甜茶中齊墩果酸及熊果酸的檢測方法的建立

譚冬明，石相莉，*，羅星曄，農(nóng)彥賢，梁煒，黃健

（1.桂林市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，廣西桂林541004；2.桂林市環(huán)境監(jiān)測中心站，廣西桂林541002）

甜茶中齊墩果酸及熊果酸的檢測方法的建立

譚冬明1，石相莉1，*，羅星曄2，農(nóng)彥賢1，梁煒1，黃健1

（1.桂林市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，廣西桂林541004；2.桂林市環(huán)境監(jiān)測中心站，廣西桂林541002）

建立測定甜茶中齊墩果酸及熊果酸的高效液相色譜分析方法。對色譜分析條件及樣品前處理進行優(yōu)化研究，樣品經(jīng)乙醇超聲波提取，醇提水沉進行雜質(zhì)沉淀，以Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，甲醇和0.2%乙酸銨溶液（83∶17）為流動相，檢測波長為210 nm，流速為0.6 mL/min，外標法進行定量。在此條件下，齊墩果酸及熊果酸能達到完全基線分離，分別在2.23 μg/mL～112 μg/mL、1.84 μg/mL～92 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系（R2＞0.999），方法檢出限分別為 0.04、0.08 g/kg。在低中高 3 種含量添加水平的回收率在 92%～102%，RSD（n=6）為0.8%～3.8%。

甜茶；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜

廣西甜茶（Rubus Suavissimus S.Lee）是廣西特有的具有較高食用價值和藥用價值的甜味植物。葉中特有的甜茶苷是一種低熱值、高甜度、安全無毒的天然甜味物質(zhì)，是糖類物質(zhì)的理想替代品。甜茶具有清熱、潤肺、止咳等功效，民間將其作為茶的飲用歷史悠久[1]。甜茶苷、黃酮類、多酚類是甜茶的主要活性成分[2]。經(jīng)文獻查閱，目前對甜茶的研究主要集中在甜茶苷、黃酮類、多酚類的提取工藝[3-8]及其相應的生物活性[9-23]。研究表明，甜茶具有抗氧化[9-11]、抗過敏[12-13]、抗腫瘤[14-15]、降血糖[16]、降血脂[17]、降血壓[18]、抗疲勞及免疫增強[19]、抑制變形鏈球菌作用[20]。有文獻報道甜茶苷和抗癌藥物生成納米粒子復合物，可較大程度提高抗癌藥物的作用[21-23]。譚冬明[24]通過提取分離及波譜學方法鑒定甜茶葉中含有齊墩果酸、熊果酸。齊墩果酸具有抗HIV、抗菌、抗癌、抗?jié)?、治療骨質(zhì)疏松癥等廣泛的藥理作用和生物活性，作為保肝藥物已經(jīng)用于臨床[25-26]。熊果酸具有抗腫瘤、護肝、心血管、糖尿病、抗炎、抗病毒等多種生物活性，在國內(nèi)外受到了廣泛的研究[27]。目前對廣西甜茶中齊墩果酸和熊果酸的定量分析未見相關報道。本試驗研究建立同時測定甜茶中齊墩果酸及熊果酸含量的高效液相色譜分析方法，為甜茶的進一步研究和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜茶葉：分別由來賓市金秀瑤族自治縣金秀縣藝耕堂茶莊及桂林市平樂縣永康漢方茶業(yè)科技有限公司提供；齊墩果酸、熊果酸標準物質(zhì)（純度為≥98%）：成都普菲德生物技術有限公司；甲醇（色譜純）：美國Tedia公司；乙酸銨（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；無水乙醇（分析純）、乙醚（分析純）：西隴化工股份有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

U3000液相色譜儀（配有DAD檢測器）：美國賽默飛世爾公司；SyncoreR12型旋轉(zhuǎn)濃縮儀：瑞士步琦有限公司；AS2060B型超聲波：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TG16-WS型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Elix essential15型純水機：德國默克密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別準確稱取齊墩果酸0.044 6 g，熊果酸0.036 8 g置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，濃度分別為4.460、3.680 mg/mL。分別準確量取一定體積的該標準混合液用70%乙醇水（體積比）逐級稀釋至不同濃度系列，齊墩果酸濃度為 2.23、4.46、11.2、22.3、44.6、112 μg/mL，熊果酸濃度為 1.84、3.68、9.20、18.4、36.8、92.0 μg/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：賽默飛世爾Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（83∶17），流速：0.6 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：210 nm，進樣體積：20 μL，光譜掃描范圍：190 nm～600 nm。

