中藥聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法對(duì)艾滋病免疫重建不全患者IL-2及IL-10 mRNA水平的影響?

鄒 雯，王 健△，劉 穎，咸慶飛，張復(fù)春

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；2.廣州市第八人民醫(yī)院，廣州 510060)

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【臨床基礎(chǔ)】

中藥聯(lián)合高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法對(duì)艾滋病免疫重建不全患者IL-2及IL-10 mRNA水平的影響?

鄒 雯1，王 健1△，劉 穎1，咸慶飛1，張復(fù)春2

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；2.廣州市第八人民醫(yī)院，廣州 510060)

目的：觀察中藥免疫2號(hào)顆粒聯(lián)合HAART療法對(duì)44例艾滋病免疫重建不全患者IL-2及IL-10 mRNA水平的影響，初步探索該療法對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。方法：隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照研究，治療組23例采用HAART+免疫2號(hào)顆粒，對(duì)照組21例采用HAART+免疫2號(hào)顆粒模擬劑，觀察時(shí)間1年。觀察指標(biāo)包括CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-2mRNA、IL-10mRNA。結(jié)果：試驗(yàn)組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)上升顯著優(yōu)于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)組IL-2上升，ΔCt增加值試驗(yàn)組上升幅度明顯優(yōu)于對(duì)照組，2組療后-療前差值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)組和對(duì)照組IL-10ΔCt值均上升，2組療后-療前差值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：中藥免疫2號(hào)顆粒聯(lián)合HAART治療可較對(duì)照組明顯上調(diào)艾滋病免疫重建不全患者IL-2的表達(dá)，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

中醫(yī)藥；免疫重建不全；IL-2；IL-10

免疫功能重建不全是艾滋病治療領(lǐng)域的難點(diǎn)和瓶頸問題，約30%左右的患者在保證良好依從性的前提下接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)療法后，即使血漿病毒載量較長(zhǎng)時(shí)間控制在檢測(cè)不出的水平之下，其CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量始終在基線水平或低于200～350 cells/mm3[1]。中藥聯(lián)合HAART能夠有效調(diào)節(jié)患者免疫功能，促進(jìn)免疫重建，然而其作用機(jī)制尚不明確。

文獻(xiàn)研究顯示，IL-2(Interleukin-2)、IL-10(Interleukin-10)等細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和維持免疫平衡方面具有重要作用[2-5]。本研究采用隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照方法研究中藥免疫2號(hào)顆粒聯(lián)合HAART對(duì)44例艾滋病免疫重建不全患者IL-2、IL-10等細(xì)胞因子的影響，探索該療法對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

1 資料

1.1 一般資料

選取2014年2月至2015年5月廣州市第八人民醫(yī)院44例免疫重建不全患者，患者均參加中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院臨床評(píng)價(jià)中心中央隨機(jī)系統(tǒng)分組。其中治療組23例，對(duì)照組21例。治療組年齡(41.62±9.8)歲，身高(164.83±6.52) cm，體質(zhì)量(55.45±8.7) kg，CD4基線值(201.67±62.36)cells/ul；對(duì)照組年齡(41.53±9.89)歲，身高(164.11±6.52) cm，體質(zhì)量(57.8±8.6) kg，CD4基線值(193.1±67.54)cells/ul。2組年齡、體質(zhì)量、體溫、心率、呼吸、血壓癥狀體征基線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《艾滋病診療指南》[6]。接受HAART治療大于12個(gè)月且小于24個(gè)月的患者CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)<200 cells/ul，接受HAART治療大于24個(gè)月的患者CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)<350 cells/ul，HIV RNA低于檢測(cè)值；入組時(shí)CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)≥50 cells/ul；年齡18～70歲；自愿參加本研究并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

入組前嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染未得到控制者；入組前1個(gè)月內(nèi)或正在參加其他藥物臨床試驗(yàn)的患者；入組前1個(gè)月內(nèi)接受免疫調(diào)節(jié)治療者；有自身免疫性疾病患者；妊娠或哺乳期婦女或準(zhǔn)備妊娠婦女；任何有腎功能不全癥狀患者；存在智力或語言障礙，不能充分理解試驗(yàn)內(nèi)容或給予良好合作的患者。

