血管緊張素Ⅱ1型受體多態(tài)性與替米沙坦降壓療效關(guān)系的研究

龔洪濤，杜鳳和，陳步星

·論著·

血管緊張素Ⅱ1型受體多態(tài)性與替米沙坦降壓療效關(guān)系的研究

龔洪濤，杜鳳和，陳步星*

目的 探討血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)多態(tài)性與替米沙坦降壓療效之間的關(guān)系。方法 選取2005年6月—2007年1月北京天壇醫(yī)院門診輕中度高血壓患者148例，其均服用替米沙坦單藥治療8周，1～2次/周測(cè)量血壓。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)患者AT1R基因1166A/C、-810A/T和-521C/T多態(tài)性進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血鈉、血鉀、血氯、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等生物化學(xué)指標(biāo)。結(jié)果 患者治療前后體質(zhì)指數(shù)(BMI)、心率(HR)、ALT、AST、Cr、BUN、UA、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、血鈉、血鉀、血氯水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；患者治療前后AngⅡ水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AT1R基因1166A/C AA基因型和AC基因型、-810A/T AA基因型和AT基因型以及TT基因型治療前收縮壓、治療后收縮壓、收縮壓降幅、治療前舒張壓、治療后舒張壓、舒張壓降幅比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AT1R基因-521C/T CC基因型、CT+TT基因型治療前收縮壓、治療后收縮壓、收縮壓降幅、治療前舒張壓、治療后舒張壓比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；舒張壓降幅比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多元線性回歸分析結(jié)果顯示，UA、-521C/T、治療前AngⅡ、治療前舒張壓是影響舒張壓降幅的因素(P<0.05)。結(jié)論 AT1R基因-521C/T多態(tài)性能獨(dú)立預(yù)測(cè)患者對(duì)替米沙坦反應(yīng)的個(gè)體差異。

高血壓；受體，血管緊張素，1型；多態(tài)性，單核苷酸；血管緊張素Ⅱ 1型受體拮抗劑

龔洪濤，杜鳳和，陳步星.血管緊張素Ⅱ1型受體多態(tài)性與替米沙坦降壓療效關(guān)系的研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20(20)：2455-2458.[www.chinagp.net]

GONG H T，DU F H，CHEN B X.Relationship between polymorphisms of angiotensin Ⅱ type 1 receptor and antihypertensive responses of telmisartan[J].Chinese General Practice，2017，20(20)：2455-2458.

高血壓是一種多基因疾病，發(fā)病率逐年增高，降壓藥物治療是臨床控制高血壓最主要的途徑。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種降壓藥物，而患者對(duì)于該類藥物的療效存在個(gè)體差異，近年來有關(guān)降壓藥的療效與突變位點(diǎn)的相關(guān)性成為研究熱點(diǎn)[1]。本研究對(duì)高血壓患者采用ARB(替米沙坦)單藥治療，在觀察降壓療效的同時(shí)對(duì)血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)基因1166A/C、-810A/T和-521C/T多態(tài)性進(jìn)行分析，探討AT1R基因多態(tài)性與替米沙坦降壓療效的關(guān)系，為臨床降壓藥物的選擇提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2005年6月—2007年1月北京天壇醫(yī)院門診高血壓患者148例，其中男67例，女81例；年齡35～77歲，平均年齡(53.7±10.6)歲；漢族。患者均符合2003年WHO/國(guó)際高血壓協(xié)會(huì)(ISH)高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，診斷為原發(fā)性高血壓?、瘛蚣?jí)，坐位舒張壓95～109 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，收縮壓140～180 mm Hg，均未用或停用降壓藥物，并服用安慰劑2周。排除繼發(fā)性高血壓，嚴(yán)重心功能不全，嚴(yán)重肝腎功能障礙，3個(gè)月內(nèi)有心肌梗死及腦卒中，妊娠或哺乳期婦女。