1.3.3 樣品處理

準確稱取搗碎后的樣品0.8 g置于150 mL錐形瓶中，加入10 mL乙醇超聲提取10 min，放置10 min，將上清液慢慢傾斜倒入25 mL容量瓶中，再用10 mL乙醇洗滌殘渣1次，合并洗滌液，用乙醇定容至刻度，搖勻。將乙醇提取液在4 000 r/min下離心5 min，準確量取離心后的溶液7.0 mL于10 mL容量瓶中，緩慢逐滴加水至刻度，搖勻后放置10 min，將溶液過0.45 μm有機系濾頭，上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的確定

采用二極管陣列檢測器（DAD）對齊墩果酸、熊果酸混標溶液在1.3.2中流動相分析條件下進行波長（190 nm～600 nm）掃描。從各自的吸收光譜圖可知，由于齊墩果酸與熊果酸為同分異構(gòu)體，兩者結(jié)構(gòu)及極性極為相似，僅表現(xiàn)在甲基位置的不同，兩個甲基都在20位為齊墩果酸（圖1），分別在19、20位為熊果酸（圖2），兩者的掃描吸收光譜圖相似，其最大吸收波長分別為205、206 nm。甲醇在該波長處附近具有較強背景吸收，且本試驗流動相條件中甲醇比例較高（83%），考慮到分析靈敏度、基線的穩(wěn)定性及背景干擾，本試驗采用210 nm作為檢測波長。

圖1 齊墩果酸Fig.1 Oleanolic acid

圖2 熊果酸Fig.2 Ursolic acid

2.1.2 色譜柱的選擇

齊墩果酸與熊果酸互為同分異構(gòu)體，比較難以分離。本試驗分別研究了賽默飛世爾Hypersil Gold C18、菲羅門Luna C8、菲羅門Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對兩種物質(zhì)的分離效果。Hypersil Gold C18及Gemini C18柱均能取得較好的分離效果，基線能達到完全分離，目標組分在兩種柱子上的分離度（R）分別為1.6、1.5，而采用Luna C8柱分析時，目標組分完全分不開，兩峰合并在一起，色譜圖分別見圖3（a）、圖3（b）、圖 3（c）。Gemini C18柱對兩種物質(zhì)的保留能力較強，出峰時間在37 min～39 min之間，分析耗時較長，且色譜峰峰寬較大，峰寬（50%）均為0.64。采用Hypersil Gold C18柱分析時，兩種物質(zhì)峰形較好且尖銳，峰寬（50%）均為0.38，出峰時間比較合適。為了進一步分析Gemini C18柱對目標組分的分離效果，將流動相流速改為1 mL/min，其余條件同1.3.2。結(jié)果表明，目標組分的出峰時間大大縮短，在22 min～24 min之間出峰，峰寬變窄（0.45），但分離度降低至1.3，兩峰發(fā)生小部分重疊，且甲醇試劑用量大，色譜圖見圖3（d）。綜合考慮，本試驗選擇賽默飛世爾Hypersil Gold C18作為分析柱。

2.1.3 流動相的試驗研究

采用賽默飛世爾Hypersil Gold C18為分析柱，本試驗研究比較了分別以甲醇-0.2%乙酸銨水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相及不同比例甲醇含量對齊墩果酸、熊果酸的分離影響。兩種流動相體系的分離效果相差較大。采用甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（83∶17）的分離效果較好，見圖3（a）。當流動相比例改為甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（85∶15）時，兩峰發(fā)生小部分重疊，分離度降為1.3，未達到基線完全分離效果，色譜圖見圖4（e）。采用甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時，分離效果較差，出峰時間較甲醇-0.2%乙酸銨水溶液體系長，改變流動相比例分別為83∶17、85∶15時，兩者分離度分別僅為1.1、1.0，兩峰重疊部分較多，且色譜峰峰寬增大，部分色譜圖見圖4（f）。為滿足分析要求，本試驗選擇甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（83∶17）為流動相分析體系。

