纈草總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

吳德智

鄭 強1

李 安1

王宇宇1

吳地堯2

(1. 貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

纈草總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

吳德智1

鄭 強1

李 安1

王宇宇1

吳地堯2

(1. 貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

以纈草為原料，纈草總黃酮得率為指標，采用超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系對纈草總黃酮提取工藝進行單因素及Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化，并與回流提取所得的總黃酮的還原力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力進行抗氧化能力比較。結(jié)果表明：纈草總黃酮超聲輔助雙水相提取的最佳工藝條件為超聲時間35 min、硫酸銨用量0.20 g/mL、超聲溫度51 ℃、液料比為24∶1 (mL/g)，在該條件下總黃酮提取率為(6.37±0.08)%。兩種提取方法所得的纈草總黃酮對DPPH自由基、羥自由基有較強的清除能力和較高的還原力，且超聲輔助雙水相提取的纈草總黃酮抗氧化能力顯著高于一般回流提取。

纈草；總黃酮；超聲波；雙水相；抗氧化

纈草(ValerianaofficinalisL.)為敗醬科纈草屬多年生草本植物，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥以及調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)和抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[1]。纈草含有黃酮類、揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類、生物堿類等活性成分，其中黃酮類成分為其主要活性成分，具有改善微循環(huán)、抗腫瘤和抗菌等生理活性[2-3]。近年來“綠色化學(xué)”“環(huán)境友好型”提取工藝備受青睞[4]。超聲輔助提取是利用超聲波技術(shù)強化提取分離過程，是一種高效、節(jié)能、環(huán)保的提取方式，能有效縮短提取時間，提高產(chǎn)品得率，還可以減少化學(xué)與物理危害，提高產(chǎn)品質(zhì)量[5]。雙水相提取是基于乙醇、異丙醇等有機物與無機鹽形成的新型雙水相體系，根據(jù)被分離物質(zhì)在不同相中分配系數(shù)的不同實現(xiàn)分離[6-7]。醇-鹽雙水相體系因成本低，有利于醇類的回收且具有良好的分離性能，已經(jīng)被廣泛用于提取分離天然小分子化合物[8-9]。目前纈草總黃酮的提取主要有溶劑提取、超聲提取、微波提取、超臨界流體萃取等，基于超聲的雙水相提取纈草總黃酮未見報道。因此本試驗擬以纈草總黃酮提取率為指標，通過單因素及Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化超聲輔助雙水相提取工藝條件，采用還原力、DPPH自由基、羥自由基清除能力與傳統(tǒng)回流提取的總黃酮抗氧化性進行比較，旨在為纈草黃酮的藥用、食用及日化產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

纈草葉：采自貴州羅甸纈草種植基地。

1.1.2 試劑

無水乙醇、硫酸銨、鐵氰化鉀、無水碳酸鈉等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

蘆丁標準品：純度≥98%，西安匯林生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

數(shù)控超聲清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子天平：FA1004型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海上天精密儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV-2550型，梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雙水相體系的確定及超聲輔助雙水相提取纈草總黃酮的工藝 準確稱取一定量纈草葉，60 ℃干燥后粉碎裝入三角燒瓶中，按試驗要求加入適宜的乙醇-硫酸銨雙水相體系溶液，在超聲條件下提取纈草總黃酮。浸提后以3 000 r/min冷凍高速離心20 min。取上清液于60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，所得濃縮液真空冷凍干燥，得纈草總黃酮提取物。前期預(yù)試驗可知，當乙醇體積分數(shù)為40%時，硫酸銨用量在0.2～0.6 g/mL 能形成較穩(wěn)定的雙水相體系。因此本試驗固定乙醇體積分數(shù)為40%進行其他工藝參數(shù)的考察。

一般回流提取法對纈草總黃酮進行提取。稱取干燥粉碎后的樣品適量，加8倍量60%乙醇，提取2次，每次提取1.5 h，取上清液于60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，所得濃縮液真空冷凍干燥，得纈草總黃酮回流提取物。

