天南星雙向發(fā)酵炮制工藝研究

朱舟，伍朝君，陳玲

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶400021；2.四川省樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川樂山614000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

天南星雙向發(fā)酵炮制工藝研究

朱舟1，伍朝君2，陳玲1

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶400021；2.四川省樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川樂山614000）

目的研究白僵菌轉(zhuǎn)化天南星固體發(fā)酵的條件，以達(dá)到解毒增效的目的。方法對(duì)菌株BT1轉(zhuǎn)化天南星粗粉的固體發(fā)酵培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，通過菌種活化、種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)方法及正交試驗(yàn)考察了種子培養(yǎng)基、底物量、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間4種因素的影響，優(yōu)選最佳轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果白僵菌菌株BT1為優(yōu)選出的最適宜試驗(yàn)菌株，其最佳培養(yǎng)條件為在YPD液體培養(yǎng)基中以28℃、200 r／min轉(zhuǎn)速條件培養(yǎng)3 d作為種子；采用固體發(fā)酵方式，以中藥天南星為底物，10%的接種量，28℃培養(yǎng)20 d為白僵菌的最佳轉(zhuǎn)化條件；培養(yǎng)基組成為天南星粗粉－鮮豆渣－米粉(1∶1∶1)，含水量為50%時(shí)，能獲得毒性較低、抗驚厥活性較高的炮制品。結(jié)論采用該條件發(fā)酵天南星，可達(dá)解毒增效目的。

天南星；白僵菌；雙向發(fā)酵；炮制工藝

天南星為天南星科植物天南星Arisaema erubescens（Wall.）Schott.、異葉天南星Arisaema heterophyllum Blume或東北天南星Arisaema amurenseMaxim.的干燥塊莖，主要含有生物堿、苷、黃酮、脂肪酸、揮發(fā)油等成分。天南星性溫，味苦、辛，有大毒，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有燥濕化痰、祛風(fēng)定驚、消腫散結(jié)功效，臨床可用于治療頑痰咳嗽、風(fēng)痰眩暈、中風(fēng)痰壅、口眼斜、半身不遂、癲癇、驚風(fēng)、破傷風(fēng)等，功效卓著且應(yīng)用廣泛，但因其毒性較大，臨床屢有用藥不慎而導(dǎo)致中毒死亡的報(bào)道[1]。利用微生物固體發(fā)酵技術(shù)用于有毒中藥的炮制，可達(dá)到減毒增效的目的。莊毅[2]、潘揚(yáng)等[3]對(duì)馬錢子的固體發(fā)酵研究使用了多種菌種，如槐耳、靈芝、猴頭等減毒，效果均較明顯。在增效方面，據(jù)衛(wèi)生部藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵中藥只需要1／28的量，即可與一般煎、煮、熬水提物1份的量發(fā)揮同等藥效[4]。

本研究中采用雙向固體發(fā)酵炮制工藝，以生天南星為藥性基質(zhì)，以白僵菌為發(fā)酵菌株，在一定條件下進(jìn)行固體發(fā)酵，進(jìn)行初步的發(fā)酵、化學(xué)、毒性、藥效研究，并應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)選發(fā)酵工藝，獲得有效的天南星發(fā)酵炮制品，為進(jìn)一步研究發(fā)酵天南星的減毒增效方法奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

紫外可見光分光度計(jì)（瑞士梅特勒－托利多公司）；GTR16－2型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

生品天南星，為天南星科植物天南星Arisaema erubescens（Wall.）Schott.，異葉天南星Arisaema heterophyllum Blume或東北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥塊莖，批號(hào)為20160812，購自重慶市中藥材公司；發(fā)酵基質(zhì)(自配)；發(fā)酵菌株，球孢白僵菌Beauveria sp.(菌種編號(hào)為BNCC147472，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；ABTS溶液(編號(hào)為BTN131114，北京奧萊博科技有限公司)；YPD液體種子培養(yǎng)基(產(chǎn)品貨號(hào)為HB5193－1，青島海博生物技術(shù)有限公司)；PDA斜面培養(yǎng)基（上海哈靈生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

斜面菌種活化：取冷藏的球孢白僵菌菌種，按照無菌操作要求轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，27℃避光培養(yǎng)7 d。

天南星初篩培養(yǎng)基制法：將天南星打成40目粉末，用水調(diào)至糊狀，使天南星粉含量為15%，再加入1%的瓊脂，加熱使瓊脂融化，裝入三角瓶中，在121℃條件下高壓滅菌30min，冷卻至80℃后在無菌條件下倒入90mm平板中，備用。

