產(chǎn)甘草苷內(nèi)生真菌HGE5的鑒定及抑菌活性研究

李偉 白長勝 鄭雪 鄭春英

摘要[目的]研究甘草內(nèi)生真菌HGE5及其活性代謝產(chǎn)物，為深入開發(fā)利用該菌株提供依據(jù)。[方法]選取12種受試致病菌，測定內(nèi)生真菌HGE5的抑制活性，并采用形態(tài)特征觀察法及rDNA ITS 序列同源性分析對內(nèi)生真菌HGE5進(jìn)行鑒定，利用HPLC法對HGE5發(fā)酵液進(jìn)行分析。[結(jié)果]甘草內(nèi)生真菌HGE5對8種受試致病菌有較強(qiáng)的抑菌作用，內(nèi)生真菌HGE5為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；該菌發(fā)酵液中含有甘草苷。[結(jié)論]HGE5是甘草苷產(chǎn)生菌，該菌的獲得可為甘草苷成分的生產(chǎn)提供新方法。

關(guān)鍵詞內(nèi)生真菌；鑒定；抑菌活性；甘草苷

中圖分類號R931文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0100-03

Abstract[Objective] The research aimed to study the endophytic fungi HGE5 from Glycyrrhiza uralensis and its active metabolites，and provide the basis for further development and utilization of the strain.[Method]The inhibitory activity of endophytic fungi HGE5 was determined by 12 kinds of pathogenic bacteria.The endophytic fungi HGE5 was identified by morphological observation and rDNA ITS sequence homology analysis.The fermentation broth of HGE5 was analyzed by HPLC.[Result]The endophytic fungus HGE5 had strong antibacterial activity against eight kinds of pathogenic bacteria.The endophytic fungus HGE5 was Fusarium oxysporum.The fermentation broth contained licorice.[Conclusion]HGE5 is a Liquiritinproducing endophytic fungus，which provides a new method for the production of Liquiritin.

Key wordsEndophytic fungus；Identification；Antimicrobial activity；Liquiritin

作為新興的微生物資源，植物內(nèi)生菌不僅能夠產(chǎn)生一些特殊復(fù)雜多樣的活性代謝物，還能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似或全新的活性代謝物[1]。因此，將植物內(nèi)生菌作為發(fā)酵菌株，利用發(fā)酵法工廠化生產(chǎn)宿主植物中的某些活性成分，不僅可以開發(fā)新資源，有利于植物資源的可持續(xù)利用；同時(shí)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥物或食品時(shí)，可顯著縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本，并可通過控制發(fā)酵參數(shù)、誘變育種等措施來提高其活性成分的產(chǎn)率，因此微生物發(fā)酵法生產(chǎn)食品、藥物應(yīng)用前景十分廣闊[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，烏拉爾甘草內(nèi)生真菌HGE5發(fā)酵液中含有甘草主要活性成分甘草苷，該化合物結(jié)構(gòu)類型為黃酮類化合物[3]，具有明顯的抗過敏、抗氧化[4]、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、降血糖[5]等藥理活性，是食品、醫(yī)藥重要的生產(chǎn)原料。筆者選取12種受試致病菌，測定內(nèi)生真菌HGE5的抑制活性，并采用形態(tài)特征觀察法及rDNA ITS 序列同源性分析對內(nèi)生真菌HGE5進(jìn)行鑒定，利用HPLC法對HGE5發(fā)酵液進(jìn)行分析，系統(tǒng)地研究甘草內(nèi)生真菌HGE5及其活性代謝產(chǎn)物，為深入開發(fā)利用該菌株提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)

1.1.1供試菌。內(nèi)生真菌HGE5是分離自野生烏拉爾甘草根部（采集地是黑龍江省帽兒山地區(qū)）。

1.1.2受試致病菌。A：大腸桿菌（Escherichia coli）；B：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；C：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；D：短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；E：銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）；F：單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）；G：肺炎克雷伯菌（Klebsiella penumoniae）；H：鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）；I：釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）；J：屎腸球菌（Enterococcus faecium）；K：糞腸球菌（Enterococcus facalis）；L：白假絲酵母（Candida albicans）。以上12株菌株購于黑龍江省微生物研究所，現(xiàn)保存于黑龍江大學(xué)生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3PDA培養(yǎng)基。配方組成及配制方法見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2儀器與試劑FL2200高效液相色譜儀（產(chǎn)地是浙江溫嶺）。真菌基因組 DNA快速抽提試劑盒及真菌 ITS 區(qū)擴(kuò)增通用引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）。乙腈為色譜純級別，其他試劑均為分析純。

1.3內(nèi)生真菌HGE5抑菌活性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7]采用濾紙片法進(jìn)行抑菌活性測定。將已活化的HGE5單菌落接種于 PDA 液體培養(yǎng)基中，置于搖床，培養(yǎng)條件：28 ℃、140 r/min、7 d。取HGE5發(fā)酵液，50 ℃減壓蒸干，適量甲醇溶解后作為供試品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 mg/mL），以0.22 μm無菌濾器過濾后測定其抑菌活性（n=6）。

