大孔樹脂吸附純化黔產(chǎn)龍膽草多糖工藝優(yōu)化

宮江寧

饒 玉

楊義菊

陳 飛

(貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

大孔樹脂吸附純化黔產(chǎn)龍膽草多糖工藝優(yōu)化

宮江寧

饒 玉

楊義菊

陳 飛

(貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

采用硫酸—苯酚法測(cè)定多糖的含量，研究FL-3樹脂對(duì)龍膽多糖的吸附和洗脫效果。以多糖的吸附率和解吸量為指標(biāo),對(duì)FL-3樹脂純化龍膽多糖的工藝條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，F(xiàn)L-3樹脂對(duì)龍膽多糖的吸附和洗脫能力較好,最佳工藝條件為：上樣濃度5 mg/mL、上樣流速2 BV/h、上樣量4 BV、 洗脫流速2 BV/h、用30%乙醇溶液200 mL集中洗脫。經(jīng)過(guò)純化后多糖的顏色變淺，多糖的含量從26.42%提高到71.29%，多糖回收率為49.52%。

龍膽草；多糖；純化；FL-3樹脂

龍膽草(GentianascabraBge)，又名地膽草﹑龍膽﹑草龍膽，藥用部分為龍膽科龍膽屬植物龍膽干燥的根和莖，是一種常用的中草藥。龍膽草在中國(guó)產(chǎn)地分布較廣，主要分布在貴州﹑云南﹑四川等地。黔產(chǎn)龍膽草主要分布在六枝，為黔西北道地藥材。龍膽草具有清熱燥濕﹑清肝瀉膽的作用[1]，有著廣泛的用途，如中成藥“龍膽瀉肝丸”就是以龍膽草為主要原料制成的[2]。研究發(fā)現(xiàn)龍膽湯對(duì)病毒性腦炎[3]、肝膽濕熱型帶狀皰疹[4]、突發(fā)性耳聾[5]、濕熱型帶下病[6]、單純皰疹性角膜炎的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[7]、面癱[8]、宮頸炎合并Hpv[9]感染等疾病均有一定的療效。多糖為龍膽的有效成分之一[10-11]，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍膽多糖有明顯的生理活性，具有抗腫瘤[12]﹑抗氧化[1]﹑抗凝血[13]﹑保肝﹑降血脂﹑調(diào)節(jié)免疫力[14]等作用，因此對(duì)龍膽草多糖的研究有一定的意義。

目前對(duì)龍膽多糖的研究主要是提取工藝，對(duì)龍膽多糖純化的研究較少。常見的分離純化方法是DEAE瓊脂糖凝膠法[15]﹑DEAE-cellulose DE-52離子交換層析法等[16]。但這些方法成本較高，價(jià)格昂貴。大孔樹脂法作為一種常見的分離純化的方法，因其具有吸附量較大、吸附速率快、價(jià)格便宜、可再生等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離和純化[17]。本試驗(yàn)擬以黔產(chǎn)龍膽草為原料，提取龍膽多糖，并研究FL-3樹脂對(duì)龍膽多糖的吸附和洗脫，確定最佳純化的工藝條件，以期為龍膽多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和進(jìn)一步的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍膽草：購(gòu)于貴州濟(jì)仁堂，產(chǎn)地為貴州六枝；

FL-3樹脂：鄭州勤實(shí)科技有限公司；

試驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

干燥箱：101-1A型，天津泰斯特公司；

電子天平：A 200S型，德國(guó)科恩公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-IIIA型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；

分光光度計(jì)：U V 2300型，上海天美科學(xué)儀器公司；

植物粉碎機(jī)：FZ 102型，天津市泰斯特公司。

1.3 方法

1.3.1 龍膽粗多糖的提取 參照文獻(xiàn)[18]，將龍膽草清洗﹑干燥并粉碎，按照料液比1∶30 (g/mL)加入蒸餾水，在80 ℃熱水中浸提2 h，離心(4 000 r/min)取上清液，將上清液80 ℃減壓濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，抽濾，依次用丙酮﹑無(wú)水乙醇洗滌沉淀，自然風(fēng)干，得到龍膽草粗多糖。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[19～20]，將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105 ℃干燥至恒重，準(zhǔn)確配制100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取100 μg/mL葡萄糖溶液0.00，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL，分別置于7支比色管中，補(bǔ)水至1 mL，再加入5%的苯酚2.00 mL，混合均勻后迅速加入濃硫酸7.00 mL，搖勻后靜置10 min，放入沸水浴中20 min，冷至室溫，在490 nm下測(cè)吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.050 2x+0.023 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，在0～10 μg/mL范圍內(nèi)，濃度和吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of glucose