白僵菌發(fā)酵菌株篩選：將白僵菌菌株活化的菌絲用無菌的打孔器打10mm菌塊，在無菌條件下轉(zhuǎn)接至天南星瓊脂平板中央，置27℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，將可在天南星瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌株作為初篩的促發(fā)菌株；而后將初篩菌株的原種接在天南星粗粉（過40目篩）袋料培養(yǎng)基上，每組合接6袋，菌絲滿袋后收獲并以發(fā)酵組合的發(fā)酵性狀、菌絲生長(zhǎng)速度，菌絲滿袋時(shí)間為指標(biāo)，判定不同菌種的發(fā)酵情況，以能正常發(fā)酵，滿袋時(shí)間短，發(fā)酵菌質(zhì)情況良好的發(fā)酵菌株作為篩選雙向發(fā)酵工藝的發(fā)酵菌株。

1.2.2 天南星發(fā)酵工藝優(yōu)化篩選

漆酶是白僵菌菌絲體在基質(zhì)上生長(zhǎng)產(chǎn)生的酶[5－6]，能非特異性地降解木質(zhì)素、芳香族化合物及多環(huán)芳烴等多種難降解的化合物，在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起重要作用。初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒性較低、抗驚厥作用越強(qiáng)的菌質(zhì)，發(fā)酵菌株產(chǎn)生的漆酶活性越大。這跟高慧娟等[7]報(bào)道的川芎增效作用與漆酶活性的關(guān)系結(jié)果類似。因此，本試驗(yàn)中以漆酶活性為指標(biāo)篩選白僵菌雙向發(fā)酵工藝。

液體種子制備：取篩選出的白僵菌菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，置溫度為（28±1）℃，相對(duì)濕度為60%條件下培養(yǎng)7 d，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。無菌條件下將活化的白僵菌菌種接入YPD液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖20 g／L，酵母粉5 g／L，KH2PO41.5 g／L，MgSO40.75 g／L，CaCO32.5 g／L，維生素B10.1 g／L），28℃、200 r／min黑暗條件下培養(yǎng)3 d，挑選液體澄清、菌球大小均勻者作為雙向固體發(fā)酵的液體菌種備用。

雙向發(fā)酵：取天南星藥材適量，粉碎（過40目篩），鮮豆渣20 g，米粉20 g，混勻，含水量為50%，分裝于發(fā)酵瓶中，121℃高壓滅菌120min備用，作為藥性基質(zhì)。將白僵菌液體種子定量接種于該基質(zhì)，黑暗條件下于恒溫發(fā)酵室培養(yǎng)。

最佳固體轉(zhuǎn)化條件確定：在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇種子培養(yǎng)基的接種量（因素A）、底物量（因素B）、轉(zhuǎn)化時(shí)間（因素C）、轉(zhuǎn)化溫度（因素D）4個(gè)影響因素，各設(shè)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以漆酶活性為指標(biāo)，以確定白僵菌轉(zhuǎn)化天南星固體發(fā)酵的最佳條件。

漆酶測(cè)定：采用ABTS法[8]測(cè)定，取含鮮菌絲天南星菌質(zhì)5 g，加入5倍體積蒸餾水輕輕研磨后，4℃、3 000 r／min離心20min，取上清液即為粗酶液。取2.9m L 0.5mmol／L ABTS溶液置1 cm比色皿中，迅速轉(zhuǎn)至30℃水浴中預(yù)熱5 min，移取0.1 m L稀釋6 000倍的粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定4min內(nèi)的吸光度（OD值）變化，記錄ΔOD值。每分鐘氧化1μmol ABTS所需的酶量為1個(gè)酶活單位。根據(jù)以下公式求出漆酶（Lac）活性。

其中，消光系數(shù)ε＝3.6×104L／（mol·cm），n為酶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵菌株篩選

不同白僵菌菌株在天南星平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見表1。篩選可得BT1和BT5 2個(gè)菌株，其生長(zhǎng)良好，且生長(zhǎng)速度快，菌絲潔白，菌絲活力好。

不同白僵菌菌株在生天南星藥性基質(zhì)中的生長(zhǎng)適應(yīng)性各不相同，詳見表2。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲滿袋時(shí)間、菌絲外觀等判定菌株的發(fā)酵情況，并據(jù)此選擇最適合在天南星藥性基質(zhì)上生長(zhǎng)的菌株BT1為酵制天南星的發(fā)酵菌株。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表3和表4?？梢?，最優(yōu)組合為A2B3C1D2，因素主次為C＞D＞A＞B。即接種量為10%，底物量為20 g，轉(zhuǎn)化時(shí)間為20 d，轉(zhuǎn)化溫度為28℃。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