1.4內(nèi)生真菌HGE5的鑒定

1.4.1內(nèi)生真菌HGE5形態(tài)學(xué)鑒定。無菌條件下，挑取HGE5的菌絲轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基（平板）中間位置進(jìn)行培養(yǎng)（28 ℃，7 d），觀察形態(tài)特征（菌落大小、顏色、質(zhì)地等）；同時(shí)將活化后的HGE5菌種接種于PDA平板中培養(yǎng)（28 ℃，2 d），將滅菌蓋玻片傾斜插入PDA平板中，繼續(xù)培養(yǎng)（28 ℃，3 d），取出平板，小心鑷取蓋玻片，除去背面附著物，觀察HGE5菌株的孢子顯微特征（形態(tài)、結(jié)構(gòu)等），結(jié)合文獻(xiàn)[8]中的分類指標(biāo)，初步確定菌株的分類地位。

1.4.2內(nèi)生真菌HGE5 ITS序列擴(kuò)增及序列分析。ITS 區(qū)段的 PCR 擴(kuò)增采用通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL、dNTP（10 mmol/L）0.5 μL、引物各1 μL，補(bǔ)充去離子水至25 μL，模板 DNA 1 μL，用超純水定容至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性60 s→56 ℃退火60 s→72 ℃延伸 120 s→30個(gè)循環(huán)→72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物純化后直接測序（測序工作委托上海生工生物工程股份有限公司完成）。測序后，將序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，ITS 序列使用 ClustalX 1.83 和 MEGA 4.1以近鄰結(jié)合法（Neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap檢驗(yàn)值≥50%（1 000重復(fù)），確定目標(biāo)菌株的分類地位。

1.5HGE5發(fā)酵液中活性成分分析取“1.3”項(xiàng)下制備的HGE5菌株發(fā)酵液，40 ℃真空減壓抽干后，加入1 mL無菌水溶解，再以 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，作為供試品溶液。采用HPLC法，分別精密吸取 0.5 mg/mL 的甘草苷對照品溶液及供試品溶液各 10 μL 注入HPLC儀器，HPLC檢測條件為：Venusil XBP-C18柱（柱4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流動(dòng)相為乙腈∶冰醋酸∶水（20.0∶0.5∶79.5）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為276 nm。

2結(jié)果與分析

2.1HGE5菌株發(fā)酵液抑菌活性用12種受試致病菌（分別代表G+、G-及真菌）對菌株HGE5發(fā)酵液進(jìn)行抑菌能力測定，結(jié)果表明（表1），甘草內(nèi)生真菌HGE5發(fā)酵液對8 種受試致病細(xì)菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用，對真菌白假絲酵母（Candida albicans）無抑制作用。

2.2內(nèi)生真菌HGE5的鑒定

2.2.1內(nèi)生真菌HGE5形態(tài)學(xué)鑒定。菌落白色，后中央變?yōu)樯罴t色，菌絲密集，氈狀，基質(zhì)深紅棕色（PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，圖1）；分生孢子梗單生或集成分生孢子座，細(xì)長或短粗，大型孢子多細(xì)胞，鐮刀形，小型孢子單細(xì)胞，卵圓形（圖2）。

2.2.2內(nèi)生真菌HGE5 ITS序列擴(kuò)增及序列分析。甘草內(nèi)生真菌HGE5 DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1條 500 bp的特異性條帶（圖3），將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性比對，然后用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），內(nèi)生真菌HGE5 ITS序列（登錄號：KF022041）與鐮孢霉屬菌Fusarium oxysporum GU565671.1的序列的同源性最高，相似性為97%。綜合菌體形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定甘草內(nèi)生真菌HGE5為鐮孢霉屬菌（Fusarium oxysporum）。

發(fā)酵液中活性成分分析經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，甘草內(nèi)生真菌HGE5發(fā)酵液中疑似含有甘草苷，在“1.5”項(xiàng)色譜條件下，供試品色譜中，在與甘草苷對照品相同保留時(shí)間位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)（圖5），而在PDA空白培養(yǎng)基色譜圖中未見該保留時(shí)間位置有任何色譜峰出現(xiàn)（圖6a），且該色譜峰經(jīng)過對照品加入法得到了較好的確認(rèn)（圖6b），從而排除了該色譜峰為PDA空白培養(yǎng)基中成分的可能性，說明該色譜峰為HGE5發(fā)酵液中特有成分——甘草苷。

3結(jié)論

以甘草內(nèi)生真菌HGE5為研究對象，選取12株受試致病菌為指標(biāo)，觀察內(nèi)生真菌HGE5的抑菌活性，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌HGE5對8株受試細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌活性，是潛在的可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的內(nèi)生菌；菌株HGE5經(jīng)形態(tài)學(xué)特征鑒定及rDNA ITS序列分析結(jié)果，最終確定為鐮孢霉屬菌（Fusarium oxysporum）。

該研究首次從甘草內(nèi)生真菌HGE5發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)甘草苷成分，說明內(nèi)生真菌HGE5是甘草苷產(chǎn)生菌，甘草苷是食品、藥品、化妝品重要的生產(chǎn)原料。目前，甘草苷的生產(chǎn)方法從甘草生藥中提取，若將內(nèi)生真菌HGE5作為出發(fā)菌株，從其發(fā)酵液中提取分離甘草苷成分，并確定可行的提取工藝，可為開發(fā)甘草苷活性成分的生產(chǎn)提供新方法、新資源。關(guān)于HGE5發(fā)酵液中活性成分的系統(tǒng)提取、分離鑒定工作還在進(jìn)一步研究中。

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