處理之后，沼液中總氮和氨氮濃度有了顯著增加，分別提高了15.8%和20.2%，在一定程度上增加了沼液的污染負(fù)荷；而高壓滅菌處理、次氯酸鈉處理和氯化鈉處理前后，沼液各污染物濃度變化并不明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)，石河子大學(xué)本科生學(xué)習(xí)動機居中等程度。經(jīng)過對數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，總平均分小于臨界的比例相當(dāng)大，共96人，即有52.17%的大學(xué)生學(xué)習(xí)動機水平不高；總平均分高于4分的（學(xué)習(xí)動機較強）僅4人，占總?cè)藬?shù)的2.17%。從總體上看，本研究證實了當(dāng)今大學(xué)生學(xué)習(xí)動機偏低，只有在能力追求維度上得分接近4分，其余均不到3分。因此，需要在教育教學(xué)中重視石河子大學(xué)本科生的學(xué)習(xí)動機。

表1 不同預(yù)處理方法對沼液組成的影響

為了更加清晰地對比不同方法處理前后沼液中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，對不同處理的樣品進(jìn)行了DNA的提取和DGGE圖譜比較(圖1)。應(yīng)用Image Lab軟件自動檢測不同方法處理的沼液中菌群DGGE圖譜上條帶的位置及亮度(圖譜上處于不同水平線上的條帶代表不同的細(xì)菌，條帶亮度反映單一細(xì)菌在細(xì)菌群落中的含量)，檢測靈敏度為25%。如圖1所示，經(jīng)4種方式預(yù)處理后的沼液，微生物組成不一樣，與1號未處理樣品相比，經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理的5號沼液中不含任何細(xì)菌，經(jīng)次氯酸鈉處理的2號沼液中細(xì)菌種類相對較少，然而經(jīng)氨水及氯化鈉處理的3、4號沼液中細(xì)菌種類沒有太大變化，由此可以說明高壓蒸汽滅菌、添加次氯酸鈉處理沼液具有較好的殺菌效果。

2.2 不同預(yù)處理方法對小球藻生長的影響

經(jīng)固液分離后，將不同方法預(yù)處理的沼液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻(沼液濃度為60%)，藻細(xì)胞的生長曲線如圖2所示?？傮w上，高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理的沼液作為培養(yǎng)基時，小球藻生長較快，積累的藻細(xì)胞濃度較高；而在添加氯化鈉或氨水處理的條件下，雖然小球藻生物量也有一定的積累，但是接種后延滯期長，且較早進(jìn)入衰退期，說明沼液使用前滅菌越徹底，對小球藻的生長越有利。

圖1 不同滅菌處理后沼液中微生物群落結(jié)構(gòu)

A：DGGE指紋圖譜， B：DGGE模式圖。1：未處理；2：NaClO處理；3：氨水處理；4：NaCl處理；5：高壓滅菌處理

如圖2所示，處于對數(shù)生長期的小球藻藻種在接入新的培養(yǎng)環(huán)境后，都經(jīng)歷了一定時間的延滯期。由于沼液使用前滅菌徹底，高壓蒸汽滅菌處理后小球藻的生長延滯期最短，為1 d；次氯酸鈉處理后，延滯期為2 d，這一方面是由于培養(yǎng)液中仍有少量細(xì)菌與小球藻細(xì)胞形成生長競爭，另一方面，中和不徹底可能導(dǎo)致培養(yǎng)液中存在次氯酸根離子，也會對藻細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用；在沼液中添加氯化鈉后，培養(yǎng)液的離子強度增加，一些細(xì)菌因為細(xì)胞內(nèi)外離子強度的差異導(dǎo)致細(xì)胞失水或者溶脹而死亡，小球藻細(xì)胞在進(jìn)入新生境后，為了適應(yīng)培養(yǎng)液中離子強度的變化，經(jīng)歷了4 d的延滯期；與其他3種預(yù)處理方法相比，添加氨水的副作用最大，主要是因為氨對小球藻的生長有顯著的抑制作用，文獻(xiàn)報道，當(dāng)培養(yǎng)基中銨根離子濃度達(dá)到5 mmol/L時，小球藻的生長速率顯著降低[22]，實驗中添加0.04%的氨水(折算為銨根濃度為5.34 mmol/L)，導(dǎo)致小球藻生長的延滯期較長(4 d)。