結(jié)果見表5。

表1 白僵菌菌株在天南星平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

表2 不同白僵菌菌株在天南星藥性基質(zhì)上的發(fā)酵情況

表3 因素水平表

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果(n＝9)

表5 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 最佳固化培養(yǎng)配方確定

白僵菌雙向發(fā)酵天南星最佳固化培養(yǎng)配方為500m L玻璃瓶中裝天南星粗粉20 g，鮮豆渣20 g，米粉20 g，起始含水量為50%，并以此為培養(yǎng)基；最佳轉(zhuǎn)化條件為YPD液體培養(yǎng)基中以28℃、200 r／min條件培養(yǎng)3 d作為種子，以10%的接入量接入固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)20 d。

3 討論

“雙向發(fā)酵”[9－11]主要以植物來源的藥材為“藥性基質(zhì)”（含營(yíng)養(yǎng)成分），由經(jīng)過篩選的藥用真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在經(jīng)歷復(fù)雜的真菌生長(zhǎng)的生理、生化過程后，形成藥性和功能主治與原藥材不完全相同的“藥性菌質(zhì)”。由于這種發(fā)酵技術(shù)既能讓藥材營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為真菌生長(zhǎng)所利用，又能使藥材原有的化學(xué)成分在真菌體內(nèi)酶的催化下發(fā)生轉(zhuǎn)變，因而被稱為“雙向發(fā)酵”?！半p向發(fā)酵”是一種現(xiàn)代純種發(fā)酵工藝，旨在為研制一類原創(chuàng)中藥新藥——“菌質(zhì)”提供理論依據(jù)和實(shí)踐方向，但由于“雙向發(fā)酵”本身源于傳統(tǒng)的發(fā)酵法，屬于中藥炮制學(xué)的范疇。研究表明，雙向固體發(fā)酵技術(shù)不僅可用于毒性中藥的減毒[12]，還可提高某些中藥的療效。這種屬于中藥生物技術(shù)范疇的藥用真菌，為中藥的二次開發(fā)及新藥的研制等提供了嶄新的發(fā)展方向，而各種不同的菌質(zhì)將構(gòu)成中藥的新領(lǐng)域，發(fā)展前景廣闊。采用菌種固定的“雙向發(fā)酵”工藝對(duì)毒性中藥進(jìn)行減毒的系統(tǒng)研究[13]，避免產(chǎn)生毒素的雜菌污染，才能保證發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定及產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，并能方便對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)過程進(jìn)行數(shù)字化管理，是完全適合中藥現(xiàn)代化需求的新途徑。

本研究中采用白僵菌對(duì)天南星進(jìn)行固體雙向發(fā)酵炮制，結(jié)果顯示，生品天南星經(jīng)藥用真菌發(fā)酵后，改變了原藥材的形態(tài)及性狀。白僵菌[14－15]為半知菌類蟲生真菌，也是具有廣譜性的昆蟲病原真菌，這類真菌含有蛋白酶、脂肪酶，前期研究已顯示，它們?cè)诟缓镜鞍住⒅舅?、淀粉質(zhì)的天南星上易于生長(zhǎng)。因此，用白僵菌發(fā)酵天南星減毒有充分的理論依據(jù)和工作基礎(chǔ)。最佳固體發(fā)酵工藝驗(yàn)證結(jié)果，2 000 g天南星藥性基質(zhì)中接種菌株，發(fā)酵中試生產(chǎn)，經(jīng)發(fā)酵炮制干燥后，共獲得1 697 g酵制天南星成品，得率為84.85%，獲得的酵制天南星成品菌質(zhì)表面呈類白色，粗糙，附有白色或淡黃色粉霜，質(zhì)硬而脆，斷面酥松，夾雜有白色或淡黃色粉霜，氣微辛，味微麻。經(jīng)初步急性毒性試驗(yàn)觀察，酵制天南星炮制品毒性大大降低，60%乙醇提取物小鼠1次灌胃，生品天南星的半數(shù)致死量(LD50)為（145.0±8.3）g／kg，酵制天南星炮制品的LD50為（295.47±25.23）g／kg。藥效學(xué)試驗(yàn)表明，酵制天南星炮制品抗驚厥效果與生品相差不大，說明經(jīng)雙向發(fā)酵炮制后，降低了藥材毒性而保持了療效，基本達(dá)到了研究目的，證明白僵菌對(duì)天南星進(jìn)行固體發(fā)酵炮制方式在天南星藥材解毒增效中的可行性，但其轉(zhuǎn)化機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

[1]劉英波，潘年松，莫應(yīng)明.天南星的毒性認(rèn)識(shí)及防治研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，36（3）：99－102.