1.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品，40%乙醇配制得130.0 mg/L的蘆丁儲備液。準確移取儲備液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入40%乙醇4.0 mL，靜置5 min后加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min后，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min，最后加入4% 氫氧化鈉溶液3 mL，乙醇定容至10 mL。充分搖勻，靜置15 min后，510 nm下測定吸光度，同時以空白試劑作參比。吸光度Y為縱坐標，濃度X為橫坐標(mg/L)，得標準回歸方程Y=0.112 4X-0.001 2，R2=0.999 3。

1.2.3 單因素考察超聲提取工藝

(1) 超聲時間的選擇：固定硫酸銨用量0.4 g/mL，超聲溫度45 ℃，液料比30∶1 (mL/g)，分別考察超聲時間為10，20，30，40，50 min時的纈草總黃酮提取率。

(2) 硫酸銨用量的選擇：固定超聲時間30 min，超聲溫度45 ℃，液料比30∶1 (mL/g)，分別考察硫酸銨用量為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 g/mL時的纈草總黃酮提取率。

(3) 提取時間的選擇：固定超聲時間30 min，硫酸銨用量0.4 g/mL，液料比30∶1 (mL/g)，分別考察超聲溫度為15，30，45，60，75 ℃時的纈草總黃酮提取率。

(4) 液料比的選擇：固定超聲時間30 min，硫酸銨用量0.4 g/mL，超聲溫度45 ℃，分別考察液料比為20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1 (mL/g)時的纈草總黃酮提取率。

1.2.4 總提取率的測定 參照文獻[10～11]，纈草總黃酮提取率按式(1)計算：

(1)

式中：

c——纈草總黃酮提取率，%；

m1——螯合態(tài)鈣元素含量提取的總黃酮量，g；

m2——反應(yīng)體系中鈣元素含量纈草總質(zhì)量，g。

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選纈草總黃酮提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取超聲時間、硫酸銨用量、超聲溫度、液料比4個對纈草總黃酮提取率影響較大的因素，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗，以纈草總黃酮提取率為指標優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.2.6 DPPH自由基清除能力測定 參照Kim等[12]的方法對纈草總黃酮DPPH自由基清除能力進行測定。以無水乙醇為溶劑，以纈草總黃酮為溶質(zhì)配制成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL(以標準曲線計算結(jié)果計) 的溶液備用。精密吸取各濃度溶液300 μL，分別加入0.004% DPPH液2 mL，搖勻后，室溫下靜置20 min，在517 nm處測其吸光度(A1)。以不加樣品的DPPH 為空白對照(A0)。精確吸取上述各溶液300 μL，分別與2 mL無水乙醇混合均勻后，以無水乙醇為對照，在517 nm處測定吸光度(A2)。同法對回流提取得到的總黃酮以及VC溶液的DPPH自由基清除能力進行測定。DPPH自由基清除率按式(2)計算：

(2)

式中：

D——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白對照吸光度；

A2——加無水乙醇的吸光度；

A1——加DPPH溶液吸光度。

1.2.7 鐵氰化鉀還原法測定還原力 參照陳紅梅等[13]的方法進行纈草總黃酮還原能力進行測定。按1.2.6項方法配制不同濃度的纈草總黃酮樣品溶液，取1.5 mL樣品，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和六氰合鐵酸鉀溶液各1.5 mL，混勻后50 ℃恒溫20 min，快速冷卻后加入10% 三氯乙酸溶液1 mL， 于3 000 r/min 下離心10 min， 取上清液1 mL,再加入蒸餾水和0.1% 三氯化鐵溶液各1 mL，充分混勻靜置后，于 700 nm 處測定吸光度，以吸光度表示還原能力。同法對回流提取得到的總黃酮以及VC溶液的還原力進行測定。

1.2.8 羥自由基清除率 參照杜麗清等[14]的方法進行纈草總黃酮羥自由基清除能力進行測定。按1.2.6項方法配制不同濃度的總黃酮樣品溶液，取1.5 mL樣品，分別加入2.5 mmol/L的水楊酸溶液、5 mmol/L的FeSO4溶液各1.0 mL和蒸餾水2.0 mL，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，再置于510 nm波長處測定其吸光度，以蒸餾水作空白參比。同法對回流提取得到的總黃酮羥自由基清除率進行測定。羥自由基清除率按式(3)計算：

(3)