圖 3 （a）Hypersil Gold C18、（b）Gemini C18、（c）Luna C8及（d）Gemini C18（1 mL/min）的分離色譜圖Fig.3 Separation chromatograms of Hypersil Gold C18（a），Gemini C18（b），Luna C8（c）and Gemini C18（1 mL/min）（d）

圖4 （e）甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（85∶15）及（f）甲醇-0.1%磷酸水溶液（83∶17）的分離色譜圖Fig.4 Separation chromatograms of methanol-0.2%ammonium acetate solution（e）and methanol-0.1%phosphoric acid solution（f）

2.1.4 流速對分離效果的影響

試驗研究比較了流動相流速分別為0.6、0.8、1.0 mL/min時對目標組分分離效果的影響。流速不同，齊墩果酸與熊果酸的出峰時間、分離度、峰面積等發(fā)生不同程度的改變。流速越大，組分峰出峰時間越早，齊墩果酸由22 min減至13 min出峰，熊果酸由23 min減至14 min出峰，兩峰分離度越低，從1.6降至1.4，分離效果越差。峰面積與流速成反比，如流速在0.6、0.8、1.0 mL/min時，齊墩果酸相應的峰面積為13.878、10.057、7.907 mAU，熊果酸相應的峰面積為10.206、7.420、5.705 mAU，峰面積均大幅度減少，靈敏度大幅降低。綜合考慮靈敏度、分離度、出峰時間等因素，本試驗設定流動相流速為0.6 mL/min。

2.1.5 柱溫對分離效果的影響

試驗研究比較了柱溫分別為30、35、40℃時對目標組分分離效果的影響。結(jié)果表明，柱溫越高，流動相洗脫能力增強，出峰時間縮短，但兩組分的分離度減小，如與柱溫30℃相比，柱溫在40℃時，齊墩果酸在18.253 min出峰，提前了3.59 min，兩峰分離度為1.4，兩峰有部分重疊，低于柱溫30℃時的分離度（R=1.6），影響檢測結(jié)果的準確定量。因此本試驗將柱溫設定為30℃。

2.2 樣品的前處理優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的確定

試驗考察了不同體積比的60%甲醇水、70%甲醇水、80%甲醇水、甲醇、60%乙醇水、70%乙醇、水、80%乙醇水、乙醇及乙醚的提取效果。采用稱取0.5 g樣品，分別用10 mL提取溶劑超聲提取20 min，再用提取溶劑10 mL洗滌殘渣1次，合并提取液及洗液，加提取溶劑定容至25.0 mL，其中將乙醚提取液低溫下濃縮揮干乙醚，用甲醇溶解定容至25.0 mL，各提取液過0.45 μm有機系濾頭，上機測定。結(jié)果表明，乙醇水提取溶劑的提取效果均高于同體積比的甲醇水溶劑。在甲醇水體系中，甲醇比例越高，提取效果越高，如熊果酸分別在60%甲醇水、70%甲醇水、80%甲醇水、甲醇中的提取含量為 0.30、0.83、1.08、1.07 g/kg，甲醇含量只有較高時（80%），才能將目標組分提取完全。乙醚的提取效果與乙醇水一致，但提取過程較復雜。在乙醇水體系中，60%乙醇水、70%乙醇水、80%乙醇水的提取效果基本一致，乙醇含量在60%時即可將目標組分提取完全，如熊果酸在3種提取溶劑中的提取含量均為1.08 g/kg，說明乙醇具有較好的提取效果，但直接采用乙醇提取時，提取出的雜質(zhì)成分較多，峰形較差，影響目標組分的分離分析，色譜圖見圖5（a）。同時，采用甲醇水體系、乙醇水體系、乙醚提取時均出現(xiàn)同一干擾峰與齊墩果酸分不開，影響齊墩果酸的定量分析，色譜圖見圖5（b）。本試驗研究采用醇提水沉方法進行雜質(zhì)去除，即取乙醇提取液加入一定量的水，獲得較好的雜質(zhì)去除效果，色譜圖見圖5（c）。通過對加入一定量水沉淀后的溶液進行分析，結(jié)果顯示齊墩果酸及熊果酸的提取含量的準確分析未受影響。因此，本試驗提取溶劑選擇乙醇，該溶劑試驗安全，且經(jīng)濟實惠。

