方氏頭針對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達(dá)的影響

田文靜，王瑞輝，黃琳娜，安軍明

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610000；陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046;3.西安市中醫(yī)醫(yī)院針灸推拿科，西安 710001)

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【針灸研究】

方氏頭針對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達(dá)的影響

田文靜1，王瑞輝2，黃琳娜3，安軍明3

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610000；陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046;3.西安市中醫(yī)醫(yī)院針灸推拿科，西安 710001)

目的： 觀察各組大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達(dá)的變化，探討方氏頭針治療VD的作用機(jī)理。方法：將40只健康大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和頭針組4組各10只，通過(guò)改良的4-VO法制備VD模型，隨后頭針組進(jìn)行選穴針刺，余3組正常喂養(yǎng)，10 d后采用Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，ELLSA檢測(cè)大鼠海馬區(qū)TNF-α表達(dá)的變化。結(jié)果:與正常組比較，模型組大鼠的平均逃避潛伏期及首次跨越原象限平臺(tái)的時(shí)間均有明顯延長(zhǎng)，海馬組織中TNF-α表達(dá)也明顯升高，而經(jīng)頭皮針治療后，大鼠的平均逃避潛伏期及首次跨越原象限平臺(tái)的時(shí)間明顯縮短，TNF-α表達(dá)明顯降低，正常組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：方氏頭針可以有效改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這可能與方氏頭皮針可以調(diào)控大鼠海馬組織中TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

方氏頭皮針；血管性癡呆；炎性因子；TNF-α

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康合格SD大鼠40只，體質(zhì)量(280±20) g，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)scxk-(軍)2012-0007)。SPF級(jí)鼠房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、頭針組，每組各10只，保證所有大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自由攝食和飲水(術(shù)前禁食除外)。

1.2 主要儀器與藥品

SDQ-30雙極射頻電凝器，(上海手術(shù)器械廠)，Morris水迷宮(陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供)，大鼠TNF-αELLSA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 VD模型制備

VD模型根據(jù)改良后的Pulsinelli，s4-VO法進(jìn)行制備[6]：手術(shù)前大鼠禁食12 h，禁水6 h稱重，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 ml/100 g)后，將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，行背側(cè)枕部正中切口，暴露出第一頸椎兩側(cè)橫突板上的翼小孔，用直徑為0.5 mm的電凝針電凝兩側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，致使兩側(cè)椎動(dòng)脈造成永久性閉塞，縫合待大鼠清醒后送回動(dòng)物房飼養(yǎng)，期間禁食。24 h后再次將大鼠麻醉，仰臥位固定行腹側(cè)頸正中切口，暴露出兩側(cè)的頸總動(dòng)脈，“4”號(hào)線掛線，用微動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈各5 min，反復(fù)3次，每次間隔1 h，期間用紅外燈照射維持大鼠體溫在37℃左右，縫合待大鼠清醒后送回動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。術(shù)后每只大鼠每日給予8萬(wàn)單位青霉素鈉皮下注射預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠除不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈、不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，余處理皆同模型組，正常組大鼠不做任何處理。

1.4 術(shù)后觀察

術(shù)后1周手術(shù)組大鼠的死亡率為15%，均為術(shù)后感染而死，另有1只因術(shù)后肢體偏癱不能做劃水動(dòng)作而棄用。

本文基于多源數(shù)據(jù)，采用假設(shè)檢驗(yàn)方法實(shí)證研究了我國(guó)兩化融合績(jī)效情況，并探索性地分析了兩化融合在加強(qiáng)企業(yè)價(jià)值創(chuàng)造能力、推動(dòng)行業(yè)綜合發(fā)展、提升經(jīng)濟(jì)發(fā)展質(zhì)量等方面績(jī)效產(chǎn)生的機(jī)理，得出以下3點(diǎn)結(jié)論：

