電針百會印堂對抑郁模型大鼠行為學(xué)及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響?

佘燕玲，江 婷，陳 睿，李 洋，黎 程，徐世芬

(1.廣東省第二人民醫(yī)院廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運動傷害康復(fù)研究所， 廣州 510317；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院放射科， 廣州 510630；3.上海市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，上海 200071)

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【針灸研究】

電針百會印堂對抑郁模型大鼠行為學(xué)及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響?

佘燕玲1，江 婷2，陳 睿1，李 洋1，黎 程1，徐世芬3△

(1.廣東省第二人民醫(yī)院廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運動傷害康復(fù)研究所， 廣州 510317；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院放射科， 廣州 510630；3.上海市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，上海 200071)

目的：探討電針百會、印堂對抑郁模型大鼠行為學(xué)及其海馬超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：選取雄性Wistar Kyoto天生抑郁模型大鼠30只，按隨機數(shù)字表法分為模型組、電針組及假針組，以10只Wistar大鼠作為正常對照。電針組針刺百會、印堂每次15 min，每天1次，假針組進行安慰治療。3周后對大鼠進行稱重及行為學(xué)檢測，電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果：4組大鼠體質(zhì)量增加比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，電針治療后糖水偏好百分比、曠場實驗運動總距離增加，強迫游泳不動時間減少，海馬超微結(jié)構(gòu)得到改善。結(jié)論：電針百會、印堂可改善抑郁模型大鼠抑郁樣行為及海馬超微結(jié)構(gòu)。

抑郁癥；電針；行為學(xué)；海馬；超微結(jié)構(gòu)

抑郁癥是一種以快感缺失、認(rèn)知損傷、情緒持續(xù)低落、社交活動減少、反復(fù)自殺念頭等為核心癥狀的情感性精神疾病[1]。目前抑郁癥的發(fā)病機制尚未完全清楚，臨床療效也不盡如人意。故尋找有效的治療方案對抑郁癥的治療及整個社會的發(fā)展具有重大的意義。

海馬被認(rèn)為是與情感、認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶、行為密切相關(guān)的腦區(qū)[2]。有報道稱，抑郁癥患者海馬體積比正常人小10%～15%[3]。動物研究亦發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠海馬樹突棘萎縮、膠質(zhì)細(xì)胞及中間神經(jīng)元數(shù)目減少，突觸結(jié)構(gòu)破壞[4]。本研究運用電針干預(yù)Wistar Kyoto (WKY) 抑郁模型大鼠，觀察干預(yù)后大鼠抑郁藥行為及海馬超微結(jié)構(gòu)的改變，探討電針治療抑郁癥的作用機制，為抑郁癥的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級Wistar大鼠、WKY抑郁模型大鼠4周齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證編號SCXK (京)2012-0001)。對動物的各項處理方式均按照上海市中醫(yī)醫(yī)院動物管理委員會相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定進行。

1.1.2 實驗儀器 G6805-1A電針治療儀(上海華誼醫(yī)用儀器廠)，水迷宮、強迫游泳實驗系統(tǒng)(上海移數(shù)信息科技有限公司)，JEM-1200EX型透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、干預(yù)及稱重 采用隨機數(shù)字表法將WKY大鼠分為模型組、電針組、假針組各10 只。選用與WKY大鼠來源于同一品系的Wistar大鼠作為正常對照組[5-6],正常組及模型組不作處理。電針組選取大鼠百會、印堂穴為治療穴位刺入5 mm，給予連續(xù)波頻率2Hz，電流強度3 mA，每天1次，每次15 min，治療3周。假針組進行安慰處理，在百會、印堂處進行淺刺約2 mm(只在皮層)，不刺入肌肉層，針灸針用膠帶固定并連接電針，不予以通電，每天1次，每次15 min，干預(yù)3周。

1.2.2 糖水偏好測試 給予大鼠150 ml 1%蔗糖水和純水各1瓶，12 h后調(diào)換2瓶液體位置，24 h后分別測量每只大鼠糖水和純水的消耗量，計算糖水偏好百分比。計算公式為：(糖水飲用量)/ (糖水飲用量)+ (純水飲用量)×100%。

1.2.3 強迫游泳試驗 將大鼠置于水溫為23～25℃的透明丙烯酰胺樹脂材料的圓桶中，保證大鼠后肢不能觸到圓桶底部。試驗前1 d先對所有大鼠進行15 min預(yù)游，預(yù)游結(jié)束后擦干大鼠身上液體后繼續(xù)飼養(yǎng)。24 h后進行5 min的強迫游泳測試，記錄各大鼠不動時間。每只大鼠測試結(jié)束后需重新擦凈身上的水，避免對下一只大鼠測試造成干擾。

