鯉皰疹病毒3型焦磷酸測序檢測方法的建立

鄭樹城， 王 慶， 李瑩瑩， 曾偉偉， 王英英， 劉 春， 石存斌

(1． 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室 廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室， 廣州 510380； 2．上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

鯉皰疹病毒3型焦磷酸測序檢測方法的建立

鄭樹城1,2， 王 慶1， 李瑩瑩1， 曾偉偉1， 王英英1， 劉 春1， 石存斌1

(1． 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室 廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室， 廣州 510380； 2．上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

為了針對鯉皰疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)建立一種基于焦磷酸測序技術(shù)的高通量、自動化、快速的檢測方法，根據(jù)CyHV-3ORF55、ORF79和ORF92基因保守區(qū)域設(shè)計特異性PCR擴(kuò)增引物和測序引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選擴(kuò)增效率最高的引物。PCR靈敏性和特異性試驗結(jié)果顯示，針對ORF79設(shè)計的引物擴(kuò)增效率最高，最低檢測量為100個拷貝數(shù)，且能特異性識別CyHV-3；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，獲得的序列經(jīng)BLAST比對顯示與CyHV-3-U、I、J和GZ11分離株一致性均為100%。該檢測方法方便快速，適用于出入境口岸大批量樣品CyHV-3診斷檢測。

鯉皰疹病毒3型；錦鯉皰疹病毒；焦磷酸測序；檢測

鯉皰疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)，又稱為錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)、鯉魚間質(zhì)性腎炎及鰓壞死病毒(Carp interstitial nephritis and gill necrosis virus, CNGV)，是引起鯉魚和錦鯉高度傳染性錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease, KHVD)的病原[1-3]。該病一般發(fā)病于春秋季節(jié)，發(fā)病溫度為18℃～28℃，患病魚常出現(xiàn)食欲不振、兩眼凹陷、體色發(fā)黑、腹腔和鰓出血、鰓發(fā)白、皮膚出現(xiàn)白色斑點、黏液分泌過多等癥狀[4-5]。該病自從1997年在德國首次報道以來，全球多個國家報道了由鯉皰疹病毒3型引起的鯉魚或錦鯉大量死亡的現(xiàn)象[6-7]。2002年，中國首次從進(jìn)口錦鯉中檢測到該病毒，此后華南、東北等地區(qū)相繼有錦鯉皰疹病毒病暴發(fā)的報道[8-11]。錦鯉皰疹病毒病具有很高的發(fā)病率和死亡率，給鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，及時對CyHV-3進(jìn)行檢測診斷有利于遏制疾病進(jìn)一步擴(kuò)散。

目前，CyHV-3的檢測診斷方法主要包括細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離、分子生物學(xué)方法[12-14](PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù))、酶聯(lián)免疫吸附劑試驗[15](Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等等。近年來，隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，不少學(xué)者嘗試應(yīng)用其他更加便捷的技術(shù)對CyHV-3進(jìn)行診斷檢測[16-18]。其中，備受青睞的焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)具有很高的應(yīng)用價值。焦磷酸測序技術(shù)是1987年建立的一項二代DNA測序技術(shù)[19-20]。因其具有高通量、敏感快速、實時檢測、無須電泳及不需要熒光標(biāo)記等特點在微生物鑒定分型、單核苷酸多態(tài)性和DNA甲基化等研究中受到越來越廣泛的應(yīng)用。本文通過對CyHV-3ORF55、ORF79和ORF92 3個基因保守區(qū)域設(shè)計特異性擴(kuò)增引物和測序引物，篩選最佳擴(kuò)增引物建立焦磷酸測序檢測方法，擬為CyHV-3實驗室的診斷尤其是口岸檢疫提供一種快速準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

鯉皰疹病毒3型由本實驗室分離；鯉春病毒血癥病毒、大口黑鱸虹彩病毒、傳染性脾腎壞死病毒、鯉皰疹病毒2型、草魚呼腸孤病毒由本實驗保存。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α由本實驗室制備；質(zhì)粒pMD18-T購自寶生物工程(大連) 有限公司。

