冠脈通片補腎活血法對大鼠腎陽虛心梗模型的拆方研究?

苗淑杰，王 蕾，呂 楠，杜雪梅，郝 迪，李 旭，劉洪斌△

(1.天津同仁堂集團有限公司，天津 300000;2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

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【實驗研究】

冠脈通片補腎活血法對大鼠腎陽虛心梗模型的拆方研究?

苗淑杰1，王 蕾2，呂 楠2，杜雪梅1，郝 迪2，李 旭2，劉洪斌2△

(1.天津同仁堂集團有限公司，天津 300000;2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

目的：觀察冠脈通片對腎陽虛心梗大鼠心肌梗死改善作用。方法：腺嘌呤灌胃+左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備腎陽虛心梗大鼠模型，結(jié)扎前2 d給予冠脈通片全方2.6 g生藥/kg，補腎拆方、活血開竅拆方灌胃給藥連續(xù)5 d，以血清肌鈣蛋白T(cTn-T)、心電圖ST段、小動物超聲心動圖射血分數(shù)(EF%)、梗死心肌NBT染色評價藥效作用，以血清肌酐(Cr)、總?cè)饧谞钕僭彼?T3)、總甲狀腺激素(T4)作為評價腎陽虛改善指標。結(jié)果：冠脈通片全方組對ST段、EF%、梗死面積均有顯著作用，可有效降低血清Cr、升高T3、T4水平，補腎與活血拆方藥效作用均不及冠脈通全方組。結(jié)論：冠脈通片全方補腎、活血功效兼?zhèn)?，為冠脈通片治療心梗的證候特點提供藥理學(xué)數(shù)據(jù)參考。

補腎活血；冠脈通片；腎陽虛心梗；肌鈣蛋白T；小動物超聲心動圖

冠脈通片是天津市同仁堂集團股份有限公司在冠心II號方的基礎(chǔ)上，將枸杞子、何首烏、淫羊藿、紅花、石菖蒲、丹參、桑寄生、冰片制成冠脈通片，其中枸杞子、桑寄生、何首烏能補益肝腎，淫羊藿能滋陰補陽、壯陽強身，石菖蒲與冰片能化痰開竅化濕，紅花與丹參活血化瘀、行氣止痛。該藥用于肝腎不足、痰瘀阻絡(luò)之胸痹。有報道對冠脈通片心肌缺血再灌注損傷[1]、大鼠血栓形成[2]、腦缺血再灌注模型[3]的保護作用及機制已有研究。本文以冠脈通片補腎活血功效為切入點，針對其在方藥組成和功用上兼具補腎和活血作用，以大鼠腎陽虛心梗證候模型為基礎(chǔ)，采用拆方法對冠脈通片補腎活血功效予以研究。

1 材料

1.1 試驗藥物

冠脈通片由天津市同仁堂集團股份有限公司提供，受試樣品為壓片之前的小顆粒(批號為cj06017)，規(guī)格為棕褐色小顆粒，生藥量為2.9265 g生藥/g，0.3 g顆粒/片。補腎拆方由同仁堂提供，規(guī)格為棕褐色小顆粒，生藥量與冠脈通片全方中補腎成分含量相當(dāng)；活血開竅拆方由同仁堂提供，規(guī)格為棕褐色小顆粒，生藥量與冠脈通片全方中活血開竅成分含量相當(dāng)。

1.2 動物

SD大鼠購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部(許可證號SYXK(津)2011-0003)。65只雄性SD大鼠，8～9周齡成年鼠，體質(zhì)量(250±10) g。

1.3 試劑

腺嘌呤C5H5N5購自上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，純度≥98.0%(批號131101)。使用前用1.0%羧甲基纖維素鈉(CMC)配制成2%腺嘌呤混懸液。

1.4 儀器

小動物人工呼吸機(Rodent ventilator DH-150，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)、心電圖機(Nihon Kohden Corporation Cardiofax)、小動物超聲成像系統(tǒng)(VisualSonics Vevo 2100)。

2 方法

2.1 造模方法

采用“腺嘌呤+左冠狀動脈前降支結(jié)扎法”制備腎陽虛心梗模型，即灌胃腺嘌呤200 mg/kg/d，每日1次，連續(xù)3周，造成大鼠腎陽虛，然后行冠狀動脈前降支結(jié)扎法(AMI)制備大鼠急性心肌梗死模型。將大鼠經(jīng)4.5%戊巴比妥鈉溶液按1 ml/kg腹腔注射麻醉后，背位固定于手術(shù)臺上，無菌操作下沿大鼠左腋下與胸骨劍突連線處用刀片切開皮膚，逐層鈍性分離肌肉，將面罩罩住大鼠口鼻連接人工呼吸機(參數(shù)設(shè)定為呼吸比1∶3，潮氣量32，呼吸頻率60)，沿4、5肋間開胸分離心包膜，擠出心臟至可見動脈圓錐，永久性結(jié)扎左冠狀動脈前降支，心臟復(fù)位后立即制造胸腔負壓狀態(tài)，縫合肌肉皮膚，從而實現(xiàn)腎陽虛心梗的證候模型。假手術(shù)對照組采用“灌胃純凈水+AMI僅穿線不結(jié)扎法”。

