高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在葡萄汁酸面團(tuán)面包中的應(yīng)用

錢 超

楊文丹1

張賓樂1

莊 靚1

徐 巖2

黃衛(wèi)寧1

李 寧3

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；4. 焙樂道食品集團(tuán)，比利時(shí) 布魯塞爾 1201)

高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在葡萄汁酸面團(tuán)面包中的應(yīng)用

錢 超1

楊文丹1

張賓樂1

莊 靚1

徐 巖2

黃衛(wèi)寧1

李 寧3

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；4. 焙樂道食品集團(tuán)，比利時(shí) 布魯塞爾 1201)

從4種酒曲中分離篩選乳酸菌，并通過七葉苷平板顯色法結(jié)合酶活測(cè)定篩選出3株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。通過16S rDNA基因鑒定其種屬，研究了3株菌粗酶液的最適溫度、pH，并對(duì)酶進(jìn)行定位。應(yīng)用高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌發(fā)酵葡萄汁酸面團(tuán)制作面包，通過固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC—MS)分析了面包香氣成分，并進(jìn)行了感官評(píng)定。結(jié)果表明：酒曲中一共篩得124株乳酸菌，其中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌有28株，產(chǎn)酶能力最高的3株乳酸菌經(jīng)鑒定為哈爾濱乳桿菌(Lactobacillusharbinensis，M12和M24)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，J28)。用M12發(fā)酵葡萄汁酸面團(tuán)制作面包(RSB)，RSB中一共檢測(cè)出52種風(fēng)味物質(zhì)，較普通酵母面包(CYB)的風(fēng)味物質(zhì)種類增加了52.9%，而風(fēng)味物質(zhì)總峰面積也提高了65.5%。經(jīng)過感官評(píng)定，RSB的整體接受度優(yōu)于普通酵母面包(CYB)及含未發(fā)酵葡萄汁的酵母面包(RYB)。

β-葡萄糖苷酶；酸面團(tuán)；面包；風(fēng)味；乳酸菌

面包風(fēng)味包括香氣、滋味和質(zhì)地等，與原料、發(fā)酵、酶反應(yīng)和熱反應(yīng)多種因素有關(guān)，其中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響消費(fèi)者購(gòu)買意圖的重要依據(jù)。目前主要通過添加合成香精、天然香料和具有濃厚香氣的原料來提高面包風(fēng)味[1]。但普遍存在安全隱患、留香差、成本高以及不夠健康等缺陷。尋求更加安全、有效和健康的方法改善面包風(fēng)味成為了研究者們的研究熱點(diǎn)。

將水果或果干通過發(fā)酵得到的發(fā)酵液添加到面包中去，制得具有水果風(fēng)味和發(fā)酵香氣的發(fā)酵水果面包，可以很明顯地改善面包風(fēng)味[2]38[3]47。

葡萄含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，已有研究[2]38[3]47通過將葡萄接種產(chǎn)香酵母發(fā)酵的發(fā)酵液制作面包獲得天然發(fā)酵風(fēng)味面包，但是其并沒有充分發(fā)揮葡萄本身的風(fēng)味。葡萄本身含有種類豐富的品種香，主要是萜烯類物質(zhì)[4]，而這些萜烯類物質(zhì)大部分以不揮發(fā)的糖苷形式存在。β-葡萄糖苷酶是一類水解葡萄糖苷鍵的酶，它可以水解葡萄中的糖苷類物質(zhì)，使與之結(jié)合的萜烯等風(fēng)味物質(zhì)成為可揮發(fā)性的游離態(tài)。所以在葡萄酒研究中，研究者[5-6]們通過篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株來提高葡萄酒的風(fēng)味。

目前中國(guó)對(duì)β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在高產(chǎn)黑曲霉菌等菌種的篩選，酶的固定化應(yīng)用，及其在葡萄酒發(fā)酵過程中的增香作用[7-8]，對(duì)將其應(yīng)用在發(fā)酵葡萄汁酸面團(tuán)的報(bào)道還沒有。故本研究旨在分離篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌發(fā)酵葡萄汁酸面團(tuán)制作面包，以期充分發(fā)揮葡萄本身的果香，提高面包的風(fēng)味，將為β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲：多地酒廠收集；