圖5 （a）乙醇、（b）70%乙醇及（c）乙醇提水沉的提取分離色譜圖Fig.5 Extraction and Separation chromatograms of ethanol（a）and 70%ethanol（b）and extracted by ethanol and precipitated by water（c）

2.2.2 加入水量的影響研究

試驗考察了在乙醇提取液中加入不同體積量的水對雜質(zhì)沉淀的影響，以及對齊墩果酸及熊果酸的分析影響。分別取按1.3.3處理得到的乙醇提取液5.0、6.0、7.0、8.0 mL，依次緩慢逐滴加入水 5.0、4.0、3.0、2.0 mL，按1.3.2及1.3.3處理分析。結(jié)果表明，加入4種體積量的水均能去除齊墩果酸的干擾峰，并能不同程度沉淀色素，加入水體積越大，色素沉淀效果越明顯，溶液顏色越淺，但水的體積增大會同時造成齊墩果酸及熊果酸的沉淀析出，致使結(jié)果偏低。在加入水5.0、4.0、3.0、2.0 mL后，齊墩果酸的分析結(jié)果分別為0.206、0.262、0.261、0.267 g/kg，熊果酸的分析結(jié)果分別為0.787、1.06、1.08、1.07 g/kg，加入水 5.0 mL 雖然能明顯去除色素，但是齊墩果酸及熊果酸較大程度同時析出，導致結(jié)果明顯偏低，其它3種加入水的體積量的分析結(jié)果基本一致。為了保證目標組分的充分保留，本試驗選擇7.0 mL乙醇提取液中加入3.0 mL水作為醇提水沉的方法。

2.2.3 樣品稱樣量的確定

試驗考察了稱樣量分別為 0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 g時，按1.3.3處理對齊墩果酸及熊果酸提取的分析影響。結(jié)果表明，改變稱樣質(zhì)量，齊墩果酸及熊果酸的含量分析結(jié)果基本一致，說明采用超聲波乙醇提取具有較好的提取效果。稱樣量越大，上機時處理液色素顏色越深，雜質(zhì)成分越多，基質(zhì)越復雜。稱樣量低，樣品代表性較差。綜合考慮，本試驗選擇0.8 g作為稱樣質(zhì)量。

2.2.4 提取時間的確定

試驗考察了超聲時間分別為10、15、20 min對齊墩果酸及熊果酸提取的影響。改變超聲時間，其余按1.3.3處理進行分析。結(jié)果表明，在超聲時間分別為10、15、20 min時，齊墩果酸的分析結(jié)果分別為0.270、0.261、0.263 g/kg，熊果酸的分析結(jié)果分別為 1.06、1.05、1.07 g/kg。增加超聲時間，齊墩果酸及熊果酸的提取效果基本一致。因此，為提高分析效率及減少雜質(zhì)干擾，本試驗選擇超聲時間為10 min。

2.2.5 提取次數(shù)的確定

試驗考察了提取次數(shù)分別為1、2次對齊墩果酸及熊果酸提取的影響。提取1次試驗按照1.3.3處理分析，第2次提取操作與第1次一致，合并2次提取液，用乙醇定容至25.0 mL，其余按照1.3.3處理分析。結(jié)果表明，提取次數(shù)分別為1、2次時，齊墩果酸的結(jié)果為0.270、0.266 g/kg，熊果酸的結(jié)果為 1.06、1.08 g/kg，提取1次與提取2次的效果基本一致。因此，本試驗選擇提取次數(shù)為1次。