2.2 分組方法

除假手術(shù)對照組外，將腎陽虛大鼠按照血清肌酐(Cr)水平隨機分為腎陽虛心梗模型對照組、冠脈通片全方組(2.6 g生藥/kg，相當(dāng)于臨床人用劑量12倍)、補腎拆方組(生藥含量相當(dāng)于全方補腎成分，為臨床人用劑量12倍)、活血開竅拆方組(生藥含量相當(dāng)于全方活血成分，為臨床人用劑量12倍)。

2.3 給藥方法

采用預(yù)防性給藥，于AMI術(shù)前2 d灌胃相應(yīng)受試藥物，術(shù)前30 min給藥1次，術(shù)后給藥5 d，每日1次。

2.4 指標測定方法

2.4.1 對死亡率的影響 以24 h圍手術(shù)期內(nèi)死亡例數(shù)作為死亡率。

2.4.2 對心梗指標的影響 術(shù)后31 h各組取部分存活大鼠測定心梗指標，包括化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)扎后31 h血漿肌鈣蛋白T(cTn-T)含量，采用心電圖機測定大鼠肢體II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高幅度，小動物超聲成像系統(tǒng)測定麻醉大鼠心臟超聲心動圖。將大鼠以4.5%戊巴比妥鈉麻醉，電動剃毛器剔除心區(qū)體毛，仰臥于觀測臺上，剃毛處均勻涂抹足量耦合劑，采用適宜探頭置于心區(qū)測定。采用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算射血分數(shù)EF%和梗死面積質(zhì)量。將心臟組織置入生理鹽水中泵清血液，將心肌切成2 mm片，置于1%NBT染液中，梗死面積呈現(xiàn)灰白色，非梗死面積為紅色。剪下梗死面積稱量濕重，與全心濕重的百分比作為梗死面積質(zhì)量。

2.4.3 對腎陽虛指標的影響 實驗終點各組取部分大鼠測定腎陽虛指標，采用苦味酸速率法測定血清Cr，化學(xué)發(fā)光法測定血清T3、T4水平。

3 結(jié)果

3.1 冠脈通拆方對大鼠急性心肌梗死死亡率的預(yù)防作用比較

表1顯示，冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后死亡時間多為結(jié)扎即刻至24 h之內(nèi)。冠脈通全方和補腎拆方組能有效降低死亡率(P<0.05)，活血開竅拆方組死亡率不但未降低反而高于模型對照組。對全方和補腎、活血開竅拆方各組大鼠死亡情況比較可見，補腎作用對腎陽虛條件下的心梗發(fā)生時死亡預(yù)防作用最明顯，單用活血成分對死亡預(yù)防作用不利，而全方對死亡預(yù)防的作用與補腎拆方相當(dāng)。各實驗組在31 h采血測定cTn-T 時存在麻醉致死情況，分別為假手術(shù)對照組1只，模型對照組4只，全方組2只，補腎組1只，活血組1只。

表1 拆方研究對腎陽虛大鼠急性心肌梗死發(fā)生時死亡預(yù)防作用

注：與模型組卡方檢驗：★P<0.05

3.2 冠脈通拆方對腎陽虛心梗大鼠血清肌鈣蛋白T、心電圖ST段抬高幅度、射血分數(shù)(EF%)、梗死重量百分比的作用比較

表2圖1～3顯示，與假手術(shù)對照組比較，腎陽虛心梗大鼠血清cTn-T明顯升高(P<0.01)，活血開竅拆方組對cTn-T降低作用最明顯，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腎陽虛心梗大鼠心電圖ST段明顯抬高(P<0.01)，活血開竅拆方組與冠脈通片全方組抑制ST段抬高的作用明顯，與假手術(shù)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而補腎拆方組對ST段作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腎陽虛心梗大鼠左心室射血分數(shù)(EF)明顯減少，與假手術(shù)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，冠脈通片全方組能有效增加EF(P<0.05)，而補腎拆方與活血開竅拆方組對EF作用均不明顯。腎陽虛心梗大鼠心肌梗死面積達33.2%，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，活血開竅拆方與冠脈通片全方能明顯降低梗死心肌范圍(P<0.05)，而補腎拆方對心肌梗死范圍作用不明顯。