對(duì)硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖(p-NPG)、對(duì)硝基苯酚(pNP)、七葉苷：杭州百思生物科技公司；

細(xì)菌提取試劑盒：天根生化科技有限公司；

引物1492R(5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)和27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)：上海桑尼生物科技有限公司；

面包粉：中糧面業(yè)(秦皇島)鵬泰面粉有限公司；

干酵母：安琪酵母股份有限公司；

黃油：中糧食品營(yíng)銷有限公司；

白砂糖、食鹽、玫瑰香葡萄干：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈臺(tái)：SW-CJ-2F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH.S2I-4型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

離心機(jī)：H1650-W型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：BSC-250型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

電子顯微鏡：XSP-10C型，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；

電子天平：JE2002型，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

PCR儀：PC300型，艾本德(中國(guó))有限司；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒儀器(上海)有限公司；

攪拌機(jī)：SM-25型，新麥機(jī)械(無錫)有限公司；

醒發(fā)箱：SPC-40SP型，新麥機(jī)械(無錫)有限公司；

烤箱：SM-523型，新麥機(jī)械(無錫)有限公司；

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀： TSQ Quantum XLS型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

固相微萃取裝置(萃取頭)：CAR/PDMS型，美國(guó) Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的分離

(1) MRS篩選培養(yǎng)基的配制：稱取蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，磷酸氫二鉀 2.0 g，乙酸鈉 5.0 g，吐溫-80 1.0 mL，七水硫酸鎂 0.5 g，四水硫酸錳 0.25 g，加入去離子水至1 L，調(diào)pH至6.2～6.4；再稱取20 g 碳酸鈣加入到100 mL蒸餾水中，制成碳酸鈣乳濁液；將MRS培養(yǎng)基和碳酸鈣乳濁液分開于121 ℃滅菌15 min；倒平板前，待培養(yǎng)基融化冷卻后，平板上加入一定量的碳酸鈣乳濁液，晾干了以后再接種。

(2) 酒曲中乳酸菌的分離：稱取10 g酒曲，溶于90 mL生理鹽水中，置于磁力攪拌器上混勻30 min后，取1 mL梯度稀釋；吸取10-5，10-6，10-7梯度的稀釋液各100 μL在MRS篩選平板上進(jìn)行涂布，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h[9-10]。挑取菌落旁出現(xiàn)透明溶解圈的菌落接到MRS液體培養(yǎng)基中，再經(jīng)過數(shù)次劃線分離和鏡檢，得到純化的乳酸菌。傳代并加30%甘油保護(hù)劑，保存于-80 ℃超低溫冰箱中，做后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的篩選

(1) 初篩：根據(jù)趙林果等[11-12]的方法，采用96孔板法進(jìn)行篩選。在MRS液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的七葉苷和0.05%的檸檬酸鐵，加上1.8%的瓊脂。121 ℃下滅菌15 min。之后在96孔板中每個(gè)孔中加入250 μL的培養(yǎng)基。將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的乳酸菌在室溫下解凍，以2 mL/100 mL接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，傳代2次，恢復(fù)菌株活力。然后取活化后的乳酸菌15 μL接種到96孔板上，每株菌做2個(gè)平行。

(2) 復(fù)篩：取5 mL在液體培養(yǎng)基中活化24 h后的乳酸菌，在4 ℃下5 000 r/min離心10 min，取離心沉淀用生理鹽水溶液洗滌2次后，加入1 mL生理鹽水，混勻稀釋作為粗酶液。取100 μL粗酶液加入1.8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液在37 ℃下水浴5 min，然后加入100 μL底物p-NPG(20 mmol/L)，空白組改用100 μL緩沖液替代粗酶液。反應(yīng)10 min之后加入1 mol/L的Na2CO3溶液1 mL終止反應(yīng)。400 nm下測(cè)量其紫外吸收[13]。酶單位(U)[14]則定義為以上條件下，每分鐘催化生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量即為1個(gè)酶活力單位。菌干重測(cè)定：取15 mL生長(zhǎng)24 h的菌液在4 ℃下5 000 r/min離心10 min得菌體，放入110 ℃干燥箱中烘干至恒重，稱重。