1.1.3 主要試劑

DNA及RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自O(shè)mega公司；rTaq酶購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI登錄的KHV全基因組信息(DQ657948、DQ177346、AP008984)查找編碼DNA聚合酶基因(ORF79)、胸苷激酶基因(ORF55)和主要衣殼蛋白基因(ORF92)的保守區(qū)域，運用焦磷酸測序檢測系統(tǒng)PSQ Assay Design 2.0軟件分析，設(shè)計擴(kuò)增引物和測序引物(表1)。引物由上海生工生物公司合成。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及陽性質(zhì)粒構(gòu)建

基因組提取按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR體系：10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L引物各2 μL，rTaq(5 U/μL) 0.5 μL，模板4 μL，補(bǔ)滅菌水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 本實驗用到的引物序列

將擴(kuò)增目的片段純化回收后，與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定并由上海生工生物公司完成測序。提取陽性質(zhì)粒并測定DNA濃度，換算為拷貝數(shù)后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分析PCR擴(kuò)增最低拷貝量。

1.2.3 焦磷酸測序

焦磷酸測序服務(wù)由北京六合華大基因科技有限公司提供。在96孔PCR反應(yīng)板中加入反應(yīng)結(jié)合珠2 μL，結(jié)合緩沖液38 μL，PCR產(chǎn)物40 μL，室溫下充分混勻10 min。開啟真空泵吸取結(jié)合珠及PCR產(chǎn)物混懸液，依次浸入70% 乙醇、0.2 mol/L NaOH和沖洗緩沖液中各5 s；關(guān)閉真空泵，后將探頭上結(jié)合珠及PCR產(chǎn)物置入40 μL退火緩沖液(含測序引物1.5 μL)，85℃變性2 min，冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。根據(jù)Pyrosequencing軟件序列設(shè)計信息計算出劑量，在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及4種dNTP(QIAGEN)，將試劑艙及96孔反應(yīng)板放入Pyrosequencing檢測儀(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)進(jìn)行反應(yīng)，Pyro Q-CpG軟件自動分析并輸出測序序列。

1.2.4 PCR特異性分析

以鯉皰疹病毒2型、大口黑鱸虹彩病毒、傳染性脾腎壞死病毒DNA及草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行PCR特異性檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及靈敏度分析

分別應(yīng)用設(shè)計的ORF79、ORF55和ORF92基因特異性引物，對10倍梯度稀釋的陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR分析(圖1)，3對引物均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的單一條帶，最低檢測拷貝數(shù)分別是102copies/μL、103copies/μL 和104copies/μL，說明ORF79引物擴(kuò)增效率最高，該基因?qū)⒆鳛榘谢蜻M(jìn)行后續(xù)的焦磷酸測序。

2.2 特異性檢測

以多種不同的魚類病毒為模板應(yīng)用ORF79擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示只有以鯉皰疹病毒3型作為模板能擴(kuò)增出目的條帶(圖2)，表明本實驗所設(shè)計的ORF79擴(kuò)增引物具有較高的特異性。

圖1 3對引物的PCR擴(kuò)增電泳圖

Fig 1 PCR amplification with three pairs of primers

1～8: 分別為107copies/μL～1 copies/μL 陽性質(zhì)粒; 9：陰性對照, 未感染CyHV-3的錦鯉吻端細(xì)胞(KS); M：DL 1000 DNA Marker

圖2 ORF79擴(kuò)增特異性檢測

1：鯉皰疹病毒3型；2：陰性對照；3：鯉皰疹病毒2型；4：鯉春病毒血癥病毒；5：大口黑鱸虹彩病毒；6：草魚呼腸孤病毒；7：傳染性脾腎壞死病毒； M: DL 1000 DNA Marker

