小鼠暴露式氣管注射給藥方式探索及對照組設(shè)置

王怒靜，彭傳鵬，鄭爽，周玲萍，徐紅蕾

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

小鼠暴露式氣管注射給藥方式探索及對照組設(shè)置

王怒靜1，彭傳鵬1，鄭爽1，周玲萍2，徐紅蕾2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

目的：探索能使藥物基本均勻、穩(wěn)定地分布于肺部的暴露式氣管注射給藥方法，并科學(xué)設(shè)置其對照組。方法：以美藍(lán)代替藥物，暴露成年健康小鼠（體質(zhì)量18～30 g）氣管，從干預(yù)措施、給藥體位、速度、所需的客觀藥物體積及小鼠主觀可耐受體積考慮，予暴露式氣管注射。繼而以小鼠（體質(zhì)量20～24 g）為實驗對象，以水溶性藥物脂多糖（LPS）為例，按上述方法予LPS（2 mg/mL）及0.9%氯化鈉溶液建立LPS組及NS組，于3、8、14 h時處死，正常組小鼠無干預(yù)，予同時處死，ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）水平，BALF中沉淀的細(xì)胞予瑞氏-姬姆薩染色計算中性粒細(xì)胞百分比（PMN%），肺組織行病理HE染色及細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）免疫組織化學(xué)檢測，測定肺組織濕重/干重比（W/D比）。結(jié)果：美藍(lán)基本均勻、穩(wěn)定地分布于小鼠各肺葉；與正常組比，LPS組BALF中的MCP-1水平在3、8 h時明顯增加（P＜0.05），隨時間的推移BALF中PMN%逐漸增加，肺組織炎癥改變明顯，ICAM-1表達(dá)明顯增加，W/D比明顯增加（P＜0.05）；與正常組比，NS組僅BALF中的MCP-1水平、W/D比在3 h時明顯升高（P＜0.05），余時間點各檢測指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：可采用本研究方法對小鼠暴露式氣管注射水溶性藥物。當(dāng)研究8 h內(nèi)的肺臟變化時對照組宜予等量0.9%氯化鈉溶液；≥8 h時，可以設(shè)正常組為對照組。

小鼠；氣管注射；水溶性藥物；對照組

肺部疾病的動物模型能模擬臨床疾病的演變過程，經(jīng)氣管給藥時藥物與肺臟直接接觸，由此構(gòu)建的某些肺部疾病效果可以優(yōu)于靜脈或腹腔注射等其他間接的給藥方式[1-2]。經(jīng)氣管給藥又分為非暴露式給藥（霧化給藥、經(jīng)咽喉氣管插管滴入、鼻內(nèi)滴入等）以及暴露式給藥（暴露式氣管注射給藥等）。由于鼻內(nèi)滴入時鼻腔黏附、不自主吞咽等因素的明顯干擾，實際給藥劑量難以控制，因此不優(yōu)先選擇。在霧化給藥、經(jīng)咽喉氣管插管滴入、暴露式氣管注射這3種氣管給藥途徑中，霧化給藥效果最好[3]，其次是暴露式氣管注射給藥[4]。由于霧化裝置未全面普及，簡單、快捷、可視的暴露式氣管注射給藥成為了更多研究者的選擇。然而，有2大缺陷制約著暴露式氣管注射給藥的流行：①給藥體位、咳嗽反射等因素會影響藥物在肺部的分布，從而導(dǎo)致肺部疾病模型的不穩(wěn)定性；②不同的藥物溶劑對肺臟的損傷性大小不一，當(dāng)氣管注射水溶性藥物時，即使對照組予能被肺臟快速轉(zhuǎn)運吸收的0.9%氯化鈉溶液[5]，過多的0.9%氯化鈉溶液仍可能對肺部造成損害，因而多時間點動態(tài)研究時，不同于經(jīng)靜脈注射0.9%氯化鈉溶液，此時嚴(yán)格的對照組應(yīng)該是經(jīng)氣管注射0.9%氯化鈉溶液后對應(yīng)的相同幾個時間點。

