白藜蘆醇影響CNE－2細胞生長的端粒酶機制研究

張潔，林培彬，馬宇昕

（廣東藥科大學，廣東廣州510006）

·實驗研究·

白藜蘆醇影響CNE－2細胞生長的端粒酶機制研究

張潔，林培彬，馬宇昕

（廣東藥科大學，廣東廣州510006）

目的觀察不同濃度白藜蘆醇對鼻咽癌CNE－2細胞生長及對細胞內端粒酶活性的影響。方法不同濃度白藜蘆醇處理體外培養(yǎng)鼻咽癌CNE－2細胞48 h后，噻唑藍（MTT）法檢測藥物對細胞增殖的抑制作用。流式細胞術檢測白藜蘆醇對細胞凋亡的影響。TRAP熒光定量PCR檢測不同濃度藥物處理后，CNE－2細胞內端粒酶活性的改變。結果0.025，0.050，0.100，0.200 mmol／L的白藜蘆醇作用48 h后，白藜蘆醇呈濃度依賴性抑制CNE－2細胞增殖，抑制率分別為(1.16±2.95)%，(7.51±2.77)%，(20.12±6.01)%，(54.82± 8.66)%；流式細胞儀分析結果表明，CNE－2細胞凋亡率上升，且呈濃度依賴性；藥物處理后，細胞內端粒酶活性均降低，其中0.100mmol／L組和0.200mmol／L組活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論白藜蘆醇呈濃度依賴性抑制鼻咽癌CNE－2細胞生長，促進其凋亡，并可降低細胞內端粒酶活性。

白藜蘆醇；鼻咽癌；CNE－2；端粒酶；作用機制

鼻咽癌（NPC）是我國南方最常見的頭頸部惡性腫瘤，目前臨床治療首選放射治療（簡稱放療）。端粒酶活性激活是NPC細胞的重要特征之一。Chen等[1]對NPC組織檢測后發(fā)現(xiàn)，85%初發(fā)NPC有端粒酶活性表達，100%復發(fā)NPC有端粒酶活性表達。近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，NPC放化療中配合中藥治療，在直接殺傷腫瘤細胞、增加放療敏感性、減輕放療毒副作用、延長患者生存期方面均有良好效果[2]。白藜蘆醇（resvertrol）為廣泛存在于虎杖、葡萄等植物中的天然多酚化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化等功效[3－4]。有研究表明，白藜蘆醇亦具有抗腫瘤活性[5]。本研究中通過觀察白藜蘆醇對鼻咽癌細胞株CNE－2細胞內端粒酶活性的影響，旨在探討其抗腫瘤的機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器及試藥

1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；白藜蘆醇（美國Sigma公司），用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成100 mmol／L貯存液，0.22μm一次性無菌濾器過濾滅菌，分裝－20℃貯存，使用時稀釋，使DMSO終濃度低于0.3%；噻唑藍（MTT，美國Sigma公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；AnnexinV－FITC／PI凋亡檢測試劑盒（四正柏生物公司，批號為FXP018－50）；端粒酶活性TRAP定時定量檢測試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，批號為GMS20106.2）；熒光定量PCR儀（Bio－Rad公司）。

1.2 細胞

人鼻咽癌細胞株CNE－2由中山大學腫瘤防治中心贈送，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，置37℃及5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞每2～3 d傳代1次。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 方法

1.3.1 MTT比色法測定細胞增殖抑制率

將CNE－2細胞按每孔5×103個細胞接種于96孔板中，設不同濃度加藥試驗組、不加藥對照組及空白對照組，每組不同濃度藥物設5個復孔，37℃及5%二氧化碳培養(yǎng)過夜。改用含不同濃度（0.025，0.050，0.100，0.200mmol／L）的白藜蘆醇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5mg／m L）20μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μLDMSO，振蕩5min，待完全顯色后，用酶標儀測定其吸光度（A）值，測定波長為570 nm。重復3次。按以下公式求出細胞增殖抑制率。

1.3.2 流式細胞檢測術檢測細胞凋亡率

用6孔板培養(yǎng)細胞，設不加藥對照組和不同濃度（0.050，0.100，0.200mmol／L）加藥組，貼壁后加藥培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)液內及貼壁的細胞至離心管內，1 000 r／min離心5min后，去上清。按試劑盒說明書，用1倍濃度結合緩沖液重懸細胞，調節(jié)其濃度為2×106個／mL。取100μL細胞懸液于5m L流式管中，加入5μL Annexin V／FITC混勻后室溫避光孵育5min，加入20μg／m L的PI 10μL，并加入400μL磷酸鹽緩沖液（PBS），立刻進行流式檢測凋亡率。重復試驗3次。

1.3.3 TRAP法檢測端粒酶活性

此法基于多聚酶聯(lián)擴增的敏感高效的體外端粒酶活性的檢測技術，運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，快速地進行DNA模板的擴增。