(3) pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取pNP 139.0 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL，分別吸取 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL于100 mL容量瓶中，用 1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻。稀釋后的pNP終濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mmol/mL，以蒸餾水作為空白，用分光光度計(jì)于400 nm處測(cè)其紫外吸收。以pNP濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的鑒定 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明，提取待鑒定菌株的DNA，并將其作為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。待鑒定菌株的16S rDNA基因擴(kuò)增體系見表1[15]。

表1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌16S rDNA 的PCR擴(kuò)增體系

Table 1 PCR amplification system for 16S rDNA of high producingβ-glucosidase lactic acid bacteria

試劑種類添加量/μLdNTPsMIX(2.5mmol/L)4.010×Buffer(+Mg2+)5.0EasyTaqDNA酶(5U/μL)2.027F(10pmol/μL)1.51495R(10pmol/μL)1.5DNA模板(100ng/μL)2.0加ddH2O至反應(yīng)體系總體積50.0

根據(jù)表1列出的PCR擴(kuò)增體系，進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性5 min后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)：94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min。最后72 ℃終延伸 7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、凝膠成像儀拍照確認(rèn)條帶后，將產(chǎn)物送往上海桑尼公司進(jìn)行測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果所得擴(kuò)增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，以確定菌株的種屬[16]。下載相應(yīng)的模式菌株，通過MEGA軟件和Neighbor-Joinning方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 乳酸菌中β-葡萄糖苷酶的定位 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期菌液各取1 mL，在4 ℃下5 000 r/min離心10 min得到菌體和菌液上清，菌液上清直接進(jìn)行酶活測(cè)定，菌體用生理鹽水洗滌2遍，添加1 mL生理鹽水懸浮后再進(jìn)行酶活性測(cè)定。

再取10 mL菌液，同樣處理后得菌體，菌體洗滌2次后加入10 mL PBS(NaCl 140 mmol/L；KCl 2.7 mmol/L；KH2PO41.8 mmol/L；Na2HPO410 mmol/L；pH 7.4)懸浮。再在冰浴條件下，將菌體懸浮液用超聲細(xì)胞破碎機(jī)破碎20 min(450 W，間隔5 s)。其中1 mL破碎液直接進(jìn)行酶活測(cè)定，再取1 mL破碎液在4 ℃下10 000 r/min離心10 min得到菌體破碎液上清和細(xì)胞碎片。細(xì)胞碎片用生理鹽水洗滌2次，再添加0.5 mL生理鹽水，進(jìn)行懸浮后測(cè)定酶活，菌體破碎液上清同樣直接進(jìn)行酶活性測(cè)定[17]。

1.3.5 粗酶液的酶學(xué)性質(zhì) 分別取100 μL粗酶液，加入不同pH的1.8 mL的緩沖液按照1.3.2(2)的方法測(cè)酶活。

再分別取100 μL粗酶液，加入1.8 mL的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=4.5)后置于不同溫度下水浴5 min后，再加入100 μL底物p-NPG，在相應(yīng)溫度下反應(yīng)10 min，其余步驟同1.3.2(2)。

1.3.6 含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包的制作與風(fēng)味

(1) 含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包的制作：將高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)24 h后，取5 mL菌液以5 000 r/min離心10 min，沉淀用生理鹽水洗滌2次。然后接種至小麥粉∶水質(zhì)量比為1∶1的面團(tuán)中(用葡萄汁替代20%的水)，使接入菌的初始量為106CFU/g，然后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，即為含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)。對(duì)照組為普通酵母面包和含有葡萄汁酵母面包。3種面包的配方見表2。參照張思佳等[18]的制作方法并略作修改：將含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)和面粉以及其他配料混合加入攪面缸中攪打成形后，取出用保鮮膜覆蓋5 min，然后分割為每個(gè)面團(tuán)90 g，再次用保鮮膜覆蓋10 min后，成型，之后置于37 ℃的醒發(fā)箱中醒發(fā)90 min，最后置于烤箱中以上火170 ℃下火210 ℃焙烤23 min。取出后脫模，室溫冷卻2 h后做后續(xù)試驗(yàn)。