針對上述問題的存在，本研究試圖摸索出一種暴露式氣管注射給藥方法使藥物基本均勻、穩(wěn)定地分布于肺部，繼而以水溶性藥物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為例，按上述方法分別予LPS及0.9%氯化鈉溶液建立LPS組及NS組，通過多時間點動態(tài)檢測相應(yīng)指標(biāo)檢驗該方法造模的有效性，同時科學(xué)設(shè)置經(jīng)暴露式氣管注射水溶性藥物的小鼠模型對照組，以達(dá)到節(jié)約實驗動物資源、科研試劑及人力資源的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康成年Balb/c小鼠30只（清潔級，體質(zhì)量18～30 g），健康雄性Balb/c小鼠42只（SPF級，體質(zhì)量20～24 g），均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心層流架。動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.1.2 主要試劑：LPS（L2880，美國Sigma公司）；小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）ELISA試劑盒（DKW12-2739，上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；快速瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液（D010，南京建成生物工程研究所）；兔抗小鼠細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）抗體（PB0054，武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 暴露式氣管給藥：以30只健康成年Balb/c小鼠為實驗對象，以美藍(lán)為可視性藥物，參考小鼠暴露式氣管給藥的相關(guān)文獻(xiàn)[6]，綜合考慮干預(yù)措施、給藥體位、速度、所需的客觀藥物體積與小鼠主觀可耐受體積這些可能影響肺組織藥物分布的因素，具體造模方法如下：小鼠適度麻醉后仰臥頭上位固定于45°斜面，絲線經(jīng)門牙固定頸部使其過伸位，暴露氣管，藥物總體積（μL）=5×體質(zhì)量（g）；藥物均分4份，用藥物潤洗過的1 mL注射器每次預(yù)先吸入300 μL空氣后吸取一份藥物，經(jīng)環(huán)甲膜刺入氣管0.5～1 cm后緩慢注射藥物，緊接著快速注入預(yù)先吸入的空氣，以及重復(fù)吸取800 μL空氣快速注入，間隔1 min后繼續(xù)第2份藥物注射，直至4份藥物注射完成后體位保持20 min。過量麻醉處死，觀察藥物在肺臟的分布情況。

1.2.2 分組：42只健康雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常組（6只）、LPS組（18只）和NS組（18只）。正常組不接受任何損傷性處理，隨機(jī)時間處死；LPS組（LPS，2 mg/mL）和NS組（0.9%氯化鈉溶液），采用上述給藥方式，分別于給藥后3、8、14 h過量麻醉處死，每次處死6只。

1.2.3 標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測：開胸腔，取4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液400 μL分2次灌洗左肺，每次反復(fù)回吸6次后，回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）（回收率大于80%），4 ℃保存，2 h內(nèi)離心（4 ℃，1 500 r/min，10 min）后取上清液-80 ℃保存，ELISA法測MCP-1水平，BALF中沉淀的細(xì)胞于30 μL 0.9%氯化鈉溶液中重懸，盡快行瑞氏-姬姆薩染色，計算中性粒細(xì)胞百分比（polymorphonuclear neutrophil percentage，PMN%）；右肺上葉予病理HE染色，免疫組織化學(xué)法檢測ICAM-1表達(dá)情況；余肺0.9%氯化鈉溶液漂洗后放入鋁紙內(nèi)，稱得凈肺濕重（W），放60 ℃烘箱72 h后稱得凈肺干重（D），計算W/D比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥結(jié)果 小鼠20 min內(nèi)存活率為100%，藥物基本均勻、穩(wěn)定地分布于肺臟，見圖1。

圖1 藥物在各肺葉的分布情況

2.2 BALF中MCP-1水平變化 與正常組比，NS組BALF中的MCP-1水平僅3 h時一過性明顯升高（P＜0.05），8 h及14 h時與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比，LPS組BALF中的MCP-1水平在3 h時明顯升高達(dá)到峰值（P＞0.05），與NS組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），8 h時則明顯高于NS組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠BALF中的MCP-1水平（n=6，±s，pg/mL）

表1 各組小鼠BALF中的MCP-1水平（n=6，±s，pg/mL）

與正常組比：aP＜0.05；與NS組相同時間點比：bP＜0.05

組別MCP-1正常組512±112 NS組3 h959±147a8 h519± 56 14 h525± 72 LPS組3 h1 243± 72a8 h980±185ab14 h507± 91