1.3.3 FL-3樹脂的預(yù)處理 向FL-3樹脂中加入3倍體積的95%乙醇，浸泡24 h，再用蒸餾水洗滌樹脂至無(wú)乙醇味后，加入4%的NaOH浸泡2 h，用蒸餾水洗滌至中性，再用4%的HCl浸泡2 h，用蒸餾水洗滌至中性，并用蒸餾水浸泡以備用[21]。

1.3.4 上樣濃度對(duì)FL-3樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響 將已處理好的FL-3樹脂等體積(30 cm3)分別裝入5根規(guī)格一樣的層析柱中，配制濃度分別2.000 0，3.000 0，4.000 0，5.000 0，6.000 0 mg/mL的多糖溶液各50 mL，以2 BV/h的流速分別上樣。充分吸附后收集流出液，測(cè)定流出液中多糖的含量，按式(1)計(jì)算吸附率[22]。

(1)

式中：

R1——吸附率，%；

c0——進(jìn)樣液中多糖的濃度，mg/mL；

V0——進(jìn)樣液的體積，mL；

c1——流出液中多糖的濃度，mg/mL；

V1——流出液的體積，mL。

1.3.5 上樣流速對(duì)FL-3樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響 取5份濃度為5.138 0 mg/mL的多糖溶液，上樣量均為2 BV，分別以1，2，3，4，5 BV/h的流速通過(guò)裝有30 cm3FL-3樹脂的層析柱，充分吸附后收集流出液，測(cè)定流出液中多糖的含量，并計(jì)算吸附率。

1.3.6 上樣量對(duì)FL-3樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響 配制5.445 0 mg/mL的多糖溶液，以2 BV/h的流速上樣，總上樣量為9 BV(270 mL)，并分別在上樣量為1，2，3，4，5，6，7，8，9 BV時(shí)測(cè)流出液中多糖的含量，并計(jì)算吸附率。

1.3.7 洗脫液濃度對(duì)洗脫效果的影響 將濃度為6.000 0 mg/mL的龍膽多糖溶液100 mL以2 BV/h的流速通過(guò)裝有30 cm3FL-3樹脂的層析柱，待吸附充分后，排凈樹脂間隙中的多糖溶液，再依次加入100 mL去離子水及10%，30%，50%，70%，90%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為2 BV/h，且每25 mL收集一次洗脫液。測(cè)定每瓶洗脫液中多糖的含量，并以瓶子編號(hào)為橫坐標(biāo)，多糖含量為縱坐標(biāo)做圖。按式(2)計(jì)算洗脫量。

Q=c3×V3，

(2)

式中：

Q——洗脫量，μg；

c3——洗脫液中多糖的濃度，μg/mL；

V3——洗脫液的體積，mL。

1.3.8 洗脫液用量對(duì)洗脫效果的影響 將50 mL濃度為5.000 0 mg/mL的龍膽多糖溶液以2 BV/h的流速通過(guò)層析柱，吸附充分后，先用蒸餾水將樹脂顆粒之間的間隙液沖走，再用30%乙醇溶液對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2 BV/h，前100 mL流出液每隔5 mL檢測(cè)一次多糖含量，后400 mL每隔25 mL檢測(cè)一次流出液中多糖的含量，并以累積洗脫體積和多糖的含量為坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.9 洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響 取5份濃度為5.340 0 mg/mL的多糖溶液，上樣量均為2 BV，均以1 BV/h的流速通過(guò)裝有30 cm3FL-3樹脂的層析柱，充分吸附后，用少量的蒸餾水洗滌樹脂，再用200 mL 30%的乙醇分別以1，2，3，4，5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，并測(cè)定流出液中多糖的含量。