[2]莊毅.抗癌新藥槐耳沖劑的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1998，33（5）：273.

[3]潘揚(yáng)，張炫，蔣亞平，等.雙向發(fā)酵前后馬錢子生物堿含量及其HPLC指紋譜的比較[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（6）：362.

[4]游明樂.中國(guó)食（藥）用真菌發(fā)酵工程進(jìn)展研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（2）：327.

[5]陶君，馬愛民，郭愛玲，等.靈芝漆酶活性的測(cè)定及其產(chǎn)漆酶條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2008，29（3）：311－314.

[6]周雪婷，張躍華，羅志文，等.真菌漆酶的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2012，32（9）：2－3.

[7]高慧娟，余夢(mèng)瑤，江南，等.雙向固體發(fā)酵對(duì)川芎活血化淤的增效作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（6）：1370－1372.

[8]魏佳，吳天祥，楊海龍.靈芝漆酶活性測(cè)定條件的優(yōu)化[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（5）：52.

[9]江南，魏巍，許曉燕，等.雙向固體發(fā)酵技術(shù)對(duì)附片解毒增效的初步研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，26（11）：2677－2678.

[10]劉霞，王永軍，張佐.雙向固體發(fā)酵后雷公藤菌質(zhì)的急性毒性研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，36（12）：34－35.

[11]涂霞，潘揚(yáng).雙向發(fā)酵－毒性中藥炮制減毒的新途徑[J].菌物研究，2010，8（1）：52－54.

[12]江南，魏巍，許曉燕，等.中藥川烏的固體發(fā)酵炮制新技術(shù)的建立[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，50（5）：1104－1106.

[13]劉建成，馬貴軍，蔣立薪.復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕工藝的初步研究[J].飼料工業(yè)，2011，32（7）：32－34.

[14]路文雅，張麗，關(guān)美娟，等.10種白僵菌菌株發(fā)酵液對(duì)植物線蟲和昆蟲病原線蟲的生物活性[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（2）：82－86.

[15]李尊華，袁志輝，郭曉賢，等.球孢白僵菌固態(tài)發(fā)酵及產(chǎn)孢條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5302－5304.

Bidirectional Ferm entation Processing Technology of Arisaema Heterophyllum

Zhu Zhou1，Wu Chaojun2，Chen Ling1
（1.Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing，China 400021；2.Leshan Vocational and Technical College，Leshan，Sichuan，China 614000）

Ob jective To study the condition of solid fermentation of Beauveria Bassiana for transforming Arisaema Heterophyllum，in order to achieve the purpose of detoxification and synergism.M ethods The solid fermentation culture conditions and the medium of strain BT1 for transforming the dry powder of Arisaema Heterophyllum were made for the optimization test.The effects of 4 factors，such as seed culture medium，substrate input，transition temperature and transition time were investigated by orthogonal test and the strain activation，seed culture，solid fermentation culture methods.The optimum conditions for transformation were optimized.Results The Beauveria Bassiana strain BT1 is the most suitable test strain，the best condition when the strain of Beauveria Bassiana BT1 was cultured in the YPD liquid medium under 28℃and 200 r／min for 3 d was optimum.The optimum transition condition of Beauveria Bassiana strainwas as follows：taking Arisaema Heterophyllum as the substrate with inoculation amount of 10%and culturing for 20 d at 28℃by using the solid fermentation method.When the medium compositions was Arisaema Heterophyllum powder，fresh bean cake and rice flour with ratio of 1∶1∶1 and the water content as 50%,the transition product with lower toxicity and higher activity of anti convulsion was obtained.Conclusion Using this fermentation condition for transforming Arisaema Heterophyllum can achieve the purpose of etoxification and synergism.

Arisaema Heterophyllum；Beauveria Bassiana；bidirectional fermentation；processing technology

R282.7；R943.1

A

1006－4931(2017)10－0007－04

2017－01－08；

2017－02－11)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.002

重慶市衛(wèi)生和計(jì)生委中醫(yī)藥科技項(xiàng)目[ZY20150236]。

朱舟，女，大學(xué)本科，主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幣谥萍皞鹘y(tǒng)工藝，（電子信箱）zzlxrg＠163.com。

伍朝君，女，大學(xué)本科，副教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)，（電子信箱）wuchaojun11x＠163.com。