2 方法

2.1 治療用藥

治療組采用 HAART(藥物組合為AZT/TDF+3TC+EFV/NVP)+免疫2號(hào)顆粒(黃芪24g，黨參18 g，靈芝18 g，枸杞子18 g等藥物組成)，規(guī)格：5.5 g/袋，溫水沖服，每日2次，每次1袋，與抗病毒西藥間隔1 h以上。顆粒劑由江陰天江制藥有限公司提供(批號(hào)1311327)；對(duì)照組采用 HAART(藥物組合為AZT/TDF+3TC+EFV/NVP)+免疫2號(hào)顆粒模擬劑。模擬劑由上述廠家自行設(shè)計(jì)生產(chǎn)最終由非試驗(yàn)參與人員統(tǒng)一包裝，模擬劑在外形、包裝、顏色、氣味上與原藥一致。用藥療程為1年。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

抽取患者5ml靜脈血EDTA-K2抗凝，用Trizol LS提取全血中總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IL-2及IL-10 mRNA水平，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)采用流式細(xì)胞術(shù)，以上均委托廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)處理采用ΔCT方法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平：先計(jì)算每組中每個(gè)基因3個(gè)復(fù)孔的平均Ct值，ΔCt=平均Ct值(靶基因)-Ct(β-actin)，療前療后各檢測(cè)1次。

2.3 主要儀器與試劑

RNA提取TRIZOL LS REAGENT(Invitrogen，貨號(hào)10296010)；逆轉(zhuǎn)錄MLV REVERSE TRANSCRIPTASE(Invitrogen，貨號(hào)28025013)、RNASEOUT RECOMB(Invitroge，貨號(hào)10777019)；擴(kuò)增 Faststart Universal SYBR(Roche，貨號(hào)4913914001-1)，所用PCR儀器 Bio-Rad(型號(hào)CFX-96)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

表1顯示， 治療12個(gè)月后，2組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均上升，試驗(yàn)組上升顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組和對(duì)照組IL-2 mRNA ΔCt值均上升，試驗(yàn)組上升幅度明顯優(yōu)于對(duì)照組，2組療后-療前差值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；試驗(yàn)組和對(duì)照組IL-10 mRNA ΔCt值均上升，但2組療后-療前差值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及外周血中IL-2、IL-10 mRNA水平ΔCT值前后比較

注：與對(duì)照組治療后比較：*P<0.05

4 討論

HIV進(jìn)入人體后，CD4+T淋巴細(xì)胞被大量吞噬、破壞，成為人體免疫系統(tǒng)中最主要的攻擊目標(biāo)。CD4輔助T細(xì)胞(Th)可分泌Th1和Th2等不同細(xì)胞因子，其中IL-2由Th1產(chǎn)生，具有增強(qiáng)吞噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞免疫的作用，是參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，與其他細(xì)胞因子有協(xié)同和拮抗作用，共同完成機(jī)體免疫機(jī)能的平衡調(diào)節(jié)。IL-10是一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要由Th2細(xì)胞、活化的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞的生物調(diào)節(jié)。有研究顯示，免疫重建不全患者的IL-2水平較免疫重建良好的患者明顯降低[7]；另外IL-2作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，與HAART療法聯(lián)合應(yīng)用可比單用HAART療法更有效提升CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，免疫調(diào)節(jié)指機(jī)體通過多方面、多層次的正負(fù)反饋機(jī)制控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和時(shí)限，以維持機(jī)體生理功能的平衡與穩(wěn)定。其方法包括通過免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑對(duì)機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫細(xì)胞之間以及免疫細(xì)胞與各種體液因子之間進(jìn)行整體調(diào)節(jié)。而且免疫學(xué)認(rèn)為人體是一個(gè)統(tǒng)一的整體，要保持人體的健康，就必須保持免疫系統(tǒng)處于相對(duì)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。這種認(rèn)識(shí)與中醫(yī)的整體觀念以及治療上的扶正祛邪、調(diào)整陰陽頗為相似。因此IL-2、IL-10 mRNA水平研究對(duì)于探索中醫(yī)藥治療艾滋病的療效作用機(jī)制具有一定的價(jià)值。