(2) 面包風(fēng)味分析：取5 g面包芯碎片加入樣品瓶中， 60 ℃下恒溫水浴，再將老化后的CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中萃取40 min。之后將萃取頭插入氣相色譜的高溫汽化室中進(jìn)樣并進(jìn)行GC—MS分析。

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱，載氣為He，保持1.2 mL/min速度恒流2 min后分流，速度為10 mL/min，分流比為12∶1。升溫程序?yàn)?0 ℃下，恒溫2 min后，以6 ℃/min 速度升至160 ℃，再以10 ℃/min升至240 ℃，之后保持10 min。

質(zhì)譜條件：進(jìn)樣孔溫度250 ℃，電子電離，電子能量為70 eV，發(fā)射電流為200 μA，離子源溫度200 ℃，采集方式為全掃描，質(zhì)量范圍m/z為33～495。結(jié)果利用GC—MS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行處理，化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，并與NSIT譜庫和RTLPEST譜庫相匹配，僅報(bào)道匹配度大于800的結(jié)果并采用峰面積歸一化法定量計(jì)算出各揮發(fā)性香氣成分在面包中的相對(duì)含量[19]。

表2 普通酵母面包(CYB)、含有葡萄汁的酵母面包(RYB)和含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包(RSB)配方Table 2 Formulations of wheat yeast bread, raisin yeast bread and raisin sourdough bread g

(3) 感官評(píng)價(jià)：20位經(jīng)過培訓(xùn)的人員(男女比例1∶1)組成感官評(píng)定小組，評(píng)定方法采用9分嗜好法，數(shù)字越大代表喜好程度越高，分別對(duì)面包的色澤、外觀等方面進(jìn)行評(píng)分。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS、Microsoft office和Origin等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。利用方差分析法(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，顯著差異水平取P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 酒曲中乳酸菌的分離

經(jīng)過乳酸菌篩選培養(yǎng)基的篩選，平板涂布，劃線分離和染色鏡檢，部分乳酸菌菌落形態(tài)見圖1，從4種酒曲中共分離出124株乳酸菌，其中承德酒曲(C)33株，梅蘭春酒曲(M)33株，酒鬼酒曲(J)28株，湯溝酒曲(T)30株。

圖1 部分乳酸菌的菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of lactic acid bacteria

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的分離篩選

2.2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的初篩β-葡萄糖苷酶可以將七葉苷(6,7-2-羥基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)分解為葡萄糖和七葉苷原(6,7-2-羥基-香豆素)，七葉苷原可以與Fe3+作用顯現(xiàn)出棕黑色。從96孔平板結(jié)果中，一共有28株乳酸菌顯棕黑色(見圖2)。除湯溝酒曲(T)外，其余酒曲中均有產(chǎn)酶的菌株，但數(shù)量差異較大，其中梅蘭春酒曲(M)中50%以上的乳酸菌都具有不同程度的酶活，而酒鬼酒曲(J)中則只有3株。這可能與酒曲制作原料中的微生物以及當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境微生物有關(guān)。將這28株菌傳代并加30%甘油保護(hù)劑，保存于-80 ℃超低溫冰箱中，做后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的復(fù)篩 對(duì)硝基苯酚與碳酸鈉試劑在堿性條件下顯色，通過測(cè)定其吸光值，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

由圖3可知，回歸方程為y=19.369x-0.077 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7，在pNP含量為0.010～0.060 mmol/L時(shí)，吸光度值與對(duì)硝基苯酚含量呈線性相關(guān)。