細胞樣品制備：用6孔板培養(yǎng)細胞，設不加藥對照組和不同濃度（0.050，0.100，0.200mmol／L）加藥組，貼壁后加藥培養(yǎng)48 h，細胞濃度不低于1×105個／m L。留少量培養(yǎng)液，用細胞刮收集細胞至1.5mL離心管，3000 r／min離心5min。棄上清液，根據(jù)細胞數(shù)加入適量預冷裂解液，冰上孵育30min后4℃15000 r／min離心5min，取上清液。

定量檢測：按試劑盒說明書，移取15μL反應液置0.5mL PCR管，加入約含250 ng總蛋白待測的細胞裂解液，加入2.5μL染色液后用補充液定容至25μL，瞬時離心5 s后放入熒光定量PCR儀。30℃作用20min后進入PCR循環(huán)，95℃30 s，60℃90 s循環(huán)35次，收集數(shù)據(jù)，分析Ct值。重復操作3次。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 白藜蘆醇對CNE－2細胞增殖的影響

MTT檢測結果顯示，不同濃度（0.025，0.050，0.100，0.200mmol／L）白藜蘆醇處理細胞48 h后，細胞增殖被抑制，抑制率分別為(1.16±2.95)%，(7.51± 2.77)%，(20.12±6.01)%，(54.82±8.66)%。詳見圖1。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對CNE－2細胞的抑制率曲線（n＝3）

2.2 白藜蘆醇誘導細胞凋亡作用

流式細胞檢測術后發(fā)現(xiàn)，不同濃度（0.050，0.100，0.200mmol／L）白藜蘆醇作用于細胞48 h后，細胞凋亡率分別為(4.95±1.60)%，(16.11±6.02)%，(39.99± 2.74)%，可見，0.100，0.200mmol／L藥物作用組均明顯高于不加藥對照組的(2.89±0.89)%（P＜0.01）。詳見圖2及圖3。

圖2 不同濃度白藜蘆醇對CNE－2細胞凋亡誘導率曲線（n＝3）

注：縱、橫坐標分別為采用PI和Annexin V／FITC為染料的熒光強度。圖3不同濃度白藜蘆醇誘導CNE－2細胞凋亡流式分析圖

2.3 端粒酶活性測定結果

根據(jù)試劑盒和熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)結果分析，以Ct值反映端粒酶活性高低。Ct值大表明酶活性低，Ct值小表明酶活性高。結果見表1。

表1 白藜蘆醇對CNE－2細胞端粒酶活性的影響（n＝3）

3 討論

廣東省是NPC高發(fā)區(qū)，臨床治療以放療為主，而中草藥在NPC治療中的輔助作用也越來越受到重視。有研究報道，NPC患者在放療基礎上配合中藥治療，可明顯提高臨床療效和患者的生存率[6]。白藜蘆醇為天然多酚化合物，廣泛存在于虎杖等70余種植物中。由于其有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)及神經(jīng)保護作用等廣泛的生物學效應，臨床應用前景非常廣闊[7]。白藜蘆醇對人神經(jīng)母細胞瘤SH－SY5Y和小鼠胚胎成纖維細胞有明顯增殖抑制作用，并能啟動細胞凋亡[8－9]。也有學者報道過白藜蘆醇對NPC細胞生長和凋亡的影響，Lee等[10]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能增加Caspase－3表達，通過p53依賴性途徑引起凋亡。但對于其他可能引起細胞凋亡的分子機制，現(xiàn)在仍未明確，研究也不多。

端粒酶活性激活是NPC細胞重要特征之一。NPC患者血漿中端粒酶逆轉錄酶催化亞基（hTERT）表達水平明顯升高[11]；在NPC細胞中端粒酶活性特異性高表達，且隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，端粒酶活性持續(xù)升高，使得腫瘤細胞能避開復制衰老而進入“永生化”[12]。文忠等[13]采用TRAP銀染等方法對臨床不同分期NPC細胞中端粒、端粒酶及其亞單位進行檢測，發(fā)現(xiàn)臨床晚期NPC細胞端粒酶陽性率明顯高于臨床早期，伴頸部淋巴結轉移者端粒酶陽性率高于無頸部淋巴結轉移者。姚小寶等[14]、沈永忠等[15]利用siRNA抑制hTERT表達來降低端粒酶活性，結果發(fā)現(xiàn)，NPC細胞增殖明顯抑制，細胞凋亡數(shù)目增加，并能有效控制腫瘤細胞遷移和侵襲。

本研究中將不同濃度（0.025，0.050，0.100，0.200mmol／L）白藜蘆醇作用于CNE－2細胞48 h后，通過MTT法檢測細胞活力。結果發(fā)現(xiàn)，藥物對細胞增殖的抑制率隨著藥物濃度的增高而增加，提示白藜蘆醇對細胞增殖有抑制作用，且呈濃度依賴性。用流式細胞儀檢測不同濃度（0.050，0.100，0.200mmol／L）藥物作用后細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，CNE－2細胞凋亡率隨藥物濃度升高而上升，特別在藥物濃度達到200μmol／L時，細胞晚期凋亡較100μmol／L的給藥濃度明顯增加，提示藥物呈濃度依賴地誘導細胞凋亡，且作用強度在其濃度達到200μmol／L時有明顯質的飛躍。TRAP法檢測不同濃度藥物作用后，CNE－2細胞內端粒酶活性發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度升高，腫瘤細胞內端粒酶活性依次下降，呈濃度相關性。將用藥后細胞凋亡率與端粒酶活性Ct值作相關性分析發(fā)現(xiàn)，2個變量Pearson相關系數(shù)為0.966(P＜0.01)，故推測，白藜蘆醇有可能通過下調端粒酶活性促進細胞凋亡，抑制細胞生長，可為后續(xù)研究提供新的思路。

[1]Chen RY，Yuan PW，Nicholls JM，et al.Telomerase activation in nasophryngealcarcinoma.[J].Br JCancer，1998，77(3)：456－460.