IL- 2被發(fā)現(xiàn)迄今已有30余年，但仍然是最受關(guān)注和被廣泛研究的細(xì)胞因子之一。其主要功能不僅是提升免疫反應(yīng)，更重要的是維持Treg細(xì)胞的穩(wěn)定及其介導(dǎo)的免疫耐受，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[9]。既往 IL-2 多應(yīng)用于提高抗腫瘤免疫研究[10-11]，在中醫(yī)藥治療艾滋病方面研究較少。中藥免疫2號(hào)顆粒由黃芪、黨參、靈芝、枸杞子等藥物組成，具有扶正固本的功效。本研究用中藥免疫2號(hào)顆粒聯(lián)合HAART干預(yù)12個(gè)月后分析結(jié)果顯示，試驗(yàn)組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)上升明顯優(yōu)于對(duì)照組，試驗(yàn)組與對(duì)照組IL-2均上升，ΔCt增加值試驗(yàn)組上升幅度明顯優(yōu)于對(duì)照組，2組療后-療前差值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而試驗(yàn)組與對(duì)照組IL-10均上升，ΔCt增加值2組療后-療前差值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明IL-2可能是一個(gè)有潛力且比較敏感的反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)能力的指標(biāo)，其與反映艾滋病患者免疫系統(tǒng)重建國(guó)際公認(rèn)的金指標(biāo)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

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Effects of Immune 2 Granule Combined with HAART Therapy treatment on IL-2 and IL-10 mRNA level of HIV/AIDS with Incomplete Immune Recovery

ZOU Wen1, WANG Jian1△, LIU Ying1, XIAN Qing-fei1, ZHANG Fu-chun2

(1.TCMCenterforAIDSPreventionandTreatment,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;2.GuangzhouEighthPeople’sHospital,Guangzhou510060,China)

Objective:To assess the therapeutic effect of Immune 2 granule on IL-2 and IL-10 mRNA level of HIV/AIDS patients with incomplete immune recovery after highly active antiretroviral therapy (HAART) for 12 months, to explore the mechanism of immune regulation.Methods:Randomized, double-blind, placebo-controlled study was adopted, 23 cases of treatment group was treated with HAART+ Immune 2 granule, 21 cases were treated with HAART+ placebo, treatment period lasted for 12 months with the observation parameters such as. CD4+Tlymphocyte count, IL-2 and IL-10.Results: The CD4+cell count of treatment group increased significantly compared with the control group, the difference is statistically significant between groups; IL-2 increased in treatment group, ΔCt increased more than the control group, significant statistical differences was found between groups; IL-10 increased in treatment group, ΔCt increased by 0.51±3.2, the control group increased by 1.24±4.37, no significant statistical differences was found between groups. Conclusion: Chinese medicine immune 2 granule with HAART therapy can increase the expression of IL-2 mRNA level in HIV/AIDS patients with incomplete immune recovery. The mechanism of TCM intervention to promote immune regulation was shown. But it still needs to enlarge the sample size to get more evidences.

Traditional Chinese medicine; Incomplete Immune Recovery; IL-2; IL-10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81503571)-從T細(xì)胞免疫活化分子及Toll樣受體信號(hào)通路探究中醫(yī)藥治療HAART后免疫無應(yīng)答患者的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所自主選題項(xiàng)目(YZ-1662)

鄒 雯(1982-)，女，湖南人，助理研究員，醫(yī)學(xué)碩士，從事艾滋病的中醫(yī)臨床與研究。

△通訊作者：王 健，E-mail:62tiger@163.com。

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1006-3250(2017)06-0824-02

2016-12-17