圖2 七葉苷平板的顯色反應(yīng)Figure 2 Eseulin plate colored method

圖3 對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 The standard curve of p-nitrophenol

由圖4可知，各個(gè)菌株間酶活差異較大，從2.2 U/g 到10.1 U/g，其中M12的酶活最高為10.1 U/g，M24、J28次之，酶活分別為7.3，6.8 U/g。最終將這3株作為高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌。

圖4 復(fù)篩菌株的酶活Figure 4 The enzyme activity of Secondary screening lactic acid bacteria

2.2.3 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的鑒定 3株乳酸菌的16S rDNA的測(cè)序結(jié)果見表3，其中，M12、M24與LactobacillusharbinensisFQ003的同源性都達(dá)到了99%。J28與PediococcuspentosaceusKID7的同源性達(dá)到了100%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5。

由圖5可知，M12和M24是同一種屬的哈爾濱乳桿菌，但在菌液中的形態(tài)有比較大的差異。酒曲中分離戊糖片球菌已有報(bào)道[10]，但鮮有從酒曲分離出哈爾濱乳桿菌的報(bào)道。

2.2.4 乳酸菌中β-葡萄糖苷酶的定位研究 由圖6可知，這3種菌均是完整細(xì)胞的酶活最高，除J28的上清有微弱酶活之外，其余兩株菌上清菌沒有酶活。超聲破碎之后，破碎液酶活都很高，推測(cè)這3株菌產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶均是胞內(nèi)酶；而細(xì)胞碎片主要是細(xì)胞壁碎片和細(xì)胞膜碎片以及部分可能未被破碎的菌體，推測(cè)該酶可能是結(jié)合在細(xì)胞壁上[20]，也有可能結(jié)合在原生質(zhì)體的細(xì)胞膜上，為膜結(jié)合酶[21]。

表3 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的16s rDNA 序列比對(duì)

Table 3 Blast result of 16S rDNA sequence of high produc-ingβ- glucosidase lactic acid bacteria

菌株編號(hào)序列比對(duì)結(jié)果序列號(hào)同源性/%M12哈爾濱乳桿菌(LactobacillusharbinensisFQ003)KF418816.199M24哈爾濱乳桿菌(LactobacillusharbinensisFQ003)KF418816.199J28戊糖片球菌(Pediococcuspen-tosaceusKID7)KJ810576.1100

圖5 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌的 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequ-ence of high producingβ-glucosidase

圖6 β-葡萄糖苷酶的定位Figure 6 β-glucosidase activity of different fractions in strains

2.2.5 粗酶液的酶學(xué)性質(zhì) 3種菌的粗酶液最適pH略有不同，M12的最適pH為4.5，而M24與J28在pH為4.0時(shí)酶活最高，見圖7。這與相關(guān)報(bào)道一致，即β-葡萄糖苷酶的最適pH在4～6[22-23]。

最適溫度方面M12與M24的最適溫度均為37 ℃，而J28的最適溫度在44 ℃，見圖8。文獻(xiàn)中不同菌株的最適溫度差異較大，李曉東等[22]發(fā)現(xiàn)的一株黑曲霉的β-葡萄糖苷酶最適溫度為70 ℃，萬振堂等[24]篩選出的一株乳酸菌的β-葡萄糖苷酶最適溫度為37 ℃，張敏等[25]篩選出的一株酵母菌的最適溫度為30 ℃。故選取最適合溫度和pH均適合發(fā)酵酸面團(tuán)的M12做后續(xù)酸面團(tuán)發(fā)酵試驗(yàn)。

圖7 粗酶液的最適pHFigure 7 The activity of crude enzyme in different pH

圖8 粗酶液的最適溫度Figure 8 The activity of crude enzyme in different temperatures

2.3 含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包的風(fēng)味研究

由表4、5可知，3種面包的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量各有不同。普通酵母面包共檢測(cè)出34種風(fēng)味化合物，含有葡萄汁的酵母面包中檢測(cè)出了35種風(fēng)味物質(zhì)，雖然種類相差不大，但總峰面積提高了34.4%；含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包中一共檢測(cè)出52種風(fēng)味物質(zhì)，較普通酵母面包風(fēng)味物質(zhì)種類提高了52.9%，而風(fēng)味物質(zhì)總峰面積提高了65.5%。由此可見，添加葡萄汁和含有葡萄汁發(fā)酵酸面團(tuán)均會(huì)提高面包的風(fēng)味。

