芍藥苷上調慢性壓迫性損傷大鼠脊髓背角和背根節(jié)內Sirt1表達

鄭暉，楊柳英，鄭文，2，張娟，郭小文，陶濤

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 杭州 310000；2.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035）

芍藥苷上調慢性壓迫性損傷大鼠脊髓背角和背根節(jié)內Sirt1表達

鄭暉1，楊柳英1，鄭文1，2，張娟1，郭小文1，陶濤1

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 杭州 310000；2.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035）

目的：觀察芍藥苷對慢性壓迫性損傷（CCI）大鼠的疼痛行為和Sirt1在脊髓背角及背根節(jié)的表達變化。方法：選擇雄性SD大鼠48只，按照設計隨機分為假手術組（Sham組）、陰性對照組（SC組）、CCI組和芍藥苷組。每組在術前和術后3、7和14 d檢測大鼠的后足熱縮足反射潛伏期（TWL）和機械縮足反射閾值（MWT）；選擇在術后3、7和14 d的相同時間處死大鼠，取大鼠L4～5節(jié)段的脊髓和背根節(jié)組織備用，用realtime PCR檢測Sirt1在組織內表達水平，采用Western blot法檢測組織內Sirt1蛋白表達變化。結果：術后3、7和14 d，與Sham組比，CCI組TWL與MWT值均顯著降低（P＜0.05），并且在術后3 d達到最小值；real-time PCR結果顯示，與Sham組相比，術后7 d和14 d，CCI組脊髓背角及背根節(jié)的Sirt1基因表達顯著降低（P＜0.05），與SC組對比，芍藥苷組脊髓背角及背根節(jié)的Sirt1基因的表達上調（P＜0.05）；Western blot結果表明芍藥苷組脊髓背角及背根節(jié)的Sirt1蛋白的表達隨時間逐步升高，但在14 d時仍低于SC組（P＜0.05）。結論：芍藥苷能夠緩解神經病理性疾病引發(fā)的疼痛，其中上調脊髓背角和背根節(jié)Sirt1的表達是其可能機制。[關鍵詞] 芍藥苷；慢性壓迫性損傷；脊髓背角；背根節(jié)；Sirt1； 大鼠

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一系列的軀體感覺系統(tǒng)的疾病或者病變引起的疼痛，具有持續(xù)性[1]。這類疼痛目前仍然是世界上最常見的導致患者生活困難甚至誘發(fā)患者殘疾的常見原因。沉默信息調節(jié)因子-2（silent information regulator 2，Sir2）相關酶1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1）是一種核蛋白，可以參與生物體內多種復雜的生命活動，上調脊髓神經元的Sirt1表達能夠有效地減輕或者緩解神經疼痛[2]。藥物可以通過靶向作用于Sirt1，引起其所在信號通路的改變，從而使慢性壓迫性損傷（chronic constrictive injury，CCI）大鼠的神經病理性疼痛得到有效緩解[3]。有研究表明芍藥苷對損傷的神經元具有保護作用[4]，并且我們通過前期的預實驗發(fā)現芍藥苷能夠影響CCI大鼠對痛覺的反應，所以本研究旨在驗證芍藥苷在參與CCI大鼠痛覺變化的同時能否引起Sirt1蛋白的表達改變，為臨床治療神經病理性疼痛提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康狀況良好的雄性SD大鼠48只，體質量220～260 g，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（浙）2010-0044。1.1.2 主要試劑：Sirt1及β-actin抗體購自美國Abcam公司，實驗中涉及的DAB顯色劑、二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，純度約99.99%的芍藥苷購自中國醫(yī)學科學院藥物所，real-time PCR相關酶及試劑購自大連Takara公司，實驗中引物由北京六合華大基因公司設計，實驗中刺激痛覺測試計和測痛計均購自美國健康醫(yī)療儀器國際公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：將48只SD大鼠隨機分成假手術組（Sham組）、CCI組、芍藥苷組和陰性對照組（SC組），每組12只。其中Sham組僅通過手術暴露坐骨神經但不進行結扎，CCI組僅通過手術對坐骨神經結扎，芍藥苷組將坐骨神經結扎后按照60 mg/kg的標準[5]腹腔注射芍藥苷，并且持續(xù)14 d，SC組在坐骨神經結扎后向大鼠腹腔注射適量的0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)至術后14 d。