2.3 方法學分析

2.3.1 方法的線性關系和檢出限

將1.3.1配制的不同濃度系列進樣分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，以3倍信噪比計算方法檢出限。結(jié)果表明，齊墩果酸在2.23 μg/mL～112 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，回歸方程為：y=0.280 8x+0.278 4，相關系數(shù)（R2）為 0.999 9，檢出限為 0.04 g/kg。熊果酸濃度在 1.84 μg/mL～92.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，回歸方程為：y=0.261x-0.062 2，相關系數(shù)（R2）為 0.999 8，檢出限為0.08 g/kg。標準曲線分別見圖6和圖7，標準溶液圖譜見圖3（a），本研究相關圖譜中峰序號1為齊墩果酸，2為熊果酸。

圖6 齊墩果酸標準曲線Fig.6 The standard curve of oleanolic acid

圖7 熊果酸標準曲線Fig.7 The standard curve of ursolic acid

2.3.2 回收率和精密度

按本試驗條件分析樣品本底值，同時分別做低中高3種含量添加水平的加標試驗，按1.3.2及1.3.3處理分析，計算回收率和精密度，每個添加水平分別進行6平行試驗，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示精密度和回收率良好，方法準確性高。

表1 回收率和精密度分析結(jié)果Table 1 Determination results of precision and recovery

2.3.3 實際樣品測定

分別對4個甜茶樣品（2個產(chǎn)自來賓市金秀縣，2個產(chǎn)自桂林市平樂縣）按本方法進行檢測，產(chǎn)自平樂縣的2個甜茶樣品中的齊墩果酸和熊果酸含量均較低，齊墩果酸含量分別為0.058 4、0.056 2 g/kg，熊果酸含量分別為0.426、0.411 g/kg，產(chǎn)自金秀縣的2個甜茶樣品中的齊墩果酸和熊果酸含量高于產(chǎn)地平樂縣的樣品，齊墩果酸含量分別為0.261、0.273 g/kg，熊果酸含量分別為 1.08、1.12 g/kg。

3 結(jié)論

本文通過對色譜分離分析條件及樣品前處理優(yōu)化的詳細研究，建立同時測定甜茶中齊墩果酸及熊果酸的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)乙醇超聲波提取，采用醇提水沉方法較好的去除齊墩果酸干擾峰，前處理操作簡單。齊墩果酸及熊果酸在本試驗方法條件下能達到完全分離，線性關系、回收率、精密度均良好。該方法簡便快捷、準確度高，適用于甜茶中齊墩果酸及熊果酸含量的檢測分析，為甜茶的綜合研究與開發(fā)提供基礎。

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Establishment for the Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid from Rubus Suavissimus S.Lee

TAN Dong-ming1，SHI Xiang-li1，*，LUO Xing-ye2，NONG Yan-xian1，LIANG Wei1，HUANG Jian1
（1.Guilin Product Quality Testing Institute，Guilin 541004，Guangxi，China；2.Guilin Environmental Monitoring Center，Guilin 541002，Guangxi，China）

A method was proposed for the determination of oleanolic acid and ursolic acid from Rubus suavissimus S.Lee by high performance liquid chromatography.The optimization of chromatographic analysis condition and sample pretreatment were studied.The sample was extracted by ethanol.The impurity was removed by ethanol extraction and water precipitation.The separation was completed by using Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column with carbinol and 0.2%acetic ammonium solution （83 ∶17）as the mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min，and the detection wavelength was 210 nm.The quantification was performed by the external standard method.Under these conditions，oleanolic acid and ursolic acid were completely separated，and it showed good linearities with their concentrations ranged from 2.23 μg/mL to 112 μg/mL and from 1.84 μg/mL to 92 μg/mL with correlation coefficients（R2）more than 0.999，and the detection limits were 0.04 and 0.08 g/kg.The recoveries were in the range of 92%-102%at 3 spiked levels with RSDs（n=6）of 0.8%-3.8%.

Rubus Suavissimus S.Lee；oleanolic acid；ursolic acid；high performance liquid chromatography（HPLC）

2017-04-05

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.033

桂林市科技攻關項目（2016010307）

譚冬明（1982—），男（漢），工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量分析與研究。

*通信作者：石相莉（1969—），女，高級工程師，主要從事食品質(zhì)量分析與研究。