2.3 BALF中PMN%變化 正常組與NS組BALF中的PMN%均穩(wěn)定于低值水平（PMN%＜5%），而且兩者間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NS組比，LPS組8、14 h時BALF中的PMN%分別為（54%±7%）和（71%± 13%），均明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

2.4 肺組織形態(tài)學(xué)變化 正常組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡壁薄，毛細(xì)血管無明顯充血，未見紅細(xì)胞滲出，未見明顯炎細(xì)胞浸潤。與正常組比，NS組僅可見極輕度的肺泡壁血管充血；LPS組3 h時肺泡壁即輕度增厚，肺泡明顯充血，可見間質(zhì)炎細(xì)胞及紅細(xì)胞輕度滲出，8、14 h時肺泡壁明顯增厚，大量炎細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出于間質(zhì)和肺泡腔。見圖3。

圖2 各組小鼠BALF中沉淀細(xì)胞的瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果（×200）

圖3 各組小鼠的病理組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×100）

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測肺組織ICAM-1表達(dá) 正常組與NS組的氣管上皮細(xì)胞膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞膜膜呈現(xiàn)輕微特染的棕色，而LPS組隨造模時間的延長上述部位特染的棕色明顯加深。見圖4。2.6 肺水腫情況 與正常組比，NS組W/D比僅3 h時升高（P＜0.05），8 h及14 h的W/D比與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與NS組比，LPS組3、8、14 h各時間點W/D比均升高（P＜0.05），14 h時的W/D比達(dá)到峰值（P＜0.05）。見表2。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測各組小鼠肺組織的ICAM-1表達(dá)（×400）

表2 各組肺W/D比（n=6，±s）

表2 各組肺W/D比（n=6，±s）

與正常組比：aP＜0.05；與NS組相同時間點比：bP＜0.05

組別肺W/D比正常組4.59±0.11 NS組3 h4.75±0.12a8 h4.62±0.08 14 h4.61±0.12 LPS組3 h4.87±0.07ab8 h4.83±0.06ab14 h5.15±0.05ab

3 討論

近年來，暴露式氣管注射給藥的相關(guān)模型研究并不多見，但經(jīng)氣管插管滴注藥物的研究有所進(jìn)展。劉梅等[7]報道的小鼠改良式頸透視下氣管內(nèi)插管的給藥方法中，由于小鼠頸部光源的照射，經(jīng)口氣管插管時可見光亮開合的聲門，因此大大提高了插管的成功率；姜寶珍等[8]進(jìn)一步通過暴露頸部氣管及調(diào)節(jié)氣管內(nèi)導(dǎo)管的具體位置，實現(xiàn)了單側(cè)左肺的精確藥物滴注。然而，氣管插管給藥的成功不可避免都要經(jīng)過較長的氣管插管學(xué)習(xí)摸索階段。

與氣管插管和霧化給藥相比，暴露式氣管注射雖然有操作過程簡便省時、造模設(shè)備簡單易得的明顯優(yōu)勢，但很多因素都能影響藥物在肺臟分布的范圍及穩(wěn)定性。由于適度麻醉的小鼠既能耐受暴露氣管的手術(shù)過程，經(jīng)氣管注射藥物后又能促發(fā)明顯的深快呼吸，而潤洗注射器、采用移液槍移液或者進(jìn)樣針移液及注射均能提高給藥體積的精確度。因此，本研究在適度麻醉、精確給藥的前提下，通過嚴(yán)格控制干預(yù)措施、給藥體位、給藥速度、給藥總體積及分次給藥體積，使得小鼠生存率100%的同時，美藍(lán)基本均勻穩(wěn)定地分布在小鼠各肺葉，而LPS作用后的肺組織病理HE染色切片亦表明肺組織炎癥改變?nèi)娑鶆?。因此，本研究的暴露式氣管注射方法保障了相關(guān)肺臟疾病模型的穩(wěn)定性及成功率。但其不足之處有以下兩點：①暴露式氣管開放增加了感染的可能性，尤其是在反復(fù)多次氣管給藥的慢性肺部模型中；②滴注的藥物在肺內(nèi)的分布范圍有其局限性，因此取材時應(yīng)優(yōu)先選擇藥物預(yù)期浸潤最穩(wěn)定的相同部位。