1.5 治療

術(shù)后10 d，根據(jù)方云鵬主編的《頭皮針》[7]選穴方法選穴。倒臟上焦：中央溝在頭皮表面的投影向后1.5 cm的平行線，即為中央后回在頭皮表面的投影(即倒臟穴區(qū)，其橫向?qū)挾葹橹醒霚吓c中央后回之間的區(qū)域，縱向長(zhǎng)度從眉頂枕線向左右兩側(cè)旁開(kāi)1 cm開(kāi)始計(jì)算，平均為9 cm)，倒臟穴區(qū)分為上焦、中焦、下焦三部分，其中央后回下部4 cm的區(qū)域即為倒臟上焦穴區(qū)；記憶穴：以頂枕點(diǎn)、矢狀縫與人字縫的交匯點(diǎn)為中心點(diǎn)，分別向左右前下方，與頂枕線呈30°夾角劃兩條直線，在這兩條直線上，與中心點(diǎn)相距7 cm處即為記憶穴；思維穴：左右兩額骨隆凸之間，即由眉間棘直上3 cm處； 大鼠比擬人體取穴方法取穴。

穴位常規(guī)消毒后，選用0.4 mm×13 mm的無(wú)菌華佗牌針灸針，采用“飛刺”的方法將針快速深刺至頭骨骨膜(以右手拇指、食指、中指夾持針柄，保持針體平直，利用肘部帶動(dòng)腕部的力量，將針快速垂直刺入，穿透頭皮直達(dá)顱骨骨膜，留針30 min)，每日針刺1次，連續(xù)治療10 d。

1.6 水迷宮實(shí)驗(yàn)

1.6.1 定位航行試驗(yàn) 首先對(duì)所有大鼠進(jìn)行為期2 d的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)將大鼠分別從不同入水點(diǎn)放入水中，以大鼠在2 min內(nèi)尋找到平臺(tái)所在位置并爬上平臺(tái)停留10 s為訓(xùn)練成功。從第3天開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，每天4次，每次分別從A、B、C、D 4個(gè)不同象限的入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)游到平臺(tái)所在位置并爬上平臺(tái)的時(shí)間，2 min內(nèi)未爬上平臺(tái)的大鼠逃避潛伏時(shí)間按2 min記錄。

1.6.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，第6天撤去平臺(tái)，分別將大鼠從A、B、C、D 4個(gè)不同象限入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)第1次游過(guò)原平臺(tái)所在位置的時(shí)間以及2 min內(nèi)游過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.7 ELLSA法檢測(cè)

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠斷頭取腦，然后在冰臺(tái)上迅速剝離兩側(cè)的海馬組織，將海馬組織按2.5 ml/g 腦質(zhì)量加入相當(dāng)體積的冰生理鹽水，在冰浴中用勻漿器將海馬組織充分研磨隨后超聲波粉碎，進(jìn)一步將海馬組織進(jìn)行破碎，10000 r/min 4℃ 離心10 min取上清液。隨后嚴(yán)格按照TNF-α ELISA 法說(shuō)明書步驟進(jìn)行，在酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值，測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 水迷宮檢測(cè)結(jié)果

表1顯示，在為期2 d的定位航行訓(xùn)練中，各組大鼠的逃避潛伏時(shí)間均有較大的波動(dòng)，如正常組大鼠在第1天、第2天的平均逃避時(shí)間分別為(44.54±3.18)、(30.54±1.65)。而經(jīng)過(guò)2 d的學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，大鼠的逃避潛伏時(shí)間趨于穩(wěn)定，隨后3 d的定位航行試驗(yàn)中，大鼠的逃避潛伏時(shí)間分別為(25.86±3.48)、(23.04±3.35)、(22.11±1.84)。因此，為保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，剔除前2 d的數(shù)據(jù)，以第3、4、5天的記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，模型組大鼠在后3 d定位航性試驗(yàn)中的平均逃避潛伏時(shí)間比正常組大鼠有明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，提示全腦缺血發(fā)生后，大鼠的學(xué)習(xí)能力出現(xiàn)衰退，說(shuō)明癡呆模型制備成功。而與模型組大鼠在后3 d的平均逃避潛伏時(shí)間比較，頭針組大鼠的逃避潛伏時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，提示方氏頭皮針的干預(yù)可以有效提高VD大鼠的學(xué)習(xí)能力。正常組與假手術(shù)組比較，二者的平均逃避潛伏時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1顯示，在第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，撤去平臺(tái)后，通過(guò)記錄大鼠第一次游過(guò)原平臺(tái)所在位置的時(shí)間以及2 min內(nèi)游過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)來(lái)檢測(cè)大鼠空間記憶能力的變化。結(jié)果顯示，模型組大鼠第一次游過(guò)原平臺(tái)所在位置所需時(shí)間比正常組大鼠明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，游過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)也明顯少于正常組(P<0.01)。提示全腦缺血發(fā)生后，大鼠的空間記憶能力也出現(xiàn)了明顯的衰退。而與模型組大鼠比較，頭針組大鼠第一次游過(guò)原平臺(tái)所在位置所需時(shí)間有明顯縮短，游過(guò)次數(shù)也明顯增多(P<0.01)，提示方氏頭皮針干預(yù)可以有效改善VD大鼠的空間記憶能力。正常組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 ELLSA法檢測(cè)結(jié)果