1.2 給藥方法及人體基本參數(shù)測(cè)定 患者均給予替米沙坦(德國(guó)勃林格殷格翰公司生產(chǎn)，藥品批號(hào)：B040050B)80 mg/d，7：00～10：00頓服，共治療8周，1～2次/周測(cè)量血壓，均在上午由同一測(cè)量者測(cè)量；血壓測(cè)量時(shí)靜坐10 min，標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式血壓計(jì)坐位連續(xù)測(cè)量3次，間隔10 min/次，取均值。同時(shí)測(cè)定身高、體質(zhì)量、心率(HR)等，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。

1.3 生物化學(xué)指標(biāo)測(cè)定 抽取患者空腹靜脈血4 ml，以3 000 r/min離心10 min，離心半徑7 cm，取血清，采用生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血鈉、血鉀、血氯等指標(biāo)。采用放射免疫法檢測(cè)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平。

1.4 DNA提取 取冷凍乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，水浴解凍，E.Z.N.ATM Blood DNA Kit(OMEGA)試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)法進(jìn)行基因分型 采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增條件：總反應(yīng)體系為10.0 μl，包括20 ng基因組DNA 2.0 μl，PCR引物(5 pmol/μl)各0.6 μl，2×Taq PCR Master Mix 5.0 μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)充至10.0 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：首先95 ℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94 ℃變性30 s，相應(yīng)的退火溫度退火30 s，72 ℃延伸40 s。最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像儀成像。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，5 U Dde Ⅰ，Alu Ⅰ和Ssp Ⅰ內(nèi)切酶(美國(guó)promega公司生產(chǎn))，10×緩沖液2 μl，加雙蒸水補(bǔ)充體積至20 μl，37 ℃溫育12 h后，取10 μl上述產(chǎn)物，用含EB的2%瓊脂糖凝膠在電壓100 V、1×TAE緩沖液中電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并保存酶切結(jié)果。

表1 基因多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和條件

注：AT1R=血管緊張素Ⅱ1型受體，PCR=聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

2 結(jié)果

2.1 治療前后臨床生化指標(biāo)比較 患者治療前后BMI、HR、ALT、AST、Cr、BUN、UA、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、血鈉、血鉀、血氯水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；患者治療前后AngⅡ水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.2AT1R基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布AT1R基因3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)1166A/C、-810A/T和-521C/T基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.95、0.27、0.55，P>0.05，見表3)。-521C/TTT基因型頻率較低，因此將CT和TT基因型合并，行進(jìn)一步分析。

2.3AT1R基因多態(tài)性不同基因型血壓比較AT1R基因1166A/CAA基因型和AC基因型治療前收縮壓、治療后收縮壓、收縮壓降幅、治療前舒張壓、治療后舒張壓、舒張壓降幅比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AT1R基因-810A/TAA基因型、AT基因型、TT基因型治療前收縮壓、治療后收縮壓、收縮壓降幅、治療前舒張壓、治療后舒張壓、舒張壓降幅比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AT1R基因-521C/TCC基因型、CT+TT基因型治療前收縮壓、治療后收縮壓、收縮壓降幅、治療前舒張壓、治療后舒張壓比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；舒張壓降幅比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

2.4 多元線性回歸分析 以舒張壓降幅為因變量，以性別(賦值：男=1，女=2)、年齡、BMI、Cr、UA、TG、FPG、LDL-C、HDL-C、-521C/T(賦值：CC=1，CT+TT=2)、治療前AngⅡ、治療前收縮壓、治療前舒張壓、治療前HR為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，UA、-521C/T、治療前AngⅡ、治療前舒張壓是影響舒張壓降幅的因素(P<0.05，見表5)。

表3AT1R基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布〔n(%)〕

Table3Genotypeandallelefrequenciesofthe1166A/C，-810A/Tand-521C/TpolymorphismsoftheAT1Rgene