式中：

H——羥自由基清除率，%；

A0——空白對照吸光度；

A2——加H2O2樣品溶液吸光度；

A1——不加H2O2樣品溶液吸光度。

1.2.9 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)測定3次平行、取平均值， 結(jié)果以平均值±標準偏差表示， 采用 Excel軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察纈草總黃酮超聲輔助提取工藝

2.1.1 超聲時間對纈草總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著超聲時間的增加，纈草總黃酮提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當超聲時間為30 min時，纈草總黃酮提取率為(6.12±0.12)%，繼續(xù)延長超聲時間，總黃酮提取率出現(xiàn)下降，當超聲50 min時，提取率為(5.88±0.18)%。這主要是由于超聲波使某些黃酮類成分發(fā)生氧化、降解或縮合等反應(yīng)而被破壞，使含量有所下降[15]。因此選定30 min為超聲時間所需的0水平范圍。

圖1 超聲時間對纈草總黃酮提取率的影響Figure 1 The effect of total flavonoids extraction rate on ultrasonic time

2.1.2 硫酸銨用量對纈草總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著硫酸銨用量的增加，纈草總黃酮提取率先穩(wěn)定在一定水平后出現(xiàn)下降的趨勢。當硫酸銨用量在0.2～0.4 g/mL時，提取率穩(wěn)定在(5.20±0.11)%左右，當繼續(xù)增加硫酸銨用量時總黃酮提取率出現(xiàn)下降，主要是由于硫酸銨用量增加會與乙醇爭奪體系中的水，使纈草總黃酮在乙醇相的含量減少，導(dǎo)致提取率下降。因此選定0.3 g/mL為響應(yīng)面設(shè)計硫酸銨用量的0水平。

2.1.3 超聲溫度纈草總黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲溫度的增加，纈草總黃酮提取率出現(xiàn)先增加后穩(wěn)定在一定水平再出現(xiàn)下降的趨勢。當超聲溫度在45～60 ℃時，提取率穩(wěn)定在(5.95±0.09)%左右，隨著超聲時間的延長總黃酮提取率出現(xiàn)下降，主要是因為溫度使沸點低或易分解的總黃酮被破壞或由體系中乙醇中纈草總黃酮部分分解、或乙醇相中總黃酮的分解程度大于硫酸銨相中總黃酮的分解程度所導(dǎo)致雙水相體系發(fā)生變化。因此選定45 ℃為響應(yīng)面設(shè)計超聲溫度所需的0水平。

圖2 硫酸銨用量對纈草總黃酮提取率的影響Figure 2 The effect of total flavonoids extraction rate on amount of ammonium sulfate

圖3 超聲溫度對纈草總黃酮提取率的影響Figure 3 The effect of total flavonoids extraction rate on ultrasonic temperature

2.1.4 液料比對纈草總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著液料比的增加，纈草總黃酮提取率呈現(xiàn)先上升后下降再穩(wěn)定的趨勢。當液料比超過25∶1 (mL/g)時，總黃酮提取率最高為(6.05±0.07)%左右。主要是因為提取液的增加可使纈草與提取溶劑充分接觸，有利于黃酮的浸出，當液料比超過25∶1 (mL/g)時，黃酮的提取基本達到飽和狀態(tài)。因此選定25∶1 (mL/g)為響應(yīng)面設(shè)計液料比的0水平。

圖4 液料比對纈草總黃酮提取率的影響Figure 4 The effect of total flavonoids extraction rate on liquid-to-solid ratio

2.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化纈草總黃酮微波輔助提取工藝

對纈草總黃酮微波輔助提取的工藝進行Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化試驗，響應(yīng)面試驗因子與水平表見表1，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗因子與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface methodology

表2 纈草總黃酮提取的Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

Table 2 Box-Behnken response surface methodology and results with total flavonoids ofValerianaofficinalisL. extraction parameters

序號ABCD總黃酮提取率/%100-1-15.582001-16.18300006.014-10014.9550-1106.376-10-104.76701016.11810-105.399010-16.0310100-15.611111005.7912-1-1005.031310106.3514-11005.2115-10105.241610015.981700006.091801106.31190-1015.982000005.972101-105.72220-1-105.77230-10-15.982400006.07251-1006.192600-115.822700006.122800116.2329-100-15.01