圖3 焦磷酸測序結(jié)果

Fig 3 Results of pyrosequencing

2.3 焦磷酸測序

將ORF79基因引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，測序峰圖顯示序列為：CCGCTTCGAGACCTACACGGCGTCTAGCCTCAACC(圖3)，BLAST比對顯示與KHV-U、I、J、GZ11分離株一致性均為100%，說明該基因能特異識別CyHV-3。

3 討論

錦鯉皰疹病毒病自從1997年在歐洲暴發(fā)以來，迅速在全世界多個國家傳播流行，范圍覆蓋亞洲、北美洲和非洲等多個國家和地區(qū)，對鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性打擊。作為一種頗受大眾喜愛的觀賞魚品種，攜帶CyHV-3的錦鯉有可能借助國際貿(mào)易和展覽銷售繼續(xù)成為CyHV-3傳播的源頭。中國于2002年首次在進(jìn)口錦鯉中檢測到CyHV-3，之后多個地區(qū)出現(xiàn)由CyHV-3感染引起的鯉魚或錦鯉大面積死亡現(xiàn)象，并分離到了包括亞洲型、歐洲型在內(nèi)的病毒株[8-21]。同樣，歐洲地區(qū)也曾分離到亞洲型的毒株[22]。這種不同基因型的病毒株在不同地區(qū)相互輸入的現(xiàn)象提示我國出入境口岸及檢驗檢疫相關(guān)部門不得不提高對CyHV-3檢測診斷的意識。因此，為準(zhǔn)確快速地對CyHV-3進(jìn)行檢測，建立一種適用于出入境口岸診斷的高通量、自動化、快速的CyHV-3檢測方法就顯得十分必要。

目前，很多國家地區(qū)的研究人員已建立了多種CyHV-3的檢測方法。雖然細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)是病毒病最準(zhǔn)確的診斷手段，但該病毒的特性及技術(shù)操作本身的繁雜耗時使其成為快速診斷的局限。捕獲抗原或抗體的ELISA技術(shù)在魚的疾病感染狀態(tài)檢測中具有重要的作用，但靈敏度不夠高的缺陷限制了其在檢測上廣泛應(yīng)用，因此基于ELISA的CyHV-3抗原或抗體檢測常作為一種診斷的輔助工具[23-24]。實際上，PCR及其延伸技術(shù)如巢式PCR、實時熒光定量PCR等技術(shù)在疾病流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用最廣泛，常常成為檢測的首選。其中，基于TK[12]、Sph1-5改進(jìn)的PCR及Gilad 等建立的實時定量PCR具有更高的靈敏度而被OIE推薦為CyHV-3的分子檢測方法[13-25]。

該研究應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)建立了一種新的CyHV-3檢測方法。焦磷酸測序技術(shù)是由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶催化同一反應(yīng)體系的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。該測序系統(tǒng)能在1 h左右對大量樣品進(jìn)行測序，極大地提高了工作效率。在微生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有較廣泛的應(yīng)用。如國內(nèi)研究人員應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)對牛病毒性腹瀉病毒[26]、施馬倫貝格病毒[27]、豬甲型H1N1流感病毒[28]等病毒進(jìn)行鑒定分型；Gu等運用多重焦磷酸測序技術(shù)對大腸桿菌E.coliO157 株的5個單核苷酸多態(tài)性位點進(jìn)行檢測分析，從而達(dá)到對大腸桿菌E.coliO157 株進(jìn)行快速分型的目的[29]；Rajeevan等通過焦磷酸測序技術(shù)對感染兩種不同細(xì)胞系的人類乳頭瘤病毒16基因組的L1 基因3′ 端和長調(diào)控區(qū)的19個胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(Cytosine guanine dinucleotide，CpG)位點進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在兩種不同細(xì)胞系的人乳頭瘤病毒存在超過40倍的甲基化修飾差異[30]，這種無須克隆的焦磷酸測序技術(shù)為多個甲基化特異性位點分析提供了便捷的工具。

該研究選擇了CyHV-3 DNA聚合酶基因保守區(qū)域作為檢測靶基因并設(shè)計檢測引物和測序引物，利用焦磷酸測序平臺直接讀取序列，特異性強(qiáng)、方便快速，適用于出入境口岸大批量樣品檢測。

致謝：感謝中國檢驗檢疫科學(xué)研究院王娜老師、張旻老師和景宏麗老師在實驗過程中提供的幫助。

[1]HEDRICK R P, GILAD O, YUN S, et al. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp[J]. J Aquat Anim Health, 2000, 12(1):44-57.