圖2 不同滅菌方法對小球藻生長的影響

經(jīng)歷不同時長的延滯期后，小球藻進(jìn)入快速生長期，高壓蒸汽滅菌處理和添加次氯酸鈉處理條件下，小球藻生長較快，獲得的最高藻細(xì)胞密度分別為5.00×107個/mL和 4.78×107個/mL。具體是當(dāng)培養(yǎng)至第6天時，兩種處理方法條件下的藻細(xì)胞密度分別達(dá)到4.38×107個/mL和 4.24×107個/mL，之后小球藻生長進(jìn)入穩(wěn)定生長期，最終在第8天獲得最大藻細(xì)胞密度，并于第9天開始衰亡期，觀察發(fā)現(xiàn)此時培養(yǎng)液開始變黃。分別取第6天和第9天的培養(yǎng)液，過濾除藻后提取微生物DNA，分析在穩(wěn)定期和衰亡期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖3所示。可以看出，在高壓蒸汽滅菌處理后，小球藻生長過程中仍不可避免地受到了細(xì)菌的污染(圖3中4號)，推測是源自空氣中的細(xì)菌。對比穩(wěn)定期和衰亡期的細(xì)菌結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，衰亡期的培養(yǎng)液中細(xì)菌種類明顯增多，主要是因為小球藻在培養(yǎng)后期生長緩慢，在沼液系統(tǒng)中競爭優(yōu)勢減弱，導(dǎo)致細(xì)菌增多，而其他微生物的生長進(jìn)一步影響了小球藻的增殖，是致使藻細(xì)胞開始衰亡的重要原因。

圖3 小球藻生長穩(wěn)定期和衰亡期培養(yǎng)液中微生物群落結(jié)構(gòu)

A：DGGE指紋圖譜；B：DGGE模式圖。1：NaClO處理組生長消亡期；2：高壓滅菌處理組生長消亡期；3：NaClO處理組生長穩(wěn)定期；4：高壓滅菌處理生長穩(wěn)定期

添加氯化鈉或氨水處理條件下，獲得的最高藻細(xì)胞密度較低，分別為3.89×107個/mL和 3.77×107個/mL，并且與高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理相比，二者較早地進(jìn)入了衰亡期(第7天)。在小球藻生長過程中，能夠消耗沼液中的碳、氮和磷等元素，因此小球藻的生長速率越快，沼液凈化的效率越高。對比不同預(yù)處理條件下的小球藻生長曲線(圖2)可以發(fā)現(xiàn)，高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理較有利于小球藻的生長。

在微藻培養(yǎng)過程中，尤其是將沼液等污水作為培養(yǎng)基使用時，較易出現(xiàn)細(xì)菌的滋生。Wang等從自然條件下篩選出與柵藻共生的多種細(xì)菌，并設(shè)計單種細(xì)菌與柵藻的混合培養(yǎng)[23]，結(jié)果顯示，Brevundimonasaurantiaca、Rhizobiumsp.、Pseudomonassp.、Acidovoraxfacilis和Diaphorobactersp.分別與柵藻共同培養(yǎng)時能夠促進(jìn)微藻生長，主要原因是這些細(xì)菌有效地降低了微藻的胞外分泌物，減少了對生長的抑制，但是在其他單個細(xì)菌或多種細(xì)菌與柵藻的共培養(yǎng)體系中，微藻生長速率均降低。Halfhide等研究了無菌和有菌條件下，微藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理效率，結(jié)果顯示，有菌條件下小球藻的生長受到明顯抑制，可能與藻類和細(xì)菌競爭營養(yǎng)元素(如N元素)有關(guān)[24]。盡管部分有益菌可以通過分解培養(yǎng)液中有機物的方式降低對微藻生長的抑制作用，或者為微藻生長提供無機營養(yǎng)元素和CO2等，但是單一有益菌和微藻共生的體系構(gòu)建和維持的難度較大。因此，在微藻處理沼液等污水時，預(yù)處理過程應(yīng)盡量減少細(xì)菌的種類和數(shù)量，保證微藻的生長優(yōu)勢。

2.3 不同預(yù)處理方法對微藻去除污染物的影響

圖4描述了小球藻在凈化沼液的過程中，總氮、總磷、氨氮和化學(xué)需氧量的消減情況。從圖4中可以看出，無論采用哪種預(yù)處理方法，沼液中的污染物濃度都隨時間的延長而出現(xiàn)不同程度的降低?？傮w而言，在小球藻的快速生長期，污染物去除速率較快，主要是因為該階段小球藻代謝旺盛，相對凈化能力強。對比4種沼液預(yù)處理方法可以發(fā)現(xiàn)，高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉條件下，污染物去除率較高(表2)。