1.2.2 CCI大鼠制備：參照文獻[6]建立CCI模型，5%水合氯醛按照300 mg/kg的標準腹腔注射麻醉大鼠，選擇大鼠的右側腿部皮膚切開，將皮下組織與肌肉分離，露出坐骨神經，用手術絲線間隔1 mm左右結扎4道，在結扎時注意結扎強度，保持大鼠小腿肌肉可以發(fā)生輕度顫動，然后縫合。模型制作成功標準：手術后3 d大鼠的痛閾下降30%，右側爪內收，后足能夠輕微外翻并且跛行。

1.2.3 行為學測定：術前1 d及術后3、7和14 d對大鼠的各項行為學反應進行檢測，測定時間選取每天10：00至14：00，保持恒溫25 ℃。熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）的測定：采用痛覺測試計為336爪/尾刺激大鼠并記錄TWL值。儀器參數設置：在空閑時加熱頭的激光發(fā)射強度設定為20%；如果在工作時加熱頭激光發(fā)射強度設定為60%，中間中斷時間為25 s，避免造成動物受傷；觸發(fā)溫度設定為30 ℃。分別將大鼠置于實驗臺透明玻璃板上，待大鼠穩(wěn)定之后，即可用加熱頭刺激大鼠術側足底部，此刻出現的抬腿回避時間記為1次TWL。5 min/次刺激，檢測3次TWL取其平均值。機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測定：將各組大鼠置于透明且箱底部為1 cm×1 cm鐵絲網的有機玻璃箱中，測試開始前先讓大鼠適應箱內環(huán)境15 min左右。使用已備測痛計，方向從下往上垂直地刺激大鼠手術側足底的光滑部分皮膚，并且逐漸加大測痛計刺激強度，記錄發(fā)生如舔足、甩腿等足回縮反應時的刺激強度，即為MWT，10 s/次刺激，5次后取MWT平均值。

1.2.4 Real-time PCR：新鮮組織保存在液氮中，每次實驗開始前將組織從液氮中取出，在研缽中保持液氮存在的環(huán)境下將組織研磨充分。加入10% SDS和分離緩沖液研磨混勻，然后加入蛋白酶K在37 ℃恒溫放置1～2 h，加入NaCl之后進行離心，收集上清液后采用氯仿-異戊醇法提取組織DNA。PCR反應條件為94 ℃預變性3 min，然后依次是94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸5 min。引物序列如下：18 s rRNA的正向引物：5’-ATTCCGATAACGAACGAGAG-3’；反向引物：5’-GGCATCACAGACCTGTTATTG-3’。Sirt1的正向引物：5’-GGATCCTTCATTTATCAGAGTTGCCACC-3’；反向引物：5’-CTTCGAGGTTCTTCTAAACTTGGACTCTGG-3’。

1.2.5 Western blot：取出液氮中保存的組織后在含有液氮環(huán)境下研磨充分，在研缽內添加1 mL裂解液混勻，然后室溫靜置約1 h，采用15 000×g離心1 h后，BCA法測定上清中蛋白濃度，計算樣品量之后再經過Western blot步驟：上樣，電泳，轉膜，10%濃度牛奶室溫封閉1 h左右，加入一抗后在4 ℃孵育過夜。一抗被洗去后加入二抗，室溫2 h后洗去二抗，采用ECL熒光顯色法觀察結果。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，Western blot顯色結果采用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析。其中多組間比較采用兩因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠術前及術后各時間點TWL和MTW值比較 術后觀察發(fā)現所有大鼠均未發(fā)生自殘和傷口感染現象。對各組大鼠檢測TWL和MWT發(fā)現，術前各組大鼠間TWL和MWT值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Sham組大鼠并未出現爪內收和運動障礙等變化，各時間點TWL和MWT值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CCI組大鼠TWL和MWT值在術后3 d達到最低值，與術前比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而且和Sham組的各相同時間點比，CCI組大鼠的TWL和MWT值顯著降低（P＜0.05）。CCI組與SC組各相對應的時間點TWL和MWT值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。芍藥苷組的組內對比發(fā)現，在術后3 d TWL和MWT值降至最低，但在術后7 d TWL與MWT值明顯回升（P＜0.05），術后14 d時與7 d時對比兩者未出現明顯回升，但是其與Sham組仍存在差異（P＜0.05），見表1-2。以上結果說明芍藥苷可以降低CCI大鼠的熱痛覺和機械痛覺的過敏進展。