[2]PERELBERG A, SMIRNOV M, HUTORAN M, et al. Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured cyprinus carpio in Israel[J]. Isr J Aquacult-Bamid, 2003, 55(1):5-12.

[3]PIKARSKY E, RONEN A, ABRAMOWITZ J, et al. Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus[J]. J Virol, 2004, 78(17):9544-9551.

[4]GILAD O, YUN S, ADKISON M A, et al. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi[J]. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 10):2661-2667.

[5]COSTES B, RAJ V S, MICHEL B, et al. The major portal of entry of koi herpesvirus in cyprinus carpio is the skin[J]. J Virol, 2009, 83(7):2819-2830.

[6]BRETZINGER A, FISCHER-SCHERL T, OUMOUNA M, et al. Mass mortalities in koi carp, cyprinus carpio, associated with gill and skin disease[J]. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 1999, 19(5):182-185.

[7]BOUTIER M, RONSMANS M, RAKUS K, et al. Cyprinid herpesvirus 3: An archetype of fish alloherpesviruses[J]. Adv Virus Res, 2015, 93:161-256.

[8]李瑩瑩, 王 慶, 曾偉偉,等. 錦鯉皰疹病毒GZ1301株的分離與鑒定[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2014, 38(8):1159-1166.

[9]朱 霞, 李新偉, 王 好, 等. 一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2011, 33(5): 340-343.

[10]劉 葒, 史秀杰, 高隆英, 等. 進(jìn)口錦鯉暴發(fā)病病原的 nested—PCR 鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2002, 21(5): 414-418.

[11]DONG C F, WENG S P, LI W, et al. Characterization of a new cell line from caudal fin of koi, cyprinus carpio koi, and first isolation of cyprinid herpesvirus 3 in China[J]. Virus Res, 2011, 161(2):140-149.

[12]BERCOVIER H, FISHMAN Y, NAHARY R, et al. Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR based diagnosis[J]. BMC Microbiol, 2005, 5:13.

[13]GILAD O, YUN S, ZAGMUTT-VERGARA F J, et al. Concentrations of a koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected cyprinus carpio koi as assessed by real-time Taqman PCR[J]. Dis Aquat Org, 2004, 60(3):179-187.

[14]GUNIMALADEVI I, KONO T, VENUGOPAL M N, et al. Detection of koi herpesvirus in common carp,CyprinuscarpioL., by loop-mediated isothermal amplification[J]. J Fish Dis, 2004, 27(10):583-589.

[15]DISHON A, PERELBERG A, BISHARA-SHIEBAN J, et al. Detection of carp interstitial nephritis and gill necrosis virus in fish droppings[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(11):7285-7291.

[16]VRANCKEN R, BOUTIER M, RONSMANS M, et al. Laboratory validation of a lateral flow device for the detection of CyHV-3 antigens in gill swabs[J]. J Virol Methods, 2013, 193(2):679-682.

[17]SALEH M, EL-MATBOULI M. Rapid detection of Cyprinid herpesvirus-3 (CyHV-3) using a gold nanoparticle-based hybridization assay[J]. J Virol Methods, 2015, 217:50-54.

[18]LIEVENS B, FRANS I, HEUSDENS C, et al. Rapid detection and identification of viral and bacterial fish pathogens using a DNA array-based multiplex assay[J]. J Fish Dis, 2011, 34(11):861-875.