圖4 不同滅菌方法對污染物去除的影響

具體地，當(dāng)培養(yǎng)至第7天時，高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理條件下的小球藻生長處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中的總氮、總磷和COD濃度降至最低，分別為126.77 mg/L、6.50 mg/L、356.00 mg/L和115.50 mg/L、7.92 mg/L、312.5 mg/L，氨氮濃度分別降至18.85 mg/L和9.72 mg/L。雖然小球藻于第9天進(jìn)入衰亡期，但是氨氮濃度繼續(xù)降低，主要原因是在堿性條件下，銨態(tài)氮主要以氨分子形態(tài)存在，受曝氣操作影響，較易揮發(fā)。不同的是，培養(yǎng)液中總氮、總磷和COD濃度在衰亡期有增加的趨勢，主要是因為細(xì)胞自溶，胞內(nèi)有機物等釋放到培養(yǎng)液中。

表2 小球藻對污染物的最大去除率

從圖4中還可以看出，添加氯化鈉或氨水處理條件下污染物去除速率較慢，這主要與小球藻的生長情況有關(guān)。尤其是添加氨水的操作會增加沼液中氮的含量，進(jìn)一步惡化了水質(zhì)，而且殘留氨對微藻生長產(chǎn)生不利影響(圖2)，增加了小球藻去除污染物的難度。表2中列出了不同預(yù)處理條件下，沼液中各污染物的最高去除率，可以得出高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理條件下污染物的去除率較高，如用次氧酸鈉處理總氮去除率76.9%、總磷46.6%、氨氮97.1%、COD 72.8%，與畜禽養(yǎng)殖業(yè)水污染物最高允許排放濃度(氨氮80 mg/L、總磷8.0 mg/L、化學(xué)需氧量400 mg/L)對比[25]，沼液經(jīng)過高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉預(yù)處理后，小球藻可以迅速代謝掉其中的污染物，并經(jīng)過7 d的凈化即可達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。

表3 不同預(yù)處理方法的成本比較

表3對不同文獻(xiàn)報道的沼液預(yù)處理方法的成本進(jìn)行了比較?？梢钥闯?，使用漂白粉處理養(yǎng)豬沼液的成本最低，為0.05元/t，其次是使用次氯酸鈉處理，成本為0.14元/t，而采用氫氧化鈣和高壓蒸汽滅菌的方法成本較高。然而，采用添加漂白粉的方法，沼液需至少放置4 d，才可進(jìn)行接種、培養(yǎng)微藻，此外該方法引入了鈣離子，造成水的硬度增加，形成二次污染。高壓蒸汽滅菌效果雖然最為理想，但是由于處理成本較高(65.3元/t)，操作難度較大，在實際情況下是不可能實現(xiàn)的。綜合不同預(yù)處理方法的滅菌效果、對小球藻生長情況和污染物去除率的影響以及成本，優(yōu)選添加次氯酸鈉作為沼液預(yù)處理的方法。

3 結(jié)論

通過對比4種沼液的預(yù)處理方法，考察了對沼液的滅菌情況、小球藻的生長以及污染物的去除情況，綜合實驗結(jié)果，得到以下結(jié)論：

1)DGGE分析說明高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理沼液的方法，可以顯著減少培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)菌種類和數(shù)量，有利于小球藻保持生長優(yōu)勢；

2)高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理條件下，小球藻生長延滯期分別為1 d和2 d，并且經(jīng)過8 d的生長獲得了最大藻細(xì)胞密度，分別為5.00×107個/mL和 4.78×107個/mL；

3)經(jīng)過7 d的凈化處理，在高壓蒸汽滅菌和添加次氯酸鈉處理條件下，沼液中污染物的去除率相近，如次氯酸鈉處理總氮去除率76.9%、總磷46.6%、氨氮97.1%、COD 72.8%，達(dá)到畜禽養(yǎng)殖業(yè)污水排放標(biāo)準(zhǔn)；

4)綜合分析沼液預(yù)處理方法的成本和操作難度，在由微藻介導(dǎo)的沼液凈化工藝中，優(yōu)選添加次氯酸鈉的預(yù)處理方法。

[1]趙立欣,宋成軍,董保成,等.基于微藻養(yǎng)殖的沼液資源化利用與高價值生物質(zhì)生產(chǎn)耦合技術(shù)研究[J]. 安全與環(huán)境學(xué)報, 2012, 12(3): 61-65.

[2]馮星蓮. 畜禽養(yǎng)殖的污染防治與應(yīng)對策略[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2015(7): 41-42.

[3]武深樹,譚美英,劉 偉. 沼氣工程對畜禽糞便污染環(huán)境成本的控制效果[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 20(2): 247-252.

[4]李寶玉,畢于運,高春雨,等. 我國農(nóng)業(yè)大中型沼氣工程發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題與對策措施[J]. 中國農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃, 2010, 31(2): 57-61.