表1顯示，各組大鼠海馬組織中炎性因子TNF-α表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬組織中TNF-α的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。而頭針干預(yù)治療后，大鼠海馬組織中TNF-α表達(dá)明顯降低(P<0.05)。正常組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮及ELLSA法檢測(cè)結(jié)果比較

注：與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

4 討論

方氏頭針是方云鵬老教授在傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代大腦皮層定位理論所研發(fā)的新的針灸療法。傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)認(rèn)為[8]，針刺穴位(頭穴)后產(chǎn)生的針感反應(yīng)具有沿循經(jīng)絡(luò)的一定路線向軀干、四肢傳導(dǎo)的能力，即針刺的循經(jīng)感傳現(xiàn)象。方云鵬根據(jù)現(xiàn)代生理學(xué)分析認(rèn)為，針刺的這種循經(jīng)感傳效應(yīng)并非是體表局部存在此種傳導(dǎo)興奮的機(jī)能線，而是神經(jīng)中樞(可能是大腦皮質(zhì))在機(jī)能排列在一起特殊的皮層上發(fā)生興奮的結(jié)果，并認(rèn)為經(jīng)絡(luò)就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特殊機(jī)能排列在人體局部的投射，人體上任何一點(diǎn)受到刺激都可以在中樞發(fā)生一個(gè)興奮點(diǎn)，在中樞上存在著一些機(jī)能上相互關(guān)聯(lián)的細(xì)胞，由此而解釋了針刺穴位(頭穴)能夠引起一條感應(yīng)路線的原因，從而總結(jié)性地認(rèn)為神經(jīng)是經(jīng)絡(luò)的本質(zhì)，經(jīng)絡(luò)是神經(jīng)功能活動(dòng)的現(xiàn)象。

方云鵬經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的不斷探索和總結(jié)，結(jié)合現(xiàn)代的大腦皮層功能定位學(xué)說(shuō)，創(chuàng)新性地提出了“大腦功能體表投影理論”，根據(jù)大腦皮層的不同功能定位在頭皮表面的投影將頭部穴位分為伏臟(2區(qū))、伏像(1區(qū))、倒臟(2區(qū))、倒像(2區(qū))等7個(gè)中樞刺激區(qū)和記憶、思維、說(shuō)話、運(yùn)平、信號(hào)、聽(tīng)覺(jué)、書寫、視覺(jué)、嗅味、平衡、呼循(除思維是一穴外，其余均為2穴)等22個(gè)皮質(zhì)功能刺激點(diǎn)，由此極大地豐富和發(fā)展了頭皮針的理論體系。本實(shí)驗(yàn)中，筆者根據(jù)方云鵬主編《頭皮針》的相關(guān)論述進(jìn)行選穴，選擇“倒臟上焦”“思維穴”“記憶穴”等。 “倒臟上焦”是頂葉中央后回的下部在頭皮表面的投影，“記憶穴”是頂葉的角回在頭皮表面的投影，“思維穴”則是額葉前部在體表的投影。研究表明[9-12]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中空間記憶的產(chǎn)生主要是頂葉和前額葉的協(xié)同作用，其中頂葉是空間信息加工的重要腦區(qū)，而前額葉則在記憶執(zhí)行過(guò)程中起重要作用。