1.3.10 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確配制0.01 g/mL的粗多糖溶液再?gòu)闹幸迫?.5 mL定容至100 mL，取1 mL稀釋液按照1.3.2的方法測(cè)吸光度，并按式(3)計(jì)算粗多糖的純度。

(3)

式中：

M——多糖純度，%；

C——稀釋后溶液的多糖濃度，μg/mL；

N——稀釋倍數(shù)；

V——多糖樣品液的總體積，mL；

W——粗多糖質(zhì)量，g。

準(zhǔn)確配制一定濃度的粗多糖溶液,以最佳的上樣流速通過(guò)樹脂柱，待充分吸附后，用200 mL的30%乙醇以2 BV/h的洗脫流速洗脫，并將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，測(cè)凍干多糖的純度，并按式(4)計(jì)算多糖回收率。

(4)

式中：

G——多糖回收率，%；

m1——提純多糖的質(zhì)量，mg；

m2——粗多糖的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的提取

按上述提取方法得到的龍膽草粗多糖為深棕色顆粒狀的固體，味道清香，在水中溶解效果較好，產(chǎn)率為4.5%。

2.2 上樣濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

由圖2可知，上樣濃度對(duì)龍膽草多糖吸附率的影響較大，吸附率隨著上樣濃度的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)，上樣濃度為5 mg/mL時(shí)吸附率最大。所以最佳上樣濃度為5 mg/mL，此時(shí)吸附率為85.57%。

圖2 上樣濃度對(duì)多糖吸附率的影響Figure 2 The effect of the concentration of polysaccharides on the absorption rate

2.3 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

由圖3可知，上樣流速越大，多糖的吸附率越小。如果多糖溶液上樣流速過(guò)快，多糖還沒來(lái)得及被樹脂吸附，就已經(jīng)流出層析柱，會(huì)使吸附率減少；而如果流速較慢時(shí)，溶液中的多糖可以和樹脂充分接觸，吸附率較高，但如果流速過(guò)慢，會(huì)使過(guò)柱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。由圖3可知，當(dāng)流速為1 BV/h時(shí)，多糖的吸附率最高，但速率過(guò)慢，而2 BV/h的吸附率與其相差不大，所以選擇2 BV/h的上樣流速較為合適。

2.4 上樣量對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

由圖4可知，隨著上樣量的增大，多糖吸附率隨之降低，當(dāng)上樣量>4 BV后，吸附率趨于穩(wěn)定。說(shuō)明上樣量到了一定程度，樹脂對(duì)多糖的吸附會(huì)達(dá)到飽和。雖然當(dāng)上樣量為1 BV時(shí)，吸附率最高，但樹脂對(duì)多糖的吸附量較少(僅151.229 mg);而當(dāng)上樣量為4 BV時(shí)，吸附率較低，但樹脂對(duì)多糖的吸附量較高(326.700 mg)。所以選4 BV為上樣量較為合適。

圖3 上樣流速對(duì)多糖吸附率的影響Figure 3 The effect of velocity on adsorption rate of polysaccharides

圖4 上樣量對(duì)多糖吸附率的影響Figure 4 The effect of sample size on adsorption rate of polysaccharide

2.5 洗脫液濃度的確定

由圖5可知，龍膽多糖的洗脫量主要集中在蒸餾水﹑10%乙醇和30%乙醇洗脫部分，其中最大洗脫峰出現(xiàn)在30%乙醇洗脫部分，30%乙醇部分的總洗脫量也最大且乙醇濃度升高，洗脫量變小。因此選擇用30%乙醇做洗脫液。

1～4號(hào)為水洗脫液；5～8號(hào)為10%乙醇洗脫液；9～12號(hào)為30%乙醇洗脫液；13～16號(hào)為50%乙醇洗脫液；17～20號(hào)為70%乙醇洗脫液；21～24為90%乙醇洗脫液