[2]梅全喜，孫雪穎，高玉橋，等.中醫(yī)藥防治鼻咽癌的研究進展[J].中國藥業(yè)，2007，16（4）：28－29.

[3]孫穎，黃明亮，王華.白藜蘆醇抗氧化性及安全性的研究進展[J].食品工業(yè)，2013，34（4）：177－180.

[4]李萍，程曉馨.白藜蘆醇抗菌抗病毒作用的研究進展[J].中國微生態(tài)學雜志，2014，26（10）：1215－1219.

[5]杜成，任玉杰，王慶偉，等.白藜蘆醇衍生物的合成及抑制宮頸癌HeLa細胞腫瘤活性[J].有機化學，2013，33（6）：1279－1283.

[6]都基亮，宋莉，王曦，等.放療配合中藥治療鼻咽癌的臨床觀察[J].中外醫(yī)療，2010，29（20）：75－77.

[7]安梅，周瑾，陳曉宇.白藜蘆醇藥理學作用的研究進展[J].腫瘤藥學，2014，4（4）：242－246.

[8]張黎，張潔，李勇，等.白藜蘆醇對小鼠胚胎成纖維細胞增殖和細胞周期的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2009，25（12）：1109－1111.

[9]張黎，張潔，劉靖.白藜蘆醇對神經(jīng)母細胞瘤SH－SY5Y增殖的影響[J].神經(jīng)解剖學雜志，2010，26（2）：150－154.

[10]Lee YJ，Park IS，Shim JH，et al.Resveratrol contributes to chemosensitivity ofmalignantmesothelioma cells with activation of p53[J].Food Chem Toxicol，2014，63(1)：153－160.

[11]付新灑，申聰香，李冠雪，等.鼻咽癌患者外周血端粒酶hTERTmRNA的定量檢測及其臨床意義[J].南方醫(yī)科大學學報，2015，35（6）：894－897.

[12]Liu JP，Cassar L，Pinto A，et al.Mechanisms of cell immortalization mediated by EB viral activation of telomerase in nasopharyngealcarcinoma[J].CellRes，2006，16（10）：809－817.

[13]文忠，肖健云，唐發(fā)清，等.鼻咽癌病人端粒酶表達的研究[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，1998，4（4）：25－28.

[14]姚小寶，王曉俠，張少強，等.干擾hTERT基因慢病毒載體對人鼻咽癌細胞的生長抑制作用[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25（20）：939－943.

[15]沈永忠，王燕，陳始明，等.短發(fā)夾RNA抑制hTERT基因對鼻咽癌細胞端粒酶活性及PCNA和Caspase－3蛋白表達的影響[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008，22（9）：411－415.

Influence M echanism of Resveratrol A ffecting Telomerase of CNE－2 Cells

Zhang Jie，Lin Peibin，Ma Yuxin
（Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong，China 510006）

Ob jective To observe the effects of Resveratrol（Res）with different concentration on the proliferation，apoptosis and the activity of telomerase of the CNE－2 cells.M ethods After CNE－2 cells were treated with different concentration of Res for 48 h，the inhibition of cell proliferation with MTT assay was detected，and the cell apoptosis by flow cytometry was analyzed.The telomerase activity of CNE－2 cells was observed by TRAP fluorogenic quantitative PCR.Resu lts After CNE－2 cells were treated with different concentration（0.025，0.050，0.100，0.200 mmol／L）of Res for 48 h，Res could inhibit the proliferating of cells as concentration－dependence，and their inhibition ratio were(1.16±2.95)%，(7.51±2.77)%，(20.12±6.01)%，(54.82±8.66)%，respectively.The apoptotic rates were up－regulated which were detected by flow cytometry，and the effects was concentration dependent.The telomerase activity of the cells was reduced after the cells was treated by Res，and the result was statistically significant of the groups of Res with concentration of 0.100 mmol／L and 0.200 mmol／L(P＜0.05).Conclusion Res can inhibit the growth of CNE－2 cells，promote cells′apoptosis，and down－regulate the telomerase activity of the cells.

Resvetrol；throat cancer；CNE－2；telomerase；mechanism of action

R284；R285.5

A

1006－4931(2017)10－0011－03

2017－02－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.003

廣東省中醫(yī)藥管理局科研立項項目[20141160]。

張潔（1981－），女，講師，研究方向為中藥抗腫瘤藥理學，（電子信箱）yingchichong＠163.com。