采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken試驗，對各因素進行擬合，得到多元回歸方程為：

R=-2.395 0+0.338 4A+0.160 0B+0.030 1C+0.116 2D-0.145 0AB+8.000 0×10-4AC+2.150 0×10-3AD-1.666 7×10-3BC+0.040 0BD-6.333 3×10-4CD-5.701 7×10-3A2+5.233 3B2-1.951 9×10-4C2-3.056 7×10-3D2。

(4)

由Design-Expert 8.0.6軟件得出纈草總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)是超聲時間35.09 min、硫酸銨用量0.20 g/mL、超聲溫度51.04 ℃、液料比為23.79∶1 (mL/g)，總黃酮提取率的預(yù)測值為6.37%。為便于生產(chǎn)試驗需求，定為超聲時間35 min、硫酸銨用量0.20 g/mL、超聲溫度51 ℃、液料比為24∶1 (mL/g)，進一步驗證實驗,得出的總黃酮提取率為(6.37±0.08)%。該值與預(yù)測值比較近，因此選取此為超聲輔助雙水相體系提取纈草總黃酮的工藝參數(shù)。

表3 試驗結(jié)果方差分析Table 3 Square and significant analysis of regression equation

圖5 不同提取條件之間的交互作用對提取率相互影響的3D效應(yīng)面圖譜分析Figure 5 3D response surface figures for effects of extration yield on essential oil of Valeriana officinalis L. on different extraction parameters

2.3 不同工藝提取的纈草總黃酮抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH 自由基清除能力測定結(jié)果 由圖6可知，回流提取與超聲雙水相提取得到的纈草總黃酮對DPPH 自由基均有較強的清除能力，纈草總黃酮的濃度與DPPH自由基清除率存在正相關(guān)關(guān)系。超聲雙水相提取的清除能力顯著高于一般回流提取(P<0.05)。當濃度為0.5 mg/mL時，超聲雙水相提的DPPH自由基清除率為(80.80±0.21)%，而回流提取的為(72.90±0.18)%。

2.3.2 還原力測定結(jié)果 吸光度與樣品的還原力具有正相關(guān)關(guān)系，吸光度越大，樣品的還原力越強。由圖7可知，回流提取與超聲雙水相得到的纈草總黃酮均具有較強的還原能力。在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，纈草總黃酮的還原力隨著濃度的升高而增強，且超聲雙水相提取的纈草總黃酮還原力顯著高于一般回流提取(P<0.05)。當濃度為0.5 mg/mL時，超聲雙水相提取的吸光度為1.38±0.07，而回流提取的為1.12±0.05。

圖6 提取方法對DPPH自由基清除率的影響

Figure 6 The effect of DPPH radical scavenging activity on different extraction method (n=3)

圖7 提取方法對還原力的影響Figure 7 The effect of reducing poweron on different extraction method (n=3)

2.3.3 羥自由基清除率 由圖8可知， 回流提取與超聲雙水相提取得到的纈草總黃酮對羥自由基均有較強的清除能力，隨著總黃酮濃度的增加清除率也隨之提高。超聲雙水相提取的清除能力顯著高于一般回流提取(P<0.05)。當濃度為0.5 mg/mL時，超聲雙水相提取的的清除率為(81.90±0.16)%，而回流提取的為(72.30±0.23)%。

3 結(jié)論

本試驗以纈草為主要原料采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計對其總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝條件進行優(yōu)化，并比較該法與傳統(tǒng)回流提取所得的總黃酮進行抗氧化能力比較。結(jié)果表明超聲輔助雙水相提取纈草總黃酮的最佳工藝條件為超聲時間35 min、硫酸銨用量0.20 g/mL、超聲溫度51 ℃、液料比為24∶1 (mL/g)，在此條件下總黃酮提取率為(6.37±0.08)%。對DPPH自由基、羥自由基有較強的清除能力以及較高的還原力，且超聲雙水相提取的纈草總黃酮抗氧化能力顯著高于一般回流提取。超聲雙水相提取纈草黃酮工藝穩(wěn)定可行，所得總黃酮有較好的抗氧化能力，可為纈草資源的開發(fā)提供參考。

圖8 提取方法對DPPH自由基清除率的影響Figure 8 The effect of hydroxyl radical scavenging activity on different extraction method (n=3)

[1] 盧忠英, 陳仕學(xué), 李彥青. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化纈草中黃酮類化合物的提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(5): 196-200.