圖5 乙醇濃度對(duì)多糖洗脫量的影響

Figure 5 Different concentrations of ethanol elution volume

curve of polysaccharide

2.6 洗脫液用量的確定

由圖6可知，多糖的洗脫量主要集中在前200 mL的洗脫液中，當(dāng)洗脫液的體積超過(guò)200 mL，再用30%乙醇繼續(xù)洗脫，多糖的量增加得很少，可以忽略，因此從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，洗脫液的用量為200 mL時(shí)最佳。

2.7 洗脫流速的確定

由圖7可知，當(dāng)洗脫量相同時(shí)，洗脫流速對(duì)洗脫量有一定的影響，流速加快，洗脫量減少，當(dāng)流速為1 BV/h時(shí)，洗脫效果最好，但如果流速過(guò)慢，會(huì)使時(shí)間成本提高，考慮到洗脫流速為1 BV/h時(shí)，洗脫量與流速為2 BV/h時(shí)的洗脫量相差不大，所以選擇的合適的洗脫流速為2 BV/h。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)測(cè)得提取的粗多糖純度為26.42%，經(jīng)過(guò)樹脂純化后，多糖的純度提高到了71.29%，多糖回收率為49.52%。說(shuō)明FL-3樹脂對(duì)龍膽多糖純化的效果較好。純化前的粗多糖顏色為深棕色，經(jīng)過(guò)樹脂純化后，顏色變淺，為淺黃色的粉末，說(shuō)明FL-3樹脂對(duì)多糖中的色素也具有一定的吸附和脫色功能。

圖6 洗脫液用量的考察曲線圖Figure 6 The dosage of eluent graph

圖7 洗脫流速對(duì)多糖洗脫量的影響Figure 7 The effect of elution flow rate on the elution of polysaccharide

3 結(jié)論

(1) 本試驗(yàn)利用FL-3樹脂對(duì)龍膽草多糖進(jìn)行提純，該樹脂對(duì)龍膽草多糖具有較好的分離純化效果，提純后多糖的顏色變淺，純度也從26.42%提高到了71.29%，多糖回收率為49.52%。

(2) 通過(guò)對(duì)FL-3樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)工藝參數(shù)研究，得出最佳的純化工藝條件為:上樣濃度5 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣量4 BV，用200 mL 30%乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h。

(3) 本試驗(yàn)僅對(duì)FL-3樹脂純化龍膽多糖的工藝進(jìn)行研究，今后還應(yīng)該進(jìn)一步深入研究如何提高龍膽的純度。此外，用該工藝純化后是否會(huì)影響其生物活性尚未可知，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中可對(duì)提純前后多糖的抗氧化和抑菌活性進(jìn)行深入研究。

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Optimization on adsorption and purification process for gentian polysaccharide in Guizhou by macroporous resin

GONGJiang-ning

RAOYu

YANGYi-ju

CHENFei

(SchoolofChemistryandMaterialScience,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

The content of polysaccharide was determined by phenol sulfuric acid method. The research investigated FL-3 resin on the adsorption and desorption effect ofGentianascabraBungepolysaccharide. FL-3 resin was used to purify the polysaccharide. Using the adsorption rate and desorption amount of polysaccharide as the index, the FL-3 resin purification process of polysaccharide was studied. The optimum conditions for the adsorption and resolution of polysaccharide by FL-3 resin were obtained. The experimental results showed that the polysaccharide can be effectively adsorbed and desorbed by the FL-3 resin. The optimum purification conditions were as follows: the sample concentration was 5 mg/mL, the sample flow rate was 2 BV/h, the sample volume was 4 BV, the elution flow rate was about 2 BV/h, and the concentration of ethanol solution was 30%，the elution volume was 200 mL. After purification, the color of polysaccharide become shallow, and the content of that was increased from 26.42% to 71.29%.The recovery rate of polysaccharide was 49.52%.

GentianascabraBunge; Polysaccharide; Purification; FL-3 macroporous resin

貴州省科技廳2012年度貴州省科技廳與貴州師范大學(xué)聯(lián)合基金計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：黔科合J字LKS[2012]17號(hào))

宮江寧(1979—)，女，貴州師范大學(xué)副教授，碩士。 E-mail:9121555@qq.com

2017—03—12

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.036