表1 各組大鼠術前及術后各時間點TWL值比較（n=4，±s）

表1 各組大鼠術前及術后各時間點TWL值比較（n=4，±s）

與Sham組比：aP＜0.05；與CCI組比：bP＜0.05；與SC組比：cP＜0.05；與術前比：dP＜0.05；與術后3 d比：eP＜0.05

組別術前術后3 d術后7 d術后14 dFP Sham組12.3±1.411.7±1.511.8±2.012.0±1.3 0.120＞0.05 CCI組12.1±1.2 7.0±1.1ad7.2±1.5a7.3±1.6a27.439＜0.01 SC組11.9±1.6 6.9±1.4 7.1±2.1 7.3±1.5d19.507＜0.01芍藥苷組11.8±2.1 7.0±1.7a9.1±2.0abc9.0±1.8abce9.585＜0.01 F 0.28322.2707.24713.368 P ＞0.05＜0.01＜0.05＜0.01

表2 各組大鼠術前及術后各時間點MWT值比較（n=4，±s）

表2 各組大鼠術前及術后各時間點MWT值比較（n=4，±s）

與Sham組比：aP＜0.05；與CCI組比：bP＜0.05；與SC組比：cP＜0.05；與術前比：dP＜0.05；與術后3 d比：eP＜0.05

組別術前術后3 d術后7 d術后14 dFP Sham組52.3±4.451.7±4.551.8±4.052.0±4.30.023＞0.05 CCI組52.1±5.227.0±4.1ad27.2±3.5a27.3±3.6a53.182＜0.01 SC組51.9±4.626.9±5.427.1±5.127.3±4.5d31.143＜0.01芍藥苷組51.8±4.128.0±5.7a39.1±4.0abc39.0±3.8abce28.487＜0.01 F 0.01529.61947.31550.286 P ＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01

2.2 Real-time PCR檢測術后不同時間Sirt1表達術后3 d，CCI組、芍藥苷組和SC組分別與Sham組相比，大鼠脊髓背角內Sirt1基因表達顯著降低（P＜0.05）；術后7 d芍藥苷組大鼠的Sirt1基因表達較術后3 d上調，并且與CCI組和SC組對比上調顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術后14 d芍藥苷組Sirt1基因表達較術后7 d上調，且較CCI組和SC組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。術后3 d，CCI組、芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背根節(jié)處Sirt1基因較Sham組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術后7、14 d，芍藥苷組Sirt1基因表達較CCI組和SC組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且術后14 d，芍藥苷組的Sirt1高于7 d時的表達水平（P＜0.05），見表4。在脊髓背角和背根節(jié)處，14 d時芍藥苷組與SC組的Sirt1水平仍存在差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明芍藥苷可以上調脊髓背角和背根節(jié)處Sirt1基因表達以緩解大鼠痛覺過敏的發(fā)展。

表3 各組大鼠脊髓背角處術后各時間點Sirt1/18s rRNA值比較（n=4，±s）

表3 各組大鼠脊髓背角處術后各時間點Sirt1/18s rRNA值比較（n=4，±s）

與Sham組比：aP＜0.05；與CCI組比：bP＜0.05；與SC組比：cP＜0.05；與術后3 d比：dP＜0.05；與術后7 d比：eP＜0.05

組別術后3 d術后7 d術后14 dFP Sham組1.50±0.151.51±0.121.48±0.13 0.078＞0.05 CCI組0.91±0.15a0.93±0.17a0.92±0.16a0.023＞0.05 SC組0.91±0.17a0.92±0.08a0.92±0.12a0.012＞0.05芍藥苷組0.89±0.10a1.20±0.17abcd1.35±0.15abce16.134＜0.01 F 25.48523.71525.539 P ＜0.01＜0.01＜0.01

表4 各組大鼠脊髓背根節(jié)處術后各時間點Sirt1/18s rRNA值比較（n=4±s）

表4 各組大鼠脊髓背根節(jié)處術后各時間點Sirt1/18s rRNA值比較（n=4±s）

與Sham組比：aP＜0.05；與CCI組比：bP＜0.05；與SC組比：cP＜0.05；與術后3 d比：dP＜0.05；與術后7 d比：eP＜0.05

組別術后3 d術后7 d術后14 dFP Sham組1.10±0.151.11±0.121.08±0.13 0.078＞0.05 CCI組0.50±0.15a0.53±0.17a0.49±0.16a0.101＞0.05 SC組0.50±0.17a0.49±0.08a0.49±0.12a0.012＞0.05芍藥苷組0.49±0.10a0.69±0.17abcd0.91±0.15abce12.938＜0.01 F 26.03824.53927.151 P ＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 Western blot檢測Sirt1蛋白表達水平 術后3、7、14 d，各組大鼠脊髓背角及背根節(jié)處Sirt1蛋白的Western blot檢測結果顯示，芍藥苷組大鼠脊髓背角的Sirt1蛋白表達從術后3、7到14 d逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1和表5。芍藥苷組大鼠脊髓背根節(jié)Sirt1蛋白水平隨著術后時間延長也逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2和表6。但在14 d時芍藥苷組Sirt1基因在脊髓背角和背根節(jié)處的表達仍低于SC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明芍藥苷能夠通過上調Sirt1蛋白表達影響大鼠的痛覺進展，但距SC組表達水平仍存在差距。

