龍膽中黃酮化合物含量測(cè)定的方法學(xué)研究

朱丹 楊菁 李林龍 楊航 黎燕

摘要[目的]建立紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定龍膽中總黃酮含量的方法。[方法]通過(guò)微波輔助雙水相提取龍膽中總黃酮類(lèi)化合物，采用紫外可見(jiàn)分光光度法，以蘆丁作為對(duì)照品，測(cè)定其含量。[結(jié)果]黃酮類(lèi)化合物濃度在10.4～73.0 μg/mL，其吸光度與濃度有良好的線(xiàn)性關(guān)系；該方法的精密度、重復(fù)性和加樣回收率的RSD值分別為0.30%、1.31%、2.27%。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，可以用于測(cè)定龍膽中總黃酮類(lèi)化合物。

關(guān)鍵詞龍膽；黃酮化合物；紫外可見(jiàn)分光光度法；含量測(cè)定；方法學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）14-0113-02

Abstract[Objective] The research aimed to establish a method for determination of the total flavonoids from Radix Gentianae.[Method]The total flavonoids in Radix Gentianae were extracted by microwaveassisted aqueous twophase. The contents of total flavonoids were determined by UV-visible spectrophotometry with rutin as the reference substance. [Result]The method was a good linear at the range of 10.4-73.0 μg/mL of the total flavonoids. The RSD values of the precision test， reproducibility experiment and the recovery rate test were 0.30%，1.31%，2.27%，respectively.[Conclusion]The method is accurate， rapid and reproducible，and can be used to determine the total flavonoids from Radix Gentianae.

Key wordsRadix Gentianae；Flavonoids；UVvisible spectrophotometry；Determination of content；Methodology

龍膽（Radix Gentianae）為龍膽科植物條葉龍膽（Gentiana manshurica Kitag.）、龍膽（G.scabra Bge.）、三花龍膽（G. triflora Pall.）、堅(jiān)龍膽（G.rigescens Franch）的干燥根及根莖，味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[1]。近年來(lái)研究表明，龍膽的地上部分含有黃酮類(lèi)化合物[2-3]，具有抗炎、抗菌、降血糖等藥理活性[4]。該試驗(yàn)采用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)龍膽中的總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行考察[5-6]。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)儀器。UV-500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），M1-211A微波爐（美的公司），AR2140電子分析天平（上海奧豪斯有限公司），DRHH數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.2試驗(yàn)試劑。龍膽藥材（產(chǎn)地：廣西）；蘆丁對(duì)照品（上海永恒生物科技有限公司，純度>98%）；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸銨等試劑均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1供試品溶液的制備。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的藥材0.25 g 于圓底燒瓶中，加入20 mL 35%乙醇-20%硫酸銨雙水相提取劑，搖勻，置于微波爐中。在功率420 W下萃取25 min。靜置，待溶液分相后，取出上相在60 ℃下水浴揮干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0 mL，作為供試品溶液。

1.2.2蘆丁對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品20.85 mg置于100 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇溶液、搖勻，稀釋至刻度，配制成0.208 5 mg/mL對(duì)照品溶液。

1.2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。精密吸取一定量的蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液于2個(gè)10 mL的容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，后用無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑作為空白對(duì)照，在200～800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，選擇最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1線(xiàn)性關(guān)系考察。精密吸取“1.2.2”的蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于10 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法，自“分別加入5%亞硝酸鈉溶液”起依法測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取“1.2.2”的蘆丁對(duì)照品溶液和“1.2.1”的供試品溶液各1.0 mL，按照“1.2.3”方法，自“分別加入5%亞硝酸鈉溶液”起，分別在0、5、10、15、20、25、30 min測(cè)定其吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

1.2.4.3精密度試驗(yàn)。精密吸取“1.2.1”的供試品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法，自“分別加入5%亞硝酸鈉溶液”起依法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD值。

1.2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的龍膽藥材0.25 g各6份，按“1.2.1”方法進(jìn)行提取制備。精密吸取1.0 mL提取液，按“1.2.3”方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算RSD值。

1.2.4.5加樣回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的龍膽藥材0.25 g各6份，分別加入一定量的蘆丁對(duì)照品，按“1.2.1”方法進(jìn)行提取，精密吸取1.0 mL提取液，按“1.2.3”方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總黃酮的回收率。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇按照“1.2.3”操作，結(jié)果表明，對(duì)照品與樣品溶液在505 nm處有最大吸收，故選擇505 nm為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2線(xiàn)性關(guān)系考察按照“1.2.4.1”操作，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為A=10.68C-0.002（R2=0.999），表明蘆丁對(duì)照品在10.4～73.0 μg/mL其吸光度與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3穩(wěn)定性按照“1.2.4.2”操作，發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)照品和藥材提取液顯色后在30 min內(nèi)穩(wěn)定，其RSD值分別為0.22%和0.30%，表明蘆丁對(duì)照品和提取液中的黃酮類(lèi)化合物在30 min內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4精密度按照“1.2.4.3”操作，計(jì)算得RSD值為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性按照“1.2.4.4”操作，計(jì)算RSD值為1.31%，表明該方法的重復(fù)性好。

2.6加樣回收率由表1可知，平均回收率為99.6%，RSD值為2.27%，說(shuō)明該方法回收率高，滿(mǎn)足分析測(cè)定的要求。

3結(jié)論與討論

紫外可見(jiàn)分光光度法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。該試驗(yàn)采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色劑與龍膽中總黃酮發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成穩(wěn)定的吸光物質(zhì)，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)龍膽中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，考察了方法的精密度、重現(xiàn)性及加樣回收率，測(cè)定結(jié)果的RSD值均在要求的范圍之內(nèi)，表明該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，可以用于龍膽中總黃酮含量的測(cè)定。

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