表2 冠脈通拆方對腎陽虛心梗大鼠血清肌鈣蛋白T、心電圖ST段抬高幅度、EF%、梗死質(zhì)量百分比作用比較±s)

注：與假手術(shù)對照組方差分析比較:★★P<0.01，與模型對照組方差分析比較:☆P<0.05

圖1 冠脈通片補腎活血法對大鼠腎陽虛心梗模型心電圖ST段的影響

圖2 冠脈通片補腎活血法對大鼠腎陽虛心梗模型超聲心動圖的影響

圖3 冠脈通片補腎活血法對大鼠腎陽虛心梗模型梗死心肌NBT染色面積的影響

3.3 冠脈通拆方對大鼠腎陽虛心梗血清Cr、T3、T4的作用比較

表3顯示，腎陽虛心梗模型組Cr明顯高于假手術(shù)對照組(P<0.01)，T3、T4明顯低于假手術(shù)對照組(P<0.05)，冠脈通片全方降低Cr作用明顯(P<0.05)，升高T3、T4作用顯著(P<0.05)。補腎拆方組和活血開竅拆方組降低Cr、升高T3、T4的作用均不明顯(P>0.05)。

表3 冠脈通拆方對大鼠腎陽虛心梗血清Cr、T3、T4的作用比較

注：與假手術(shù)對照組t檢驗比較：★P<0.05，★★P<0.01；與模型對照組方差分析比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01

4 討論與結(jié)論

本項目組對前期研究結(jié)果表明，冠脈通片對大鼠急性心肌梗死有明確的藥效作用。冠脈通片臨床應(yīng)用已有多年，對臨床心梗的治療特色和臨床定位是本項目要解決的關(guān)鍵問題。通過對藥味組成分析，冠脈通片具有補腎和活血兩方面功效，用于肝腎不足、痰瘀阻絡(luò)之胸痹。胸痹心痛病機為本虛標實，本虛即為腎虛尤其是腎陽虛衰。因此，本項目我們對冠脈通片防治心梗作用的研究突出補腎活血作用特點，動物模型采用灌胃腺嘌呤+左冠狀動脈前降支法制備大鼠腎陽虛型心肌梗死證候模型，評價指標包括對缺血心肌保護和對腎陽虛兩方面的綜合作用。我們將受試組分為冠脈通片全方組、補腎拆方組、活血開竅拆方組，旨在驗證冠脈通片兼具補腎和活血兩方面的作用，對腎陽虛心梗具有補腎、活血雙方面的增效作用。

本實驗采用灌胃腺嘌呤法制備大鼠腎陽虛證，腺嘌呤是核算的主要組成成分之一，當(dāng)機體攝入大劑量腺嘌呤時，異常高濃度的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變成極難溶解于水的2.8-二羥基腺嘌呤，這種代謝產(chǎn)物沉積于腎小管與腎間質(zhì)部位，形成異物肉芽腫性炎癥，并堵塞腎小管腔引起相應(yīng)的腎小管腔呈囊狀擴張。隨著病程的進展，腎單位大量喪失，導(dǎo)致腎功能衰竭[4]。腺嘌呤代謝產(chǎn)物不僅因機械性阻塞腎小管而引起腎功能衰竭，而且還可能由于腺嘌呤代謝產(chǎn)物“毒性”作用，使腎組織中與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的多種酶活性受到抑制，影響腎組織的能量代謝，進而出現(xiàn)一系列的陽虛表現(xiàn)，如動物豎毛拱背、畏寒怕冷、活動及覓食減少等。較之氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽虛證候模型具有陽虛癥狀明顯、腎臟組織病理改變較重，病程較長，更符合實驗要求。

本實驗?zāi)I陽虛指標除血清腎功能指標外，甲狀腺激素也是腎陽虛評價指標之一。甲狀腺素是一種緩慢而長效的調(diào)節(jié)產(chǎn)熱的激素，與機體能量代謝密切相關(guān)，其含量降低會出現(xiàn)甲狀腺功能減低等一系列陽虛癥狀。甲狀腺功能的降低在腎陽虛病機學(xué)中具有重要意義，臨床腎陽虛患者血清T3、T4水平明顯低于健康者。文獻報道，腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛模型T3、T4水平較氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽虛模型偏低。故從反映甲狀腺功能抑制的指標T3、T4來看，腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛模型較氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽虛模型更符合要求。