[19]NYRéN P. Enzymatic method for continuous monitoring of DNA polymerase activity[J]. Anal Biochem, 1987, 167(2): 235-238.

[20]AHMADIAN A, EHN M, HOBER S. Pyrosequencing: history, biochemistry and future[J]. Clinica Chimica Acta, 2006, 363(1-2): 83-94.

[21]DONG C, LI X, WENG S, et al. Emergence of fatal European genotype CyHV-3/KHV in mainland China[J]. Vet Microbiol, 2013, 162(1):239-244.

[22]SUNARTO A, MCCOLL K A, CRANE M S J, et al. Isolation and characterization of koi herpesvirus (KHV) from indonesia: Identification of a new genetic lineage[J]. J Fish Dis, 2011, 34(2):87-101.

[23]RONEN A, PERELBERG A, ABRAMOWITZ J, et al. Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured cyprinus carpio[J]. Vaccine, 2003, 21(32):4677-4684.

[24]ADKISON M A, GILAD O, HEDRICK R P. An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the serum of koi cyprinus carpio[J]. Fish Pathol, 2005, 40(2):53-62.

[25]YUASA K, SANO M, KURITA J, et al. Improvement of a PCR method with the sph 1-5 primer set for the detection of koi herpesvirus (KHV)[J]. Fish Pathol, 2005, 40:37-39.

[26]劉海生, 張永強(qiáng), 趙永剛,等. BVDV 1型和2型焦磷酸測序檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2014, 50(7):14-17.

[27]王彩霞, 林祥梅, 張永寧,等. 施馬倫貝格病焦磷酸測序檢測方法的建立[J]. 中國動物檢疫, 2014, 31(10):57-61.

[28]孫 濤, 張?zhí)? 徐 彪,等. 焦磷酸測序技術(shù)在確證豬甲型H1N1流感病毒中的應(yīng)用[J]. 中國動物檢疫, 2011, 28(4):48-52.

[29]GU Y, MAO X, ZHA L, et al. Development of a candidate method for forensic microbial genotyping using multiplex pyrosequencing combined with a universal biotinylated primer[J]. Forensic Sci Int, 2015, 246:e1-e6.

[30]RAJEEVAN M S, SWAN D C, DUNCAN K, et al. Quantitation of site-specific HPV 16 DNA methylation by pyrosequencing[J]. J Virol Methods, 2006, 138(1-2): 170-176.

Development of pyrosequencing assay for detection of Cyprinid herpesvirus 3

ZHENG Shu-cheng1,2, WANG Qing1, LI Ying-ying1, ZENG Wei-wei1, WANG Ying-ying1, LIU Chun1, SHI Cun-bin1

(1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Fishery Drug Development of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology of Guangdong Province, Guangzhou 510380; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To develop one method based on pyrosequencing for high throughput, automated and rapid detection of Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), specific primer pairs for amplification and sequencing were designed that targeting conserved region ofORF55,ORF79 andORF92 gene of CyHV-3, and the optimal primers were screened by PCR amplification. The results of sensitivity and specifity test showed the primers againstORF79 gene are the best primers for PCR amplification with the detection limit as least as 100 copies and specific for the detection of CyHV-3. The sequencing result of pyrosequencing using PCR product indicated the obtained sequence shares 100% identity with CyHV-3-U, I, J and GZ11 isolates. Therefore, this assay could be used as a new tool for the diagnosis of CyHV-3 infections on a large scale samples in ports of exit and entry due to its convenient and rapid characteristic.

Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3); koi herpesvirus (KHV); pyrosequencing; detection

2016-08-08；

2016-09-05

國家科技支撐計劃(2013BAD12B02)

鄭樹城，碩士研究生，主要從事水生病毒學(xué)研究，E-mail：shucheng1991@126.com

王 慶，博士，副研究員，主要從事水生病毒學(xué)研究，E-mail：sunny_929@163.com

Q78

B

2095-1736(2017)03-0095-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.095