Table4ComparisonofbloodpressureindifferentgenotypesofAT1Rgenepolymorphism

基因型例數(shù)收縮壓舒張壓治療前治療后降幅治療前治療后降幅1166A/C AA126160±17147±20a18±14101±893±10a 9±6 AC22157±16136±18a23±19103±492±8a12±3 t值0.5831.728-1.107-0.6530.612-0.927 P值0.5610.0870.2710.5150.5420.356-810A/T AA81162±20146±22a17±14102±894±12a 9±5 AT50165±17153±12a17±10100±396±6a 9±3 TT17157±16143±20a20±15102±793±10a10±6 F值1.3121.2720.4080.1690.4880.380 P值0.2740.2850.6660.8450.6150.685-521C/T CC91158±18144±19a19±14102±793±10a11±5 CT+TT57162±15147±21a18±17100±795±11a 7±3 t值-1.047-0.8120.2431.160-1.0392.278 P值0.2980.4190.8090.2490.3010.025

注：與治療前比較，aP<0.05

表2 患者治療前后臨床和生化指標(biāo)比較±s，n=148)

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，HR=心率，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，Cr=肌酐，BUN=尿素氮，UA=尿酸，F(xiàn)PG=空腹血糖，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，AngⅡ=血管緊張素Ⅱ

表5 舒張壓降幅影響因素的多元線性回歸分析

Table 5 Multiple linear regression analysis on influencing factors for DBP reducing ranges

變量ββ'SEt值P值UA-0.038-0.0690.018-2.1110.038-521C/T-1.566-0.1880.779-2.0100.047治療前AngⅡ0.0350.2430.0162.1300.036治療前舒張壓0.4240.3720.1442.9360.004

注：常數(shù)=-33.180，R2=0.249，調(diào)整R2=0.121，F(xiàn)=1.946，P<0.05

3 討論

人類AngⅡ受體有AT1R和2型受體(AT2R)兩種亞型，目前認(rèn)為AngⅡ所起的作用主要通過AT1R完成。人類AT1R基因位于3號(hào)染色體q21～25，含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。1994年BONNARDEAUX等[3]發(fā)現(xiàn)該基因有5種多態(tài)性，即537C/T、1062A/G、1166A/C、1517G/T和1878A/G，其中與臨床關(guān)系最密切的是1166A/C。此后，ERDMANN等[4]在AT1R基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，認(rèn)為可能影響AT1R基因的表達(dá)。

本研究選擇AT1R基因1166A/C、-810A/T和-521C/T 3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，替米沙坦治療8周后，在-521C/T位點(diǎn)，治療前后CC基因型和CT+TT基因型舒張壓降幅比較有差異；應(yīng)用多元線性回歸分析，排除影響患者服用ARB后降壓療效的因素后，-521C/T仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示在-521C/T位點(diǎn)上，CC基因型對(duì)替米沙坦降壓療效可能起著積極的作用。-521C/T位點(diǎn)位于AT1R基因的啟動(dòng)子區(qū)域5′調(diào)控序列，基因調(diào)控序列的多態(tài)性位點(diǎn)可影響基因mRNA表達(dá)及相應(yīng)蛋白質(zhì)生成量，推測(cè)該位點(diǎn)可能通過影響AT1R基因的表達(dá)，從而影響系統(tǒng)中該基因產(chǎn)物的功能。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該位點(diǎn)的研究極少，其與RAS其他成分如ACE、AngⅡ等關(guān)系尚不明確，因此進(jìn)一步深入研究有助于該位點(diǎn)功能的闡明。