1.2.4 曠場試驗 將大鼠置于實驗箱的箱底中央格，敞箱頂部攝像頭記錄其5 min內(nèi)的活動并通過連接電腦儲存分析數(shù)據(jù)。每只大鼠測試結(jié)束后，立即清理箱內(nèi)的糞便及尿液，同時使用75% 酒精噴灑擦拭實驗箱，避免前只大鼠所遺留氣味對下只大鼠行為檢測造成影響。

1.2.5 電鏡 取新鮮海馬組織1 mm3，經(jīng)修塊清洗后迅速放入2.5%戊二醛中前固定4 h，經(jīng)PBS清洗后放入1%鋨酸中后固定2 h。PBS徹底清洗，酒精梯度脫水。脫水后將組織放入epson812中進行包埋。包埋后放入烤箱中聚合72 h，之后于超薄切片機上進行切片，再經(jīng)硝酸鉛和醋酸鈾雙重染色，使用JEM-1200EX型透射電鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量增長及行為學(xué)改變

表1顯示，電針治療可改善抑郁模型大鼠抑郁樣行為。糖水偏好實驗結(jié)果顯示，與正常組、電針組比較，模型組和假針刺組糖水偏好百分比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；強迫游泳試驗結(jié)果顯示,電針干預(yù)后其不動時間較模型組和假針刺組減少(P<0.01)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；曠場試驗結(jié)果顯示,與正常值大鼠比較，模型組和假針刺組運動總距離明顯減少(P<0.05)。電針組運動總距離增加，但與模型組、假針組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。電針干預(yù)對大鼠體質(zhì)量增長無影響或影響較小，4組大鼠體質(zhì)量增長組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長及行為學(xué)改變±s)

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與電針組比較：##P<0.01

2.5 海馬組織超微結(jié)構(gòu)

正常組(圖1A)：神經(jīng)元密度高，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，可見核仁、核膜雙重結(jié)構(gòu)。突觸數(shù)量多，神經(jīng)纖維髓鞘完整，突觸間隙存在，囊泡豐富，線粒體結(jié)構(gòu)完好。

模型組(圖1B)：海馬神經(jīng)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核呈橢圓形或不規(guī)則形，線粒體嵴破壞，突觸結(jié)構(gòu)不清晰，胞漿內(nèi)有大量空泡，可見自噬體。

電針組(圖1C)：海馬神經(jīng)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)尚豐富，線粒體嵴少量破壞，突觸結(jié)構(gòu)較完整，部分囊泡缺失，突觸間隙存在，突觸數(shù)量尚可。

假針組(圖1D)：海馬神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不同程度破壞，線粒體嵴破壞，突觸結(jié)構(gòu)不清晰，胞漿內(nèi)有大量空泡和吞噬物。

圖1 各組海馬電鏡結(jié)果(放大倍數(shù)10000X，型號JEM-1200EX)注：A.正常組；B.模型組；C.電針組；D.假針組

3 討論

本研究采用WKY作為抑郁大鼠模型進行研究。起初WKY大鼠作為自發(fā)性高血壓大鼠的正常對照。直至1989年，Pare[5]等經(jīng)過一系列研究認(rèn)為，WKY大鼠符合抑郁模型的標(biāo)準(zhǔn)。其在強迫游泳中不動時間增加，曠場試驗中自主活動次數(shù)減少，且對應(yīng)激表現(xiàn)敏感[7-8]。另有研究表明，WKY大鼠體內(nèi)腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇等激素釋放紊亂，表現(xiàn)出活動遲緩、快感缺失等抑郁樣行為，被廣泛運用于神經(jīng)生物學(xué)及新型抗抑郁藥物等研究[6, 9]。

抑郁癥病位在腦，腦神機能不利為主要病機。百會屬督脈，督脈是諸陽經(jīng)之匯，對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用，其主干行于脊里，上行至風(fēng)府進入腦內(nèi)，上循顛頂，故督脈與腦、脊髓有密切關(guān)系，歷代醫(yī)家素有“病變在腦，首取督脈”之說。印堂為經(jīng)外奇穴，督脈經(jīng)氣流注之所，具有醒腦安神作用。前期臨床研究證實[10-11]，電針百會、印堂可以緩解抑郁癥情緒低落的主癥，還可整體調(diào)節(jié)機體，療效與藥物百憂解相當(dāng)。實驗研究[4, 12]亦表明，電針百會、印堂可改善不同抑郁模型大鼠抑郁樣行為，故本研究采用百會、印堂穴進行干預(yù)。本研究采用糖水偏好試驗、強迫游泳試驗及曠場試驗，分別評價WKY大鼠獎賞能力、絕望狀態(tài)及在新奇環(huán)境的探索能力。本研究結(jié)果顯示，電針組抑郁樣行為較模型組改善，而假針刺無此效果(見表1)，表明電針百會、印堂可改善WKY大鼠“快感缺失”“絕望”“活動減少”等癥狀。