圖1 芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背角處Sirt1蛋白表達電泳圖（n=4）

表5 術后3、7、14 d芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背角處Sirt1蛋白表達（n=4，±s）

表5 術后3、7、14 d芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背角處Sirt1蛋白表達（n=4，±s）

與SC組比：aP＜0.05；與術后3 d比：bP＜0.05；與術后7 d比：cP＜0.05

組別術后3 d術后7 d術后14 dFP SC組1.47±0.141.46±0.201.47±0.18 0.007＞0.05芍藥苷組0.35±0.06a0.79±0.13ab0.94±0.17ac34.263＜0.01 F 324.41155.6930.44 P ＜0.01＜0.01＜0.01

圖2 芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背根節(jié)處Sirt1蛋白表達電泳圖（n=4）

3 討論

在本研究中，通過對大鼠的疼痛行為學檢測發(fā)現，制作大鼠CCI模型后大鼠的TWL和MWT值較術前顯著降低，說明該模型符合后續(xù)實驗的要求。通過查閱文獻，我們發(fā)現芍藥苷濃度為60 mg/kg時其作用在CCI大鼠脊髓的效果較為明顯[5]。給大鼠腹腔注射芍藥苷后，術后7 d CCI大鼠疼痛行為學結果表明，TWL和MWT均出現了不同程度的回升。同時real-time PCR和Western blot結果表明，芍藥苷在改變疼痛行為學數據的同時，在脊髓背角和背根節(jié)處出現Sirt1基因的mRNA水平和蛋白水平上升，并且其變化趨勢與疼痛發(fā)展及痛覺過敏現象的改變相一致。說明芍藥苷能夠在一定程度上改善CCI大鼠痛覺過敏現象，并且Sirt1蛋白可能參與這一過程。

神經病理性疼痛是一種由于軀體的感覺系統(tǒng)受損或者某些疾病所致的神經疼痛，主要表現以痛覺過敏和異常性疼痛為主[7]。當前治療此類疼痛還是以藥物為主，輔以微創(chuàng)治療或者調控神經等方式。近年來隨著研究的深入，許多中藥或者其提取物的有效成分逐漸被用于神經病理性疾病的治療，使治療取得了一定的效果。如陳勇等[8]研究發(fā)現白屈菜紅堿和苦參堿都具有緩解CCI大鼠與TWL和MWT相關的過敏現象，而且還能夠抑制炎癥相關因子的分泌。CHERNG等[9]研究證實黃苓苷可以有效減輕因為脊神經結扎而產生的疼痛過敏相關癥狀。在對此類中藥成分及效果進行研究的同時，也有研究從分子層面探討這類藥物作用機制。劉雙等[10]研究發(fā)現，姜黃素能夠通過促進神經細胞的增殖發(fā)揮神經保護作用。鄭晉偉等[11]研究發(fā)現姜黃素能夠顯著緩解神經病理性疼痛，其可能的機制是通過降低脊髓背角和脊髓背根節(jié)處CX3CR1基因的表達，從而實現對神經病理性疼痛的調控。GAO等[12]研究發(fā)現，在對CCI大鼠腹腔注射大黃素后，大鼠的疼痛癥狀明顯緩解的同時還伴有脊髓背根神經節(jié)中P2X3受體的表達降低。

表6 術后3、7、14 d芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背根節(jié)處Sirt1蛋白表達（n=4，±s）

表6 術后3、7、14 d芍藥苷組和SC組大鼠脊髓背根節(jié)處Sirt1蛋白表達（n=4，±s）

與SC組比：aP＜0.05；與術后3 d比：bP＜0.05；與術后7 d比：cP＜0.05

組別術后3 d術后7 d術后14 dFP SC組1.15±0.151.14±0.171.11±0.12 0.119＞0.05芍藥苷組0.15±0.02a0.39±0.09ab0.84±0.11ac107.214＜0.01 F 262.0091.2216.50 P ＜0.01＜0.01＜0.01