為了進(jìn)一步科學(xué)設(shè)置對照組，本研究按照上述暴露式氣管注射方法分別予以2 mg/mL的LPS及0.9%氯化鈉溶液構(gòu)建3、8、14 h的LPS組及NS組。MCP-1是炎癥因子，能定向趨化單核細(xì)胞[9]、中性粒細(xì)胞[10]等多種炎細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位；W/D比反映肺部水腫情況；ICAM-1既能介導(dǎo)肺內(nèi)血管中活化的PMN牢固貼壁進(jìn)而穿過血管內(nèi)皮進(jìn)入肺部[11]，又能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞[12]黏附于上皮細(xì)胞。與正常組相比，NS組肺組織病理炎癥改變、ICAM-1表達(dá)水平以及BALF中的PMN%在各個時間點均無明顯差別，而BALF中的MCP-1水平、W/D比在3 h時一過性明顯增加。由于MCP-1主要由巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)[13]，因此本研究NS組BALF中早期明顯增加的MCP-1可能是由于肺巨噬細(xì)胞受0.9%氯化鈉溶液刺激而大量分泌所致，而NS組BALF中的MCP-1在8 h時已恢復(fù)至正常組水平，肺內(nèi)的NS基本上已吸收轉(zhuǎn)運完全，表明小鼠經(jīng)本研究方法氣管注射0.9%氯化鈉溶液后無明顯的肺臟炎癥性損傷，但在短時間內(nèi)（如3 h時）導(dǎo)致了BALF中一過性急劇增加的MCP-1水平以及可逆性肺水腫。

綜上所述，可采用本研究方法對小鼠暴露式氣管注射水溶性藥物，當(dāng)研究8 h內(nèi)的肺臟變化時對照組宜予等量0.9%氯化鈉溶液；≥8 h時，可以設(shè)正常組為對照組。

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（本文編輯：趙翠翠）

Instilling water-soluble drugs through the exposed trachea in mice and designing the control group

WANG Nujing1, PENG Chuanpeng1, ZHENG Shuang1, ZHOU Lingping2, XU Honglei2. 1.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Respiratory Medicine, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To make water-soluble drugs instilled through the exposed trachea a stable and roughly equal distribution in the lungs of mice and to design the control group scientifi cally.Methods:Intervention measure, mouse position, instillment speed, minimum volume that requires and maximum volume that tolerates were all taken into consideration to make the distribution of the drug (Methlene Blue instead) in lung lobes in mice (weighting from 18 g to 30 g) stable and roughly equal. Then taking lipopolysaccharide (LPS) as example, the LPS group and normal saline (NS) group were treated with LPS (2 mg/mL) and normal saline (NS) respectively in the way above mentioned in mice weighting from 20 g to 24 g. The normal group was with no pretreatment. After modeling for 3 h, 8 h, 14 h, the level of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in bronchoalveolar lavage fl uid (BALF) detected by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA), the polymorphonuclear neutrophil percentage (PMN%) in BALF tested with Wright-Giemsa stain, histopathological changes assayed by HE staining, the expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) assayed by immunohistochemical staining and the lung wet weight/dry weight ratio (W/D ratio) in lung tissue would be tested.Results:Using the process developed above, the distribution of Methlene Blue in lung lobes was stable and roughly equal. Compared with the normal group, the level of MCP-1 in BALF in the LPS group increased at 3 h, 8 h, and as time went by, the PMN% in BALF increased and histopathological changes appeared obvious, and both the expression level of ICAM-1 and the W/D ratio increased (P＜0.05) in LPS group. Compared with the normal group, only the level of MCP-1 in BALF and the W/D ratio increased signifi cantly (P＜0.05) in the NS group at 3 h, and all measurements had no difference at 8 h and 14 h.Conclusion:The process developed here to instill water-soluble drugs through exposed trachea is successful. The control group should be treated with NS for the same time if researching the lung changes within 8 h, or just the normal mice instead if at least 8 hours.

mice; intratracheal instillation; water-soluble drug; control group

R332

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.003

2016-10-02

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20140680）；浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項目（2015RCB018）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY12H01001）。

王怒靜（1991-），女，浙江臺州人，碩士生。

徐紅蕾，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：xfhl2000@163.com。