本研究未發(fā)現(xiàn)1166A/C、-810A/T與服用ARB后的降壓療效有關(guān)，1166A/C位于AT1R基因的非編碼區(qū)，對(duì)AT1R基因轉(zhuǎn)錄和翻譯不會(huì)產(chǎn)生直接影響，KURLAND等[5]研究未發(fā)現(xiàn)1166A/C多態(tài)性與伊貝沙坦降壓療效間存在相關(guān)性。其原因可能為：首先，AA和AC基因型的血清AT1R表達(dá)一致，替米沙坦作用于AT1R而發(fā)揮降壓療效，因此兩組降壓療效無明顯差別。其次，1166A/C多態(tài)性與血管壁對(duì)AngⅡ反應(yīng)之間不存在相關(guān)性，HILGERS等[6]予以不同濃度的外源AngⅡ輸注(0.5～3.0 ng/kg)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)不同基因型之間血壓、醛固酮和腎血流動(dòng)力學(xué)的差別。SPIERING等[7]研究證實(shí)此觀點(diǎn)，表明1166A/C多態(tài)性不直接參與AngⅡ的調(diào)節(jié)。-810A/T位于AT1R基因啟動(dòng)子區(qū)-810處，筆者前期研究表明-810T等位基因在高血壓患者中的發(fā)生率明顯高于正常人，-810A/T多態(tài)性與高血壓相關(guān)[8]，推測(cè)-810A/T可能通過影響AT1R的表達(dá)，增強(qiáng)AngⅡ的作用，從而對(duì)血壓產(chǎn)生一定的影響。但未發(fā)現(xiàn)其與ARB降壓療效有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：龔洪濤進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋、撰寫論文、進(jìn)行論文修訂；龔洪濤、杜鳳和、陳步星進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校、對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Relationship between Polymorphisms of Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor and Antihypertensive Responses of Telmisartan

GONGHong-tao，DUFeng-he，CHENBu-xing*

DepartmentofCardiology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China

*Correspondingauthor:CHENBu-xing，Chiefphysician;E-mail：chbux@126.com

Objective This study aims to investigate the relationship between the polymorphism of angiotensin Ⅱ type 1 receptor(AT1R) and the antihypertensive efficacy of telmisartan.Methods From June 2005 to January 2007，one hundred and forty-eight patients with mild-to-moderate primary hypertension were selected.All the patients accepted monotherapy of telmisartan for 8 weeks，blood pressure was measured 1-2 times/week.The AT1R genes 1166A/C，-810A/T and -521C/T polymorphism of the patients were analyzed by polymerase chain reaction (PCR).Some biochemical indexes such as alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)，creatinine(Cr)，blood urea nitrogen(BUN)，uric acid(UA)，fasting plasma glucose (FPG)，total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)，low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)，high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)，blood sodium，blood potassium，blood chloride，angiotensin Ⅱ(AngⅡ) were also measured at the same time.Results The body mass index(BMI)，heart rate(HR)，ALT，AST，Cr，BUN，UA，F(xiàn)PG，TC，TG，LDL-C，HDL-C，blood sodium，blood potassium and blood chlorine levels were compared before and after treatment，the differences were all not statistically significant(P>0.05).The AngⅡ level of the patients before and after treatment were compared，the difference was statistically significant(P<0.05).The systolic blood pressure before and after treatment，systolic blood pressure drop，diastolic blood pressure before and after treatment，diastolic blood pressure drop between AT1R gene 1166 A/C AA genotype and AC genotype，-810A/T AA genotype and AT genotype and TT genotype were compared，there were no significant differences(P>0.05).The systolic blood pressure before and after treatment，systolic blood pressure drop，diastolic blood pressure before and after treatment between AT1R gene -521C/T CC genotype and CT+TT genotype were compared，there were no significant differences(P>0.05).The diastolic blood pressure drop was compared，there was a statistically significant difference(P<0.05).Multiple linear regression analysis showed that UA，-521C/T，AngⅡ before treatment and diastolic blood pressure before treatment were the influencing factors of diastolic blood pressure drop(P<0.05).Conclusion The -521C/T polymorphism of AT1R gene can independently predict the individual difference in patients′ response to telmisartan.

Hypertension;Receptor，angiotensin，type 1;Polymorphism，single nucleotide;Angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.20.006

2016-11-06；

2017-04-13)

100050北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科

*通信作者：陳步星，主任醫(yī)師；E-mail：chbux@126.com