[2] 黃寶康, 鄭漢臣, 秦路平, 等. 國產(chǎn)纈草屬藥用植物資源調(diào)查[J]. 中藥材, 2004, 27(9): 632-634.

[3] 左月明, 張忠立, 曾金祥, 等. 纈草的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 2012, 43(7): 1 293-1 295.

[4] TABARAKI R, NATEGHI A. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of natural antioxidants from rice bran using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2011, 18(6): 1 279-1 286.

[5] KARAKATSANIS A, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES M. Comparison of PEG/fractionated dextran and PEG/industrial gradedex-tran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis ofstarch[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 80(4): 1 213-1 217.

[6] TENG Hui, CHOI Y H. Optimization of ultrasonic-assisted extraction ofbioactive alkaloid compounds from rhizoma coptidis using response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2014, 142(1): 299-305.

[7] SHEN Shu-feng, CHANG Zhi-dong, LIU Ji, et al. Separation of glycyrrhizic acid and liquiritin from Glycyrrhiza uralensis Fisch extract by three-liquid phase extraction systems[J]. Separation and Purification Technology, 2007, 53(3): 216-223.

[8] 江詠, 李曉璽, 李琳, 等. 雙水相萃取技術(shù)的研究進展及應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技, 2007, 28(10): 235-238.

[9] 林金清, 董軍芳, 李夏蘭. 乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取甘草酸鉀的研究[J]. 精細化工, 2004, 21(3): 165-173.

[10] 龐敏, 王遠輝, 劉茜. 超聲—微波協(xié)同輔助提取辣椒總堿的工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2016, 32(12): 175-178, 188.

[11] 齊娜, 李涵, 張志宇, 等. 新疆紅肉蘋果多酚的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2016, 32(9): 177-182.

[12] KIM D, LEE K W, LEE H J, et al. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50 (13): 3 713-3 717.

[13] 陳紅梅, 謝翎. 響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 45-50.

[14] 杜麗清, 帥希祥, 涂行浩, 等. 水劑法提取澳洲堅果油的化學(xué)成分及其抗氧化活性研究[J]. 食品與機械, 2016, 32(10): 140-144.

[15] 邵金華, 馬永強, 何福林, 等. 虎舌紅多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評價[J]. 食品與機械, 2016, 32(12): 166-169, 195.

The Study on the Ultrasonic-Assisted Aqueous Two-Phase Extraction on Flavonoids ofValerianaofficinalisL. and Antioxidant Activity

WUDe-zhi1

ZHENGQiang1

LIAn1

WANGYu-yu1

WUDi-yao2

(1.GuizhouInstituteofTechnology,Guiyang,Guizhou550003,China;2.JiangxiUniversityofTraditonalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330004,China)

Flavonoids inValerianaofficinalisL. extracted by ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction was utilized in this study. Effects of ultrasonic time, amount of (NH4)2SO4, ultrasonic temperature and liquid-solid ratio were studied by the single factor methodologies, and then the extraction parameters were determined by Box-Behnken response surface methodology. In addition, reducing power, DPPH radical scavenging and hydroxyl radical scavenging activity were compared to investigate the antioxidant effect of flavonoids by reflux extraction. The results showed that optimized extraction parameters were ultrasonic time 35 min, amount of (NH4)2SO40.20 g/mL, ultrasonic temperature 51 ℃ and liquid-solid ratio 24∶1 (mL/g). Flavonoids yield of (6.37±0.08) % was obtained under such conditions. The extracted flavonoids showed strong reducing ability, DPPH and hydroxyl radicals scavenging activities. Moreover, the antioxidant effected by ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction was much higher than those of reflux extraction.

ValerianaofficinalisL.; total flavonoids; ultrasonic wave; aqueous two-phase; antioxidant activity

貴州省教育廳青年成長項目(編號：黔教合KY字[2016]233)；貴州理工學(xué)院博士啟動基金(編號：XJGC20161218)；江西省中醫(yī)藥科研計劃(編號：2016A020)

吳德智(1983—)，男，貴州理工學(xué)院副教授，博士。 E-mail:18970080479@163.com

2017—02—13

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.033