芍藥苷是芍藥的主要活性成分，是一種單帖類糖苷化合物。已有研究發(fā)現芍藥苷具有多種生物學效應，例如抗腫瘤作用、抗氧自由基作用和緩解平滑肌痙攣等[13]。另有研究發(fā)現芍藥苷還具有神經保護作用，其可能的機制是通過抑制星形膠質細胞，然后增強ATP敏感的鉀通道的表達從而降低細胞膜的興奮性、增強腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達以及抑制細胞色素c的釋放、NF-κB的激活等多個環(huán)節(jié)而發(fā)揮神經保護作用[14]。Sirt1在腦神經元中有廣泛分布，在誘導基因沉默中發(fā)揮重要作用，能夠在細胞核與細胞質間往返[15]，參與神經元細胞的程序性死亡和能量代謝[16]。但是目前，芍藥苷發(fā)揮神經保護作用的具體靶點及其機制尚不明確。由于芍藥苷能夠影響B(tài)DNF的表達，Sirt1蛋白同樣也能夠調節(jié)BDNF的活性[17]，并且目前Sirt1通過與BDNF的相互作用而影響神經病理性疼痛的恢復尚未見報道。所以我們在研究芍藥苷改善CCI大鼠疼痛行為學TWL 和MWT這一現象后，又分別在CCI大鼠的脊髓背角和背根節(jié)處進一步探討了分子生物學層面Sirt1基因的改變，結果發(fā)現芍藥苷可能的作用途徑是上調Sirt1基因表達，進一步調節(jié)位于Sirt1基因下游的BDNF蛋白表達，最終實現對CCI大鼠的抗痛覺過敏與鎮(zhèn)痛效應。本研究初步揭示Sirt1基因表達與芍藥苷緩解神經病理性疼痛的相關性，也表明芍藥苷是中藥治療神經病理性疼痛的有效成分。在后續(xù)的研究中，我們將對Sirt1參與的細胞信號通路進行研究，探究芍藥苷減輕由CCI導致的神經病理性疼痛的可能信號途徑，為中藥治療神經病理性疼痛提供理論基礎。

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（本文編輯：賈建敏）

Paeoniflorin up-regulates expression of Sirt1 in spinal dorsal horn and dorsal root ganglia in chronic constriction injury rat

ZHENG Hui1, YANG Liuying1, ZHENG Wen1,2, ZHANG Juan1, GUO Xiaowen1, TAO Tao1. 1.Department of Anesthesia, the First Affi liated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310000; 2.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To observe the effect of paeonifl orin on pain behavior and the expression of Sirt1 in spinal dorsal horn and dorsal root ganglion in rats with chronic constriction injury.Methods:Forty-eight male SD rats were randomly divided into sham operation group, negative contract group (SC group), CCI group and paeonifl orin group. Heat shrinkable foot refl ex latency (TWL) and mechanical paw withdrawal refl ex threshold (MWT) were detected for rats in each group at 1 day before operation and postoperative 3, 7 and 14 days. Rats were sacrifi ced at 3, 7 and 14 days after surgery then L4-5 segment of spinal cord and dorsal root section organization was taken, and real-time PCR was used for expression of Sirt1, Western blot was used in the same time to detect the change of Sirt1 protein level.Results:At 3, 7 and 14 days after surgery, TWL and MWT of CCI group decreased signifi cantly compared with sham group (P＜0.05), and achieved the minimum value at the third day. Real-time PCR showed that the expression of Sirt1 of CCI group of spinal dorsal horn and dorsal root ganglia were signifi cantly decreased at the 7th day and 14th day after surgery compared with sham group (P＜0.05); the expression of Sirt1 of paeonifl orin group was upregulated compared with SC group (P＜0.05); the results of Western blot also showed that the level of Sirt1 protein in the dorsal horn and dorsal root ganglion were gradually increased with time, and there was difference between the Sirt1 group and the SC group at 14th day.Conclusion:Paeonifl orin can alleviate by pain neuropathic disease caused, and the up regulation of the expression of Sirt1 protein in dorsal horn and dorsal root ganglion of the spinal cord is a possible mechanism.

paeonifl orin; chronic constrictive injury; spinal cord; dorsal root ganglion; Sirt1; rats

R971

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.010

2016-08-05

浙江省中醫(yī)藥科學研究基金資助項目（2015ZB052）。

鄭暉（1977-），男，浙江諸暨人，主治醫(yī)師，碩士。