VD是一類臨床病理表型和病理生理機(jī)制多樣的綜合征，其所致的認(rèn)知受損來(lái)源于多種形式的血管性病變，如出血性卒中、缺血性卒中及慢性缺血缺氧等，其中缺血性損傷是導(dǎo)致VD發(fā)病最常見(jiàn)的因素。目前VD的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，可能的機(jī)制包括膽堿能通路受損、Ca2+代謝失調(diào)、缺血性損傷后炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的遲發(fā)性腦損傷等。其中缺血性損傷后的炎癥反應(yīng)一直是VD發(fā)病過(guò)程中研究的熱點(diǎn)。在VD發(fā)病過(guò)程中，無(wú)論是腦卒中還是慢性缺血的過(guò)程，都少不了炎癥介質(zhì)的參與。以往的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF-α、IL-1β、C-反應(yīng)蛋白等炎癥介質(zhì)與癡呆所致的認(rèn)知功能缺損緊密相關(guān)[13-15]。最新的病理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，在VD認(rèn)知障礙患者的損傷白質(zhì)中，炎癥標(biāo)志物(如細(xì)胞因子和黏附分子)明顯增加[16]。筆者通過(guò)觀察各組大鼠海馬組織中炎性介質(zhì)TNF-α的表達(dá)變化也得到了一致的結(jié)果，并通過(guò)方氏頭針的干預(yù)驗(yàn)證了其頭針能明顯改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙，這與以往我們臨床的研究發(fā)現(xiàn)一致。以往臨床研究發(fā)現(xiàn)，方氏頭針在改善VD患者認(rèn)知障礙方面有著非常顯著的療效[17-18]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示在VD的早期治療中，采用方氏頭針控制甚至逆轉(zhuǎn)其認(rèn)知功能缺損癥狀是可行的策略，并進(jìn)一步揭示方氏頭針改善VD患者認(rèn)知障礙的機(jī)制可能與調(diào)控腦缺血損傷后海馬組織中炎性介質(zhì)TNF-α的表達(dá)，從而抑制腦缺血損傷后的炎性反應(yīng)有關(guān)，由此為臨床應(yīng)用和推廣方氏頭針治療血管性癡呆提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Scalp Acupuncture on the Expression of TNF-α in Hippocampal Region of Rats with Vascular Dementia

TIAN Wen-jing1，WANG Rui-hui2，HUANG Lin-na3，AN Jun-ming3

(1.Departmentofacupuncture,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610000,China;2.TraditionalChineseMedicalUniversityofShanxi,Xianyang710012,China;3.DepartmentofacupunctureofXianHospitalofTraditionalChineseMedical,Xian710001,China)

Objectives: This study was intended to observe the effect of scalp acupuncture on the expression of TNF-α in the hippocampal region and explore how to improve vascular dementia with Fang’s scalp acupuncture. Methods: Forty male rats were arbitrarily put into four groups each with 10 rats: normal group, mock group, model group and Fang’s scalp acupuncture group. We used a revised Pulsinelli 4-vessel-occlusion technique to build a vascular dementia model and performed acupuncture on the points of “Si Wei”, “Dao Zang Shang Jiao”, and “Ji Yi”. Acupuncture was applied on those points in the rats for 30 minutes per day. With the Morris water maze, the rats were examined for their capability in learning and memorizing. The enzyme linked immunosorbent assay was used to measure the expression of TNF-α in the hippocampal region. Results: It was found that the expression of TNF-α in the model group was significantly higher than that in the mock and normal groups.It was also seen that the increase in TNF-α was effectively suppressed in the scalp acupuncture group, resulting in the improvement in the memorizing and learning capabilities of the rats. Conclusions: This study indicated that the Fang’s scalp acupuncture was an effective way to treat the vascular dementia of rats by blocking the expression of TNF-α in the hippocampal region, leading to the improvement in their ability in learning and memorizing.

Fang’s scalp acupuncture；Vascular dementia；Inflammatory cytokines； TNF-α

田文靜(1984-)，女，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治療腦源性疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

R245.32+1

B

1006-3250(2017)06-0833-04

2016-12-16