課題組前期研究結(jié)果顯示，電針治療可誘導(dǎo)海馬Schaffer-CA1長時程增強(Long-term potentiation，LTP)，增加海馬NMDA受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)亞基2B(NR2B)的表達(dá)[4]。本研究采用透視電鏡進一步觀察海馬超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果顯示，正常組海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，而模型組和假針組海馬超微結(jié)構(gòu)病理改變明顯，表現(xiàn)為突觸結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體嵴破壞，胞漿內(nèi)含大量空泡，電針組大鼠經(jīng)過21 d治療后結(jié)構(gòu)破壞有所改善。Yousef Tizabi[9]等通過立體測量學(xué)方法對雌性Wistar和WKY大鼠左側(cè)海馬進行測量計算，發(fā)現(xiàn)WKY大鼠海馬較Wistar大鼠小約20%。海馬體積減小與海馬神經(jīng)元數(shù)目減少、頂樹突萎縮、線粒體嵴破壞、突觸小泡數(shù)量減少等有直接聯(lián)系。在不同的抑郁模型上亦可觀察到類似的變化。如FSL(Flinders Sensitive Line)也是一種轉(zhuǎn)基因抑郁大鼠模型，其海馬CA1區(qū)線粒體數(shù)目比對照組FRL(Flinders Resistant Line)大鼠少，且形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。經(jīng)過丙咪嗪治療后，其CA1區(qū)線粒體的數(shù)量會增加，推測丙咪嗪的抗抑郁效應(yīng)可能與修復(fù)其海馬細(xì)胞線粒體神經(jīng)可塑性有關(guān)[13]。Gong Y[14]等也報道，慢性應(yīng)激模型大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理病變。本研究結(jié)果提示，電針治療可以修復(fù)WKY大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的破壞。

綜上所述，電針治療可改善WKY大鼠抑郁樣行為，對海馬超微結(jié)構(gòu)具有一定的修復(fù)作用。

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Effects of Electroacupuncture at GV20 and EX-HN 3 on Depressive Like Behaviors and Ultrastructure of Hippocampus in a Depression Rat Model

SHE Yan-ling1, JIANG Ting2, CHEN Rui1, LI Yang1, LI Cheng1, XU Shi-fen3△

(1.TraditionalMedicalandSportsInjuryRehabilitationResearchInstitute,GuangdongSecondProvincialGeneralHospital,Guangzhou510317,China; 2.DepartmentofRadiology,ThirdAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510630,China; 3.ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China)

Objective: To explore the effects of electroacupuncture at GV20 and EX-HN 3 on depressive like behaviors and ultrastructure of hippocampus in a depression rat model. Methods: 30 Male putative model of depression rats, Wistar Kyoto, were divided into model group, EA group and sham group randomly, 10 Wistar rats were used as normal control. EA treatment was given 15 min per day for 3 weeks. GV20 and EX-HN 3 were applied in this research. Rats in sham groups were received placebo treatment. After 3 weeks, the weight and behavior tests were evaluated for all rats. The hippocampus was removed and the ultrastructure was observed by electronic speculum. Results: There was no significant difference in weight gain of four groups. The sucrose preference and the total distance of open field test were increased，while the immobility time of forced swimming test was decreased, and the ultrastructure of hippocampus was improved in EA treatment group. Conclusion: Electroacupuncture at GV20 and EX-HN 3 may improve depressive-like behaviors and hippocampal ultrastructure in depression rat model.

Depresssion; Electroacupuncture; Behaviors; Hippocampus;Ultrastructure

上海市教委科研創(chuàng)新重點項目(2014zz116)-韁核在抑郁癥及電針抗抑郁中的作用及機制研究；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題-中醫(yī)藥創(chuàng)新內(nèi)涵建設(shè)(ZY3-CCCX-3-3022)-電針抗抑郁效應(yīng)及韁核的介導(dǎo)機制研究；廣東省中醫(yī)藥局科研項目(20172004)-電針對抑郁大鼠外側(cè)韁核βCaMKII/GluR1信號通路及神經(jīng)元電活動的作用機制

佘燕玲(1987-)，女，廣東潮州人，研究實習(xí)員，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸對抑郁癥相關(guān)疾病的機制研究。

△通訊作者：徐世芬(1975-)，女，河北人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治療腦病的臨床與機制研究，Tel：021-51322043，E-mail：xu_teacher2006@126.com。

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1006-3250(2017)06-0837-03

2016-12-12