對心肌梗死藥效的評價從死亡率、血清cTn-T、超聲心動圖(射血分數(shù))、心電圖ST段變化、梗死心肌NBT染色分析。大鼠心肌梗死術(shù)是具有較高死亡率的術(shù)式，本實驗室對大鼠單純心梗手術(shù)造模死亡率控制較穩(wěn)定，約在26.0%～33.%之間。本項目在腎陽虛基礎(chǔ)上合并心梗手術(shù)，術(shù)中及術(shù)后總死亡率略升高，達36.8%。cTn-T在心肌梗死早期診斷中具有較高靈敏度和較強特異性，較LDH、CK、CK-MB升高時間更早。我們以往實驗數(shù)據(jù)表明，大鼠AMI模型中，血清cTn-T高峰表達期為31 h，術(shù)后31 h目內(nèi)眥取血測定cTn-T是評價心肌梗死藥效的較為實用的方法[5]。小動物超聲心動圖具備準備、無創(chuàng)、安全、可重復(fù)性強的優(yōu)點，是觀察小動物心臟結(jié)構(gòu)和功能的有利手段。本實驗采用小動物超聲心動圖對腎陽虛心梗小鼠左心室射血功能給予測定。此外，心電圖ST段改變和心肌梗死NBT染色分析均是大鼠心梗藥效評價的經(jīng)典指標。

在大鼠腎陽虛心梗模型的基礎(chǔ)上，補腎拆方和冠脈通片全方對死亡的預(yù)防作用最突出，這與中醫(yī)理論對腎的論述相一致。腎為五臟之本，陰陽之根，心主陽氣和主血脈的功能需腎之資助，方能維持其正常的生理功能。盡管活血開竅拆方組對cTn-T降低作用最明顯，但若無溫補腎陽之品，其預(yù)防心梗死亡的能力則難以體現(xiàn)。與補腎拆方和活血開竅拆方比較，對血清Cr、T3、T4、EF、ST段、梗死面積各項指標的評價均以冠脈通片全方效果最顯著。

綜上所述，本實驗以大鼠腎陽虛心梗證候模型為研究對象，采用拆方的方法，對補腎作用、活血開竅作用、冠脈通片補腎活血法予以比較研究。結(jié)果表明，冠脈通片全方補腎、活血功效兼?zhèn)洌I陽以維持生命之本，活血開竅以化瘀除痹。本實驗通過基礎(chǔ)研究手段，為冠脈通片治療心梗的證候特點研究提供了藥理學(xué)數(shù)據(jù)參考。

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[3] 張翠香，劉建勛，李丹，等.冠脈通片對大鼠腦缺血再灌注模型神經(jīng)行為、小角質(zhì)細胞活化和SOD與MDA表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30(2)：401-404.

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Study on the Effects of Guan Mai Tong Tablet on the Coronary Heart Yang Deficiency and Myocardial Infarction Model by Tonifying Kidney and Promoting Blood Circulation

MIAO Shu-jie1，WANG Lei2，LV Nan2，DU Xue-mei1，HAO Di2，LI Xu2，LIU Hong-bin2△

(1.TianjinTongRenTangGroupCo.,Ltd.，Tianjin300020，China;2.DepartmentofPathology，Tianjininstituteofmedicalandpharmaceuticalsciences，Tianjin300020，China)

Objective：Study of invigorating the kidney and promoting blood circulation of Guan Mai Tong Tablet on the myocardral infarction rat model of kidney Yang deficiency. Methods：Kidney Yang Deficiency of rat model were made by adenine+AMI，GMT were made by oral in 2 days before adenine+AMI. Warm kidney yang group were included by Epimedium davidii Franch.，Lycium barbarum L.，F(xiàn)allopia multiflora (Thunb.) Harald，Taxillus chinensis)，Blood circulation group were included by Salvia miltiorrhiza Bunge，F(xiàn)los Carthami). cTn-T，ST，EF，weight of myocardial infarction，Cr，T3，T4 were observed. Results：The rate of Infarction in warm kidney yang group and GMT group were reduced.cTn-T and weight of myocardial infarction were induced in blood circulation group. Serum Cr in GMT group were induced，T3 and T4 were increased. Conclusion：This experiment by means of basic research on coronary artery through the characteristics of TCM Syndromes of tablets in the treatment of myocardial infarction provide pharmacological data for reference. Key words: Invigorating the Kidney and Promoting Blood Circulation；GMT tablet； Myocardral Infarction Model of Kidney Yang Deficiency；cTn-T；Ultrasonic echocardiography of Animals

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合專項(13180)-補腎活血法對心梗預(yù)防作用機理研究;國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81202801)-(P)RR介導(dǎo)MAPK信號通路對心腎綜合征聯(lián)動作用及益氣溫陽、活血利水治則機制研究

苗淑杰(1973-)，女，吉林人，高級工程師，醫(yī)學(xué)博士，從事藥品的研究與開發(fā)。

△通訊作者：劉洪斌(1972-)，從事藥理研究，E-mail：jtss@sina.com。

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1006-3250(2017)06-0783-04

2016-12-16