[5]韓 芳,林 聰. 畜禽養(yǎng)殖場沼氣工程厭氧消化技術(shù)優(yōu)化分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2011, 27(S1): 41-47.

[6]稅 勇,川岸朋樹,宋小燕,等. 兩種膜生物反應(yīng)器處理養(yǎng)豬沼液的比較研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2015, 36(9):3319-3328.

[7]白曉鳳,李子富,閆園園,等. 吹脫與鳥糞石沉淀組合工藝處理中溫厭氧發(fā)酵沼液研究[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報, 2015, 46(12): 218-225.

[8]杜 奎,梁 芳,耿亞洪,等. 利用煙道氣培養(yǎng)微藻的機制與應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報, 2015, 31(2): 1-9.

[9]梅 帥,趙鳳敏,曹有福,等. 利用污水養(yǎng)殖微藻研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程, 2013, 3(5): 12-16.

[10]CRAGGS R J, HEUBECK S, LUNDQUIST T J, et al. Algal biofuels from wastewater treatment high rate algal ponds[J]. Water Science & Technology, 2011, 63(4):660-665.

[11]譚 芬. 小球藻利用豬糞發(fā)酵沼液產(chǎn)碳水化合物的研究[C]. 2015年中國化工學(xué)會年會論文集，2015：122.

[12]劉 雪,盛清凱,耿 兵,等. 一種廢水微藻加工飼料的方法[P]. 北京: CN104982731A, 2015-10-21.

[13]楊 祎,陳立文,陳必鏈,等. 微藻凈化沼液產(chǎn)業(yè)化研究進(jìn)展[J]. 中國沼氣, 2015, 33(4): 49-53.

[14]巫小丹,劉 偉,阮榕生,等. 不同預(yù)處理方法對沼液養(yǎng)殖微藻的影響[J]. 環(huán)境污染與防治, 2014, 36(1): 9-12.

[15]黃 園. 微藻培養(yǎng)過程中輪蟲污染防治研究[D]. 青島: 中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所), 2014：30-41.

[16]王偉偉, 陳書秀, 錢 瑞,等. 海水養(yǎng)殖廢水預(yù)處理方法與微藻藻種篩選[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014(3):181-185.

[17]SOLETTO D, BINAGHI L, LODI A, et al. Batch and fed-batch cultivations ofSpirulinaplatensisusing ammonium sulphate and urea as nitrogen sources[J]. Aquaculture, 2005, 243(1-4):217-224.

[18]高 斌. 五種消毒劑對海水微藻生長及營養(yǎng)鹽動態(tài)變化的影響[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2005：30-50.

[19]HUANG W, LI B, CHAO Z, et al. Effect of algae growth on aerobic granulation and nutrients removal from synthetic wastewater by using sequencing batch reactors[J]. Bioresource Technology, 2015, 179:187-192.

[20]國家環(huán)境保護(hù)總局,水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 北京: 中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002：200-284.

[21]王少沛,曹煜成,李卓佳,等. 水生環(huán)境中細(xì)菌與微藻的相互關(guān)系及其實際應(yīng)用[J]. 南方水產(chǎn), 2008, 4(1): 76-80.

[22]陳 峰,姜 悅. 微藻生物技術(shù)[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999：55-91.

[23]WANG R, XUE S, ZHANG D, et al. Construction and characteristics of artificial consortia ofScenedesmusObliquus-bacteria forS.Obliquusgrowth and lipid production[J]. Algal Research, 2015, 12(6): 436-445.

[24]HALFHIDE T, KERSTR M A, LEKANG O I, et al. Production of algal biomass,Chlorophyll, starch and lipids using aquaculture wastewater under axenic and non-axenic conditions[J]. Algal Research, 2014, 6: 152-159.

[25]GB 18596-2001. 畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[26]LEI X, SUGIURA N, FENG C, et al. Pretreatment of anaerobic digestion effluent with ammonia stripping and biogas purification [J]. Journal of Hazardous Materials, 2007, 145(3): 391-397.

[27]徐嘉杰. 沼液規(guī)模化培養(yǎng)小球藻的能源利用技術(shù)研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014： 39-46.

Chlorellavulgaris; biogas slurry purification; sterilization methods; microbial community

2016-05-30；

2016-06-27

國家“十二五”水專項湖泊主題-巢湖項目(編號：2013ZX07103006-007)；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目(編號：魯財農(nóng)指[2016] 36號)

孫中亮，講師，主要從事微藻凈化沼液的研究工作,E-mail: zlsun2015@163.com

孫利芹，教授，主要從事廢水微藻資源化利用技術(shù)研究，E-mail: sliqin2005@163.com

Q949.21+7；X703

B

2095-1736(2017)03-0099-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.099