3種面包的風(fēng)味物質(zhì)主要包括醇類、酸類、烷烴類、芳香類和脂類等，萜烯類物質(zhì)則是葡萄汁的引入帶來的特殊風(fēng)味物質(zhì)。

醇類物質(zhì)在3種面包中含量都是最高的，雖然醇類物質(zhì)閾值相對(duì)較高，但因其在風(fēng)味中所占的比例也是最大，所以是影響面包風(fēng)味的一類重要的物質(zhì)[26]。由表5可知，3種面包的醇類物質(zhì)的種類并沒有顯著差異，而含量差異顯著，其中含有葡萄汁的酵母面包的醇類含量提高了35.7%，發(fā)酵葡萄酸面團(tuán)面包的醇類含量提高了30.2%。乙醇和異戊醇含量最高，乙醇和異戊醇是酵母發(fā)酵產(chǎn)生，含量提高可能是由酵母的活力提高引起的。

酸類物質(zhì)是酸面團(tuán)發(fā)酵面包產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味的重要原因。與CYB相比，RYB的酸類物質(zhì)種類不但沒有增加，反而減少了。但是在含量上增加了26.2%。而RSB的酸類物質(zhì)種類上增加了5種，而總體含量也提高了169.5%。這與張慶等[27]的結(jié)論相似。

芳香類化合物在面包中所占的比重也較大，其中含量比較高的苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，苯乙醛具有水果的香氣。與CYB相比，RYB的芳香類物質(zhì)含量提高51.2%，而RSB則比CYB和RYB分別提高了196.9%和96.4%。由此可見，葡萄汁和酸面團(tuán)的引入都提高了面包中芳香類化合物的含量。

萜烯類化合物在面包中的含量雖然不高，但是其閾值較低，是RSB風(fēng)味組成的重要部分。葡萄汁的添加使PYB中出現(xiàn)了萜烯類的物質(zhì)，但是含量很低，添加了M12發(fā)酵的酸面團(tuán)之后，萜烯含量提升明顯。由此可以推斷出，高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌對(duì)面包的萜烯類風(fēng)味物質(zhì)有明顯的提升作用。其中含量最高的8-羥基芳樟醇帶有濃青帶甜的木青氣息，脫氫橙花醇具有令人愉快的玫瑰和橙花的香氣，β-石竹烯醇具有辛香、木香和柑橘香。

2.4 面包感官分析

由圖9可知，含有葡萄汁的酸面團(tuán)制作的面包在外觀、風(fēng)味和口感等方面均優(yōu)于普通酵母面包和含有葡萄汁的酵母面包。外觀方面，CYB的得分較低，可能是比容較小引起的。RSB和RYB沒有顯著性差異。色澤方面，RYB要比RSB和CYB低，表現(xiàn)為RYB要更加偏褐色，推測(cè)原因是添加了葡萄汁，而葡萄汁中有較多的葡萄糖和果糖，導(dǎo)致面包在烘焙過程中，美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)加劇引起的。而RSB中經(jīng)過酸面團(tuán)發(fā)酵之后，葡萄糖等已經(jīng)被乳酸菌消耗，所以色澤與CYB組相差不大。口感方面，根據(jù)測(cè)試者描述，RYB和RSB在口感上還能吃出一些CYB中沒有的口味，RSB中有略微的酸味影響了其評(píng)分但也在可接受范圍內(nèi)。風(fēng)味方面，優(yōu)劣程度排序?yàn)镽SB>RYB>CYB。根據(jù)測(cè)試者描述，CYB風(fēng)味較為一般， RYB和RSB風(fēng)味上要更加豐富一點(diǎn)，其中RSB中能聞出一些淡清香與果香，整體風(fēng)味更加濃郁。整體可接受度方面，優(yōu)劣排列順序?yàn)镽SB>RYB>CYB。表明只添加葡萄汁的面包與普通酵母面包相比，外觀、口感和風(fēng)味等方面均有優(yōu)勢(shì)，色澤評(píng)分較普通酵母面包低，而添加含有乳酸菌發(fā)酵的酸面團(tuán)除色澤與空白酵母面包評(píng)分相同外，其余各項(xiàng)評(píng)分均有較大提高，與只添加葡萄汁的酵母面包相比，口感因?yàn)槁杂兴嵛秾?dǎo)致評(píng)分有所降低外，其他方面都有明顯的提高。整體接受度上，含有葡萄汁的酸面團(tuán)面包要高于其他兩組面包。

表4 普通酵母面包、含有葡萄汁的酵母面包和含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包的GC—MS結(jié)果Table 4 The GC—MS analysis of wheat yeast bread, raisin yeast bread and raisin sourdough bread

表5 普通酵母面包、含有葡萄汁的酵母面包和含有葡萄汁的發(fā)酵酸面團(tuán)面包的風(fēng)味物質(zhì)統(tǒng)計(jì)Table 5 The statistics of aroma compounds in wheat yeast bread, raisin yeast bread and raisin sourdough bread

圖9 3種面包的感官評(píng)價(jià)Figure 9 Sensory characteristics of three kinds of bread

3 結(jié)論

本研究從酒曲中篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，探究了該乳酸菌產(chǎn)酶活位置和最適條件，并將其運(yùn)用至含有葡萄汁基質(zhì)的酸面團(tuán)中，制作水果酸面團(tuán)面包。結(jié)果表明，添加高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌發(fā)酵的葡萄汁酸面團(tuán)能夠明顯改善面包風(fēng)味，制得的面包較普通酵母面包有更多的萜烯類風(fēng)味物質(zhì)，能夠帶給消費(fèi)者更愉悅的感官體驗(yàn)，整體可接受度更高。若能夠?qū)⒐に嚄l件進(jìn)一步優(yōu)化，將有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

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Application of high producingβ-glucosidase lactic acid bacteria in raisin sourdough bread

QIANChao1

YANGWen-dan1

ZHANGBin-le1

ZHUANGJin1

XUYan2

HUANGWei-ning1

LINing3FilipArnaut4FILIPArnaut4

(1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyofMinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 3.GuangzhouPuratosFoodCo.Ltd.,Guangzhou,Guangdong511400,China; 4.PuratosGroupNV/SA,Brussels, 1201,Belgium)

Three high producingβ-glucosidase lactic acid bacteria strains were isolated and screened from Qu by eseulin plate colored method combining enzyme activity test, then identified by 16S rDNA. The screened bacteria with highest enzyme activity was used in raisin sourdough fermentation and bread making. After that, the aroma of the bread was analyzed by GC-MS as well as sensory evaluation. The results showed that among the 125 isolated lactic acid bacteria, there were 28 strains which produceβ-glucosidase. Three strains showed high enzyme-producing ability, they were identified asLactobacillusharbinensis(M12, M24) andPediococcuspentosaceus(J28). M12, which appeared the highest activity was used in raisin sourdough fermentation and bread making. Compared with the common yeast bread, the number and the peak area of the aroma compounds in raisin sourdough bread increased by 52.9% and 65.5%. Besides, raisin sourdough bread is more acceptable than common yeast bread and raisin yeast bread in sensory evaluation.

β-glucosidase; sourdough; bread; flavor; lactic acid bacteria

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31071595，31571877)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2012AA022207C)；比利時(shí)國(guó)際合作項(xiàng)目(編號(hào)：BE110021000)

錢超，男，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

黃衛(wèi)寧(1963—)，男，江南大學(xué)教授，博士。 E-mail:wnhuang@jiangnan